陳 巖，張潤陽，蔡小雙，王祖斌，廖樹強(qiáng)，劉華敏

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南鄭州 450001）

中國是世界上油料需求最大的國家之一。近年來，中國油料產(chǎn)量雖連年遞增，但缺口始終很大，中國每年大豆凈進(jìn)口量約占全球總貿(mào)易量的2/3，對外進(jìn)口的依賴性非常大[1]?！坝蜕埂保–yperus esculentusL.）是油莎草的地下塊莖，具有耐鹽堿且含油量高（20%～36%）的特點(diǎn)，是集糧、油、牧、飼于一體的經(jīng)濟(jì)作物。其油脂中含有75%以上的不飽和脂肪酸，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，在油料行業(yè)應(yīng)用前景廣闊[2]。據(jù)報(bào)道，油莎豆具有降血糖、降血脂、保肝以及抗氧化等生理功能[3]。多糖作為油莎豆的主要成分之一，具有重要的生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗病毒等生物活性功能，具有較大的開發(fā)意義[4]。

一般在多糖的提取過程中，多糖中會混有大量色素，這些色素不僅會降低多糖的純度，也會對多糖的活性和結(jié)構(gòu)鑒定造成嚴(yán)重影響，因此脫色是對多糖深入研究中必不可少的步驟。多糖脫色的方法有很多，包括活性炭脫色、雙氧水脫色、大孔樹脂脫色等[5]。不同色素脫除的難易程度和最適合的脫除方法是不同的，因此本實(shí)驗(yàn)采用了多種脫色方法對油莎豆多糖進(jìn)行脫色，并對脫色前后的多糖保留率、抗氧化活性、降血糖活性等指標(biāo)進(jìn)行測定，對比得出最適宜的脫色方法。而有關(guān)不同脫色方法對油莎豆多糖活性的影響在文獻(xiàn)中未見報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)將為油莎豆多糖的深入研究和應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

油莎豆采購自河北滄州市場，油莎豆經(jīng)粉碎后過40目孔徑篩，索氏抽提后得脫脂油莎豆粉[6]；反式-1,2-環(huán)己二胺四乙酸、葡萄糖、濃硫酸、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、乙酸鈉、氯化鐵、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）及抗壞血酸等均為分析純；N,N-二甲基對苯二胺二鹽酸鹽（1,4-Amino-N,N-dimethylaniline,dihydrochloride，DMPD）采購于麥克林生化科技有限公司；透析袋（1000 Da），植物總酚（Total Phenols，TP）含量檢測試劑盒，活性炭粉（CAS:7440-44-0），對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），D900大孔弱堿性陰離子交換樹脂，AB-8弱極性大孔吸附樹脂，XAD-2非極性大孔吸附樹脂，HPD5000極性大孔吸附樹脂，D101非極性大孔吸附樹脂，糖化酶，采購于索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HL-2B數(shù)顯恒流泵，上海滬西分析儀器有限公司；BSZ-100數(shù)顯自動(dòng)收集器，上海滬西分析儀器有限公司；LGJ18C冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；UV-6000PC紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；1410101酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 油莎豆多糖的提取

提取過程根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]，將0.05 mol/L碳酸鈉溶液與脫脂油莎豆粉按照1∶15（mL∶g）的液料比混合，攪拌24 h后在4500 r/min的條件下離心20 min，收集上清液后使用6 mol/L鹽酸調(diào)其pH值至4.5，攪拌30 min，在4500 r/min的條件下離心 20 min，舍棄下層的蛋白質(zhì)沉淀，只收集上清液，將上清液抽濾，濾液調(diào)pH值至中性，真空旋蒸濃縮至原體積的1/10，加3倍95%乙醇，4 ℃醇沉3 h[8]。沉淀溶于適量水后用1000 Da的透析袋進(jìn)行流水透析，凍干得到油莎豆粗多糖。

1.3.2 油莎豆多糖的脫色

（1）活性炭脫色。配制1 mg/mL的多糖溶液，加入1%的活性炭，在40 ℃條件下慢速攪拌3 h[9]，冰水浴后在4800 r/min條件下離心30 min，取上清液在45 ℃條件下真空旋蒸濃縮，凍干即得活性炭脫色后的多糖。

（2）大孔樹脂脫色。先對樹脂進(jìn)行預(yù)處理[10]，然后裝柱。配制30 mg/mL的多糖溶液，分別用5種大孔樹脂進(jìn)行脫色，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為30 r/min，收集多糖溶液。在45 ℃條件下真空旋蒸濃縮，凍干后即得樹脂脫色后的多糖。

1.3.3 多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率的測定

以葡萄糖的濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]，采用苯酚硫酸法測定多糖含量，多糖保留率按式（1）計(jì)算。

式中：m1為脫色后得到的多糖質(zhì)量，mg；m2為脫色前的粗多糖質(zhì)量，mg。

蛋白質(zhì)含量的測定采用《出口乳、蛋、豆類食品中蛋白質(zhì)含量的測定 考馬斯亮藍(lán)法》（SN/T 3926—2014）考馬斯亮藍(lán)法，蛋白質(zhì)脫除率按式（2）計(jì)算。

1.3.4 色素去除率的測定

脫色前后的多糖配制成10 mg/mL的多糖溶液，利用紫外分光光度計(jì)，在470 nm處測定吸光度，色素去除率按式（3）計(jì)算[12]。

1.3.5 總酚含量的測定

使用植物總酚（Total Phenols，TP）含量檢測試劑盒進(jìn)行測定，先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定油莎豆多糖中總酚含量時(shí)取500 μL多糖溶液，加入2.5 mL檢測試劑盒中的提取液，超聲提取30 min后在4800 r/min的條件下離心10 min，取上清液，配制混合溶液，在760 nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

1.3.6 抗氧化活性的測定

（1）羥基自由基清除率的測定。分別取10 μL 0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、 3.0 mg/mL、4.0 mg/mL和5.0 mg/mL的多糖樣品溶液， 加入50 μL 1.8 mmol/L硫酸亞鐵溶液、50 μL 1.8 mmol/L 水楊酸乙醇溶液，再加入50 μL 0.3 %雙氧水啟動(dòng)反應(yīng)，鋁箔紙封蓋，在37 ℃烘箱反應(yīng)35 min，于510 nm處測定吸光度[12]。以蒸餾水代替多糖樣品溶液為空白，以蒸餾水代替雙氧水為對照。以維生素C作為陽性對照，按式（4）進(jìn)行計(jì)算。

（2）DPPH自由基清除率的測定。以無水乙醇為溶劑，配制0.1 mmol/L的DPPH溶液，取25 μL多糖溶液和50 μL 0.1 mmol/L DPPH溶液，避光反應(yīng) 30 min，于520 nm處測定吸光度。以無水乙醇代替多糖樣品溶液為空白，以無水乙醇代替DPPH溶液為對照[13]。以維生素C作為陽性對照，按式（5）進(jìn)行計(jì)算。

（3）DMPD自由基清除率的測定。將1 mL 0.05 mol/L DMPD溶液與100 mL 0.2 mol/L醋酸鹽緩沖液混合均勻，加入0.2 mL 0.05 mol/L FeCl3溶液啟動(dòng)反應(yīng)，制備成DMPD+溶液。取25 μL多糖溶液和 200 μL DMPD+溶 液，在 室 溫 下 反 應(yīng)10 min，于 510 nm處測定吸光度。以緩沖液代替多糖樣品溶液為空白，以緩沖液代替DMPD+溶液為對照[14]。以維生素C作為陽性對照，按式（6）進(jìn)行計(jì)算。

1.3.7 α-葡萄糖苷酶抑制率的測定

取5 μL多糖溶液、25 μL 500 U/mL α-葡萄糖苷酶、140 μL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）混合，在37 ℃烘箱內(nèi)反應(yīng)5 min，再加入25 μL 24 mmol/L PNPG溶液，在37 ℃烘箱內(nèi)反應(yīng)15 min，最后加入100 μL 0.2 mol/L Na2CO3終止液，于405 nm處測定吸光度。以蒸餾水代替樣品溶液為空白，以蒸餾水代替α-葡萄糖苷酶為對照[15]。按式（7）進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脫色方法對多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率的影響

在多糖的提取過程中，常會有大量色素溶出并混入多糖，為了避免這些色素對多糖成品色澤、穩(wěn)定性、功能性的影響，一般要進(jìn)行脫色處理，且脫色的重要原則是多糖保留率高、色素去除率高。如圖1所示，AB-8脫色后的多糖保留率最高（71.0%），D900脫色后的多糖保留率最低（11.3%）。這是因?yàn)椴捎玫拇罂讟渲瑯O性不同，D900是大孔弱堿性陰離子交換樹脂，其脫色后多糖保留率較低，這與D900的表面電特性和氫鍵相互作用有關(guān)[16]。AB-8是弱極性大孔吸附樹脂，它比非極性大孔吸附樹脂XAD-2和D101表現(xiàn)出更高的多糖保留率，可能是因?yàn)锳B-8在脫色過程中多糖溶液中的色素和蛋白質(zhì)易受到強(qiáng)偶極離子力的作用而被吸附，導(dǎo)致AB-8對多糖的吸附較少[17]。XAD-2是一種非極性的大網(wǎng)格樹脂，以二乙烯苯為骨架結(jié)構(gòu)，對于一些性質(zhì)相近的分子和多種環(huán)狀芳香族化合物有很強(qiáng)的吸附能力。與XAD-2類似，D101大孔吸附樹脂是苯乙烯型非極性共聚體，對于不帶極性的有機(jī)化合物有良好的吸附效果。但是二者孔徑相差很大，XAD-2的孔徑一般在0.9 μm左右，而D101的孔徑只有9～10 nm。因此，XAD-2的吸附量更大，導(dǎo)致多糖保留率低于D101。

圖1 不同脫色方法對油莎豆多糖保留率的影響

從天然產(chǎn)物中提取的多糖，常含有蛋白質(zhì)，給后續(xù)多糖的分析帶來困難，大孔樹脂和活性炭在對多糖脫色的過程中還可以脫除一定量的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)脫除率也是衡量脫色效果的重要指標(biāo)。脫色前油莎豆多糖中的蛋白質(zhì)含量為1.7%，如圖2所示，AB-8脫色后的多糖蛋白質(zhì)脫除率最高（91.1%），其次是XAD-2（88.5%），不同方法脫色后的多糖蛋白質(zhì)脫除率存在差異，這與樹脂的物理結(jié)構(gòu)和被吸附物質(zhì)的物理和化學(xué)特性有關(guān)[18]。D101和XAD-2都是非極性大孔吸附樹脂，而D101脫色后的多糖蛋白質(zhì)脫除率最低（21.4%），這是因?yàn)镈101比XAD-2的孔徑小，導(dǎo)致D101對蛋白質(zhì)的吸附量少，因此蛋白質(zhì)脫除率較低?；钚蕴恳话惚徽J(rèn)為具有良好的脫色能力，在本研究中活性炭對多糖中的蛋白質(zhì)也有一定的脫除效果，可能因?yàn)槎嗵侵杏幸徊糠稚睾偷鞍踪|(zhì)以結(jié)合狀態(tài)存在，活性炭在吸附色素的同時(shí)脫除了部分蛋白質(zhì)[19]。

圖2 不同脫色方法對油莎豆多糖中蛋白質(zhì)脫除率的影響

2.2 不同脫色方法對多糖色素去除率的影響

如圖3所示，活性炭脫色后的多糖色素去除率最高（84.5%），其次是AB-8（75.2%），而HPD5000 脫色后的多糖色素去除率最低（60.1%）。活性炭具有較高的色素去除率，可能是由于其表面的碳原子是不飽和碳，它能與其他的原子或基團(tuán)結(jié)合形成大量的化學(xué)基團(tuán)，比如羥基、羧基、酯基、羰基和氨基等，因此多糖中的色素容易被活性炭吸附，此外，活性炭因立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而具有較大的比表面積，這也有利于它對色素的吸附作用[20-21]。AB-8是弱極性大孔吸附樹脂，多糖中的色素可能大多數(shù)為弱極性色素，易被AB-8吸附，導(dǎo)致AB-8脫色后的多糖色素去除率高。

圖3 不同脫色方法對油莎豆多糖色素去除率的影響

同時(shí)對脫色前后10 mg/mL的油莎豆多糖溶液進(jìn)行全波長掃描，如圖4所示，脫色后的多糖溶液最大吸收波長均小于脫色前（354 nm），這可能是因?yàn)槊撋^程中多糖、蛋白質(zhì)、色素、酚類物質(zhì)等被不同程度地吸附脫除，導(dǎo)致脫色后的最大吸收波長減小?；钚蕴亢虳101、HPD5000脫色后的多糖溶液最大吸收波長分別為233 nm、243 nm、237 nm，與脫色前的相差較大，可能因?yàn)檫@些方法脫色后多糖中的酮類或酚類物質(zhì)損失較多[22]，導(dǎo)致最大吸收波長與脫色前的存在較大差別。此外，除了活性炭，脫色前后的多糖溶液在200～400 nm存在兩個(gè)吸收峰，而活性炭只在233 nm存在最大吸收峰，這可能是因?yàn)槎嗵侵械纳匚辗逶?45 nm左右，而活性炭脫色后的多糖色素去除率較高，導(dǎo)致脫色后的多糖溶液在345 nm左右未出峰。

圖4 脫色前后油莎豆多糖溶液的全波長掃描

2.3 不同脫色方法對多糖中總酚含量的影響

酚類物質(zhì)大多具有抗氧化、抗癌、抗逆等作用[23]。如圖5所示，脫色后的油莎豆多糖中總酚含量低于脫色前，其中D900脫色后的多糖總酚含量損失最少，XAD-2脫色后的多糖總酚含量損失較多，XAD-2是非極性大孔吸附樹脂，可能因?yàn)槎嗵侵械姆宇愇镔|(zhì)大多為非極性，XAD-2對其有較強(qiáng)的吸附作用，導(dǎo)致脫色后酚類物質(zhì)損失較多。與多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率的情況相似，同樣也是非極性大孔吸附樹脂的D101由于孔徑較小，對酚類物質(zhì)的吸附量比XAD-2少，導(dǎo)致總酚含量大于XAD-2。同時(shí)，因?yàn)榛钚蕴繉︳驶?、羧基、?nèi)酯基、酚羥基等有一定的吸附作用[24]，導(dǎo)致活性炭脫色后的多糖酚類物質(zhì)損失較多。此外，與靖邊黑豆的總酚含量（5.1 mg/g）[25]、灰棗的總酚含量（8.8 mg/g）[26]相比，脫色前的油莎豆多糖中總酚含量較高（10.6 mg/g），表明油莎豆多糖具有一定營養(yǎng)價(jià)值和生物活性。

圖5 不同脫色方法對油莎豆多糖中總酚含量的影響

2.4 不同脫色方法對多糖的羥基自由基清除率的影響

過量的羥基自由基是造成生物有機(jī)體氧化損傷的原因之一，并能對人體造成一定程度的危害[27]。如圖6所示，隨著油莎豆多糖濃度的增加，羥基自由基清除率也不斷增加。脫色后多糖的羥基自由基清除率總體上大于脫色前，這是脫色后多糖得到了純化和富集所導(dǎo)致的，同時(shí)也說明了油莎豆多糖比其所含有的色素有更強(qiáng)的羥基自由基清除率[28]。多糖濃度為5 mg/mL時(shí)，活性炭脫色后的多糖羥基自由基清除率為99.6%，這可能是因?yàn)榛钚蕴棵撋蟮亩嗵巧厝コ首罡?，多糖暴露出了更多的活性位點(diǎn)[12]，使其對羥基自由基有良好的清除效果。相對于其他的脫色方法，D900脫色后的多糖羥基自由基清除率較低，這是因?yàn)镈900脫色后的多糖保留率低，較多的多糖被D900吸附，導(dǎo)致脫色后的多糖對羥基自由基的清除效果較差。D101和XAD-2都是非極性大孔吸附樹脂，且D101脫色后的多糖保留率大于XAD-2，但當(dāng)多糖濃度為0.5～4.0 mg/mL時(shí)，D101脫色后的多糖羥基自由基清除率小于XAD-2，這可能和脫色后的多糖純度及其空間構(gòu)象等有關(guān)[29]。此外，在測定范圍內(nèi)，脫色前后的油莎豆多糖清除羥基自由基的能力大于維生素C，表明其具有較強(qiáng)的清除羥基自由基的能力。

圖6 不同脫色方法對油莎豆多糖清除羥基自由基能力的影響

2.5 不同脫色方法對多糖的DPPH自由基清除率的影響

如圖7所示，隨著油莎豆多糖濃度的增加，DPPH自由基清除率也不斷增加。脫色后多糖的DPPH自由基清除率明顯小于脫色前，這可能是脫色前的粗多糖和色素、蛋白質(zhì)、酚等物質(zhì)的共同作用[30]，使得DPPH自由基清除率較高，而脫色后這些物質(zhì)減少，DPPH自由基清除率也減小。多糖濃度為 5 mg/mL時(shí)，AB-8脫色后的多糖DPPH自由基清除率較大（84.1%），這可能是因?yàn)锳B-8脫色后的多糖保留率高，活性基團(tuán)損失少，使它對DPPH自由基的清除效果比其他脫色方法更好。HPD5000脫色后的多糖保留率僅次于AB-8，但HPD5000脫色后多糖的DPPH自由基清除率最?。?2.6%），可能因?yàn)槠涿撋蟮亩嗵强偡雍枯^少，而酚類物質(zhì)有較強(qiáng)的抗氧化活性[23]。此外，脫色前的油莎豆多糖濃度在3～5 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率和維生素C相當(dāng)，表明脫色前的油莎豆多糖具有良好的DPPH自由基清除能力。

圖7 不同脫色方法對油莎豆多糖清除DPPH自由基能力的影響

2.6 不同脫色方法對多糖DMPD自由基清除率的影響

如圖8所示，隨著油莎豆多糖濃度的增加，DMPD自由基清除率也不斷增加。除D900外，其他方法脫色后多糖的DMPD自由基清除率總體大于脫色前，與油莎豆多糖對羥基自由基的清除率類似，這可能是脫色后多糖得到了純化和富集的結(jié)果[28]。多糖濃度為5 mg/mL時(shí)，活性炭脫色后的多糖DMPD自由基清除率最大（81.3%），D900脫色后的多糖DMPD自由基清除率最?。?5.5%），不同方法脫色后的多糖DMPD自由基清除率存在一定差異，這和多糖的組成和結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系，其因素包括單糖組成、糖苷鍵種類、糖醛酸的含量等[31]。在測定的濃度范圍內(nèi)，D900脫色后的多糖DMPD自由基清除率始終最小，這是因?yàn)镈900脫色后的多糖保留率較低，脫色過程中有較多的多糖損失，損失的多糖可能具有較強(qiáng)的DMPD自由基清除率[30]。脫色后的多糖濃度為5 mg/mL時(shí)，DMPD自由基清除率最大為81.3%，對DMPD自由基有良好的清除 效果。

圖8 不同脫色方法對油莎豆多糖清除DMPD自由基能力的影響

2.7 不同脫色方法對多糖的α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

α-葡萄糖苷酶抑制劑可延緩或者抑制葡萄糖在腸道內(nèi)的吸收，是治療糖尿病的理想物質(zhì)[32]。如圖9所示，隨著油莎豆多糖濃度的增加，α-葡萄糖苷酶抑制率增長緩慢。除XAD-2外，脫色后多糖的α-葡萄苷糖酶抑制率總體小于脫色前，在測定的濃度范圍內(nèi)，XAD-2脫色后的多糖α-葡萄糖苷酶抑制率最大，可能因?yàn)閄AD-2脫色后多糖中與α-葡萄糖苷酶的作用位點(diǎn)暴露出來，兩者通過相互作用結(jié)合形成了復(fù)合物，同時(shí)α-葡萄糖苷酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，使多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用變得容易[31]。除XAD-2外，其他方法脫色后的多糖α-葡萄糖苷酶抑制率較小，這可能是因?yàn)槊撋蠖嗵侵械狞S酮類物質(zhì)減少，而這類物質(zhì)可以通過非共價(jià)作用和蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，脫色前多糖中的黃酮類物質(zhì)含量相對較多，容易通過非共價(jià)作用和α-葡萄糖苷酶結(jié)合抑制酶的活性[33]。

圖9 不同脫色方法對油莎豆多糖抑制α-葡萄糖苷酶的影響

3 結(jié)論

本研究在提取油莎豆多糖后，選用6種不同的方法進(jìn)行脫色，比較脫色效果、脫色前后多糖的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制率。結(jié)果表明，AB-8綜合效果最佳，脫色后多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率分別為71.0%、91.1%，色素去除率為75.2%，總酚含量為8.5 mg/mL，多糖濃度為5 mg/mL時(shí)，羥基自由基清除率、DPPH自由基清除率和DMPD自由基清除率分別為99.6%、84.1%、73.3%，α-葡萄糖苷酶抑制率為42.2%。脫色前后的油莎豆多糖具有一定的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制力，且隨著多糖濃度的增加清除率和抑制力也不斷增加，其中脫色后的多糖羥基自由基清除率和DMPD自由基清除率大于脫色前，而DPPH自由基清除率和α-葡萄糖苷酶抑制率總體上小于脫色前。此外，油莎豆多糖清除羥基自由基的能力較強(qiáng)，并且總酚含量較高，表明油莎豆多糖在未來有望作為天然的抗氧化劑應(yīng)用于食品和醫(yī)療行業(yè)，具有廣闊的應(yīng)用前景。