張 新，向 俊，唐文杰，康紹英，胡小軍

（1.食品安全監(jiān)測與預(yù)警湖南省重點實驗室，湖南長沙 410007；2.湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗研究院,湖南長沙 410007）

膠原蛋白為細胞外基質(zhì)的重要成分，具有良好的延伸性能[1]，主要歸結(jié)于其含有一個或者多個由α-鏈組成的三螺旋結(jié)構(gòu)，同時還含有少量的葡萄糖和半乳糖。膠原蛋白在皮膚組織細胞中主要承擔儲水功能，保持皮膚的細嫩度，柔軟度及彈性度的生理功能[2-4]。近幾年，隨著人們生活品質(zhì)的提高和對健康的重視，富含膠原蛋白的肉制品越來越受到大家的青睞。在肉制品中加入亞硝酸鹽可以起到護色及防腐作用，但亞硝酸鹽可與血紅蛋白結(jié)合，生成高鐵血紅蛋白，使紅細胞運輸氧的能力減弱，對人體造成危害，因此肉制品中亞硝酸鹽含量是每年國家抽檢的重點檢測項目，成人亞硝酸鹽中毒的劑量為0.3～0.5 g，亞硝酸鹽攝入量超過3.0 g會產(chǎn)生嚴重的致死風險[5]。GB 2762—2017 規(guī)定，肉制品中亞硝酸鹽的限量值為30 mg/kg。有研究表明，長期過量食用富含亞硝酸鹽的食品可能誘發(fā)高鐵血紅蛋白癥，同時還會增加患癌癥 風險[6-9]。

目前亞硝酸鹽的檢測國家標準為GB 5009.33—2016，標準規(guī)定，樣品進行前處理時需要進行加熱，此時富含膠原蛋白的肉制品往往會出現(xiàn)溶液混濁、難以過濾、實驗回收率低等現(xiàn)象。因此，很有必要對該類產(chǎn)品亞硝酸鹽的測定方法進行改進。邵明華[10]通過先定性篩選，再定量檢測的方法對國標法進行了改進，能一定程度上減少檢驗時間，提高檢驗員工作效率，但是該方法容易出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象，導(dǎo)致漏檢事故發(fā)生；同時樣品本身顏色較深時對定性結(jié)果也存在一定干擾。木瓜蛋白酶屬于一種半胱氨酸蛋白水解酶，具有良好的穩(wěn)定性和很強的蛋白水解能力，可以從番木瓜及其根莖中提取得到。它可以通過切割氨基酸的肽鍵的方式改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，對蛋白質(zhì)進行水解，從而有效降低蛋白質(zhì)的分子量[11-14]。本方法利用木瓜蛋白酶對膠原蛋白良好的分解作用，對膠原蛋白進行分解處理，從而有效解決該類產(chǎn)品亞硝酸鹽測定過程中存在的 難題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5種富含膠原蛋白的不同食品：樣A為香辣豬腳；樣B為鹵雞爪；樣C為臘豬臉；樣D為鹵鴨掌；樣E為五香豬皮，以上樣品均為市場上購買。

木瓜蛋白酶（酶活力≥3700 U/g）、硼酸鈉、亞鐵氰化鉀、鹽酸、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸、乙酸鋅和亞硝酸鹽標準液。所用試劑均為分析純，所用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

萬分之一電子分析天平，奧豪斯儀器有限公司；DZKW-4電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；紫外可見光分光光度計（T9CS），北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

準確稱取5 g均勻試樣于錐形瓶中，再加入0.1 g木瓜蛋白酶，同時加12.5 mL 50 g/L飽和硼砂溶液，加入大約150 mL、70 ℃左右的超純水，手動搖勻后放置沸水浴中加熱15 min。取出冷卻至室溫，將樣液全部轉(zhuǎn)移到200 mL容量瓶中，分別加入5 mL 106 g/L亞鐵氰化鉀溶液和5 mL 220 g/L乙酸鋅溶液，最后用超純水定容。靜置30 min后用濾紙過濾，初濾液30 mL棄去不用，后面濾液備用。同時按照 GB 5009.33—2016準確稱取5 g均勻試樣于錐形瓶中，加12.5 mL 50 g/L飽和硼砂溶液，加大約150 mL、 70 ℃左右的超純水，混勻，于沸水中加熱15 min，取出置冷水浴中冷卻，并放置至室溫。定量轉(zhuǎn)移上述提取液至200 mL容量瓶中，加入5 mL 106 g/L亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入5 mL 220 g/L乙酸鋅溶液。加水至刻度，搖勻，放置30 min后用濾紙過濾，棄去初濾液30 mL，濾液備用。相較于國標法，本法前處理加入了木瓜蛋白酶對樣品中膠原蛋白進行 酶解。

1.3.2 亞硝酸鹽的測定

于50 mL具塞比色管中準確吸取40.0 mL前處理好的濾液，同時另外準確吸取相當于0 μg、1.0 μg、 2.0 μg、3.0 μg、4.0 μg、5.0 μg、7.5 μg、10.0 μg和12.5 μg的亞硝酸鈉標準使用液，分別置于50 mL具塞比色管中。將2 mL 4 g/L對氨基苯磺酸溶液分別加入標準管與試樣管中，混勻，靜置5 min后各加入1 mL 2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液。定容搖勻，靜置 15 min。在波長538 nm處用1 cm比色杯測量標準液和樣液的吸光度，通過繪制標準曲線比較得到樣液濃度。同時做試劑空白。

2 結(jié)果與分析

2.1 本方法與國標法前處理樣液吸光度對比

對樣A、樣B、樣C、樣D和樣E分別按國標GB 5009.33—2016和本方法進行前處理。將處理的樣液于波長538 nm處測吸光度，所測結(jié)果如表1所示。本方法處理的樣液吸光度明顯小于國標法處理的樣液，國標法處理的樣液混濁，而本方法處理的樣液明顯澄清透明，其原因在于富含膠原蛋白樣品受熱再冷卻溶液發(fā)生團聚，造成樣液混濁，從而導(dǎo)致吸光度偏高，給后期亞硝酸鹽的測定造成偏高的影響。而本方法加入木瓜蛋白酶后膠原蛋白被酶解，樣液變得澄清，便于樣液亞硝酸鹽的測定，有利于實驗準確度的提高。

表1 本方法與國標法前處理樣液吸光度比較

2.2 本方法與國標法加標回收率對比

分別稱取5 g樣A、樣B、樣C、樣D和樣E， 同時用本方法和國標法分別加入方法測定低限 （1 mg/kg）、2倍方法測定低限、10倍方法測定低限的亞硝酸鈉標準物質(zhì)，進行加標回收實驗，做6次平行實驗，取平均值，其結(jié)果見表2。

由表2可知，本方法加標回收率在93.6%～97.8%， 具有良好的準確度。同時，本方法回收率明顯較國標法好，其原因在于國標法前處理時富含膠原蛋白的樣品會出現(xiàn)團聚包覆，不利于亞硝酸鹽的有效提取，造成加標回收率明顯偏低。本方法通過加入木瓜蛋白酶對樣品進行酶解，避免了團聚的發(fā)生，使得樣品澄清透明，便于提取，回收率及準確度得到有效提升。

表2 本方法與國標法加標回收率對比

2.3 精密度實驗

分別稱取5.0000 g樣A、樣B、樣C、樣D和樣E，采用本方法進行6次平行實驗，其結(jié)果如表3所示。經(jīng)過6次平行測定，實驗RSD在1.7%～4.1%，小于5.3%，滿足實驗技術(shù)要求，該方法具有良好的精密度。

表3 精密度實驗結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

本實驗改進了富含膠原蛋白肉制品亞硝酸鹽測定的前處理，通過木瓜蛋白酶的加入，水解膠原蛋白，有效地解決了該類產(chǎn)品樣液混濁，回收率低的檢測困擾。本方法加標回收率在93.6%～97.8%，相對標準偏差在1.7%～4.1%，小于5.3%，該方法可以有效提高該類產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量檢測的準確度。