任晉東，陳紅林，牛寶龍，詹煒，樓寶

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水生生物研究所，浙江 杭州 310021）

羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）是長臂蝦科、沼蝦屬動物，具有生長速度快、養(yǎng)殖存活率高、抗病力強和廣泛的環(huán)境適應(yīng)性等特點。原產(chǎn)于印度太平洋地區(qū)，生活在各種類型的淡水或咸淡水水域。20世紀60年代以來，先后移養(yǎng)于亞洲、歐洲、美洲等一些國家和地區(qū)，是全世界養(yǎng)殖量最大的淡水養(yǎng)殖蝦類品種。1976年自日本引進我國，主要在南方10多個?。ㄊ小^(qū)）推廣養(yǎng)殖，是我國重要的淡水養(yǎng)殖蝦類引進品種。2020年，我國羅氏沼蝦產(chǎn)量達14萬t，超全球羅氏沼蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量的一半以上，且連續(xù)20年位列世界第一，但與以色列等國相比，我國每667 m均產(chǎn)仍相差100 kg以上。與其他甲殼類動物類似，羅氏沼蝦也具有性別兩態(tài)性，同齡雌、雄蝦個體的大小、生長速度懸殊，單性化培育可提高我國羅氏沼蝦單產(chǎn)，但關(guān)于羅氏沼蝦個體消化發(fā)育、性別分化的分子機制尚不清楚。

目前，已有研究表明，組織和性別特異性基因是組織細胞分化、性別發(fā)育成熟的關(guān)鍵調(diào)控因子和標(biāo)記分子。組織特異性基因在調(diào)控生物體器官再生、胚胎發(fā)育方面也有著重要的作用，其表達翻譯也是組織器官發(fā)育成熟的標(biāo)志及指示工具，在研究個體發(fā)育、胚胎發(fā)育過程中有著重要的作用，Wang等研究發(fā)現(xiàn)，組織特異性基因在南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）的免疫防御中也有著重要作用。性別特異性表達基因在生物性別發(fā)育分化、性別特異性表型形成、性別轉(zhuǎn)化等過程中均有重要作用，目前關(guān)于甲殼類生物中老虎蝦、南美白對蝦的組織特異性遺傳標(biāo)記均有報道，但在羅氏沼蝦器官組織和性別特異性基因挖掘方面，還未見報道。

現(xiàn)有研究表明，羅氏沼蝦的眼柄、精巢、促雄性腺和卵巢等器官組織參與性別發(fā)育分化，而肝胰腺是羅氏沼蝦體內(nèi)分化形成的最大消化腺體組織。現(xiàn)以羅氏沼蝦的眼柄、肝胰腺、精巢、卵巢和促雄性腺體各器官組織為研究對象，通過分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用組織特異性參數(shù)（τ），挖掘羅氏沼蝦各器官組織和性別差異表達基因，并進行功能分析，探明其作為組織和性別發(fā)育成熟標(biāo)記（Marker）的潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集的性成熟羅氏沼蝦來自浙江省嘉興市紅寶石有限公司養(yǎng)殖基地，分別收集3只成年公蝦的眼柄（Es）、肝胰腺（Hp）、精巢（Tt）、促雄性腺（AG）和3只成年母蝦的眼柄、肝胰腺、卵巢組織（Ov），共計7個組織、21個樣品，進行轉(zhuǎn)錄組測序分析。轉(zhuǎn)錄組RNA測序及注釋由北京諾禾致源科技有限公司完成。轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)定量驗證所用RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和定量分析試劑盒購于南京Vazyme公司。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組測序及注釋

利用Clontech SMARTer PCR cDNA合成試劑盒，并按照BluePippin轉(zhuǎn)錄本片段，選擇系統(tǒng)方案后，制備轉(zhuǎn)錄組測序文庫。因羅氏沼蝦無參考基因組序列，故將所有器官組織樣品的混合樣進行三代全長測序，獲得所有基因序列，作為二代轉(zhuǎn)錄序列拼接比對。三代測序基因去除冗余序列和校正后，根據(jù)序列特異性形成唯一性轉(zhuǎn)錄本序列及基因ID。利用Blast軟件，以P值<10為條件，分別在NT、NR、KOG、Swiss-Prot和KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對分析，以得分最高的作為該基因的注釋基因名。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄基因定量分析

對21個樣品器官組織進行二代轉(zhuǎn)錄測序，組裝后以三代鑒定基因結(jié)果ID為標(biāo)識，統(tǒng)計各個基因的序列條數(shù)，用來計算每個樣本中每個基因的相對表達量，并計算所有基因的相對表達量數(shù)據(jù)FPKM（每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的碎片）值。依據(jù)組織特異性和性別特異性分析結(jié)果，選擇5個組織特異性高表達基因，設(shè)計定量分析引物（表1），進行qPCR定量結(jié)果驗證分析，確定轉(zhuǎn)錄組基因相對表達量的可信度。

表1 qPCR定量分析引物

1.3 統(tǒng)計分析

利用DESeq的R軟件包，按組織分組，進行差異基因表達比較分析，獲得各器官組織特異性差異表達基因；以性別為分組，進行性別特異性差異表達基因分析，獲得各性別特異性差異表達基因。以各器官組織各個基因平均相對表達量FPKM值為基礎(chǔ)，利用軟件R計算各器官組織的τ，計算公式如下：

式中：X——基因在第i個器官組織內(nèi)的相對平均表達量FPKM值；

i——試驗包含的所有器官組織樣品中第i個組織；

以τ>0.85為組織特異性基因和τ>1為組織唯一性高表達基因判定標(biāo)準，鑒定組織特異性及唯一性表達基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組基因聚類分析及注釋

21個羅氏沼蝦樣本器官組織，三代測序結(jié)果經(jīng)去除冗余和校正后，獲得唯一有效轉(zhuǎn)錄本21 345個，其中15 070個在至少一個注釋基因庫中存在對應(yīng)的注釋結(jié)果，另外有6 275個在所有注釋庫中無同源基因。另外雌雄羅氏沼蝦的7個組織樣品的平均FPKM值統(tǒng)計表明，精巢和卵巢平均FPKM值顯著高于（P<0.05）其他組織（圖1）。隨機選擇的5個基因相對表達量與其FPKM值呈極顯著相關(guān)（P<0.01）。

圖1 雌雄羅氏沼蝦不同器官組織相對表達量FPKM值分布

2.2 組織特異性基因鑒定分析

以器官組織為分組單位進行差異表達基因分析，性成熟羅氏沼蝦眼柄組織特異性高表達基因1 874個，特異性低表達基因3 409個；肝胰腺存在的特異性高和低表達基因分別為2 700和5 231個；精巢的特異性高和低表達基因分別有1 698和612個；促雄性腺體特異性高和低表達基因最少，只有270個和24個；卵巢的特異性高表達基因最多，有4 216個。各器官組織特異性高、低表達基因與其他組相對表達量比較分析表明，不論是高表達基因還是低表達基因，其平均相對表達量與其他器官組織都存在極顯著差異（P<0.01），結(jié)果見圖2（a）（b）（c）（d）（e）。

圖2 羅氏沼蝦器官各組織的組織特異性基因相對表達量

在剔除各組織中所有基因的相對表達量FPKM平均數(shù)<1的基因后，計算各基因的τ，獲得τ≥1的組織唯一性基因835個，0.85≤τ＜1的組織特異性高表達基因7 711個。分析獲得眼柄、肝胰腺、精巢、促雄性腺和卵巢5個組織唯一性高表達基因數(shù)依次分別為33，29，39，5和729個，這個分布趨勢與0.85≤τ＜1的組織特異性高表達基因數(shù)分布一致（表2）。

表2 組織特異性基因按τ值大小分類統(tǒng)計

2.3 性別特異性基因鑒定分析

通過雌雄個體所有器官組織基因差異比較分析鑒定，獲得羅氏沼蝦性別特異性差異表達基因455個，其中雄性個體特異性高表達基因162個，雌性個體特異性高表達基因293個。剔除差異表達基因中同一性別中不表達或低表達（FPKM值<1）的差異表達基因后的性別表達基因數(shù)為217個，其中雄性和雌性特異性表達基因分別為87個和130個，且雄性高表達基因表達水平顯著高于雌性，而雌性個體低表達基因組中平均表達水平顯著高于雄性（圖3）。另外對最終的性別差異基因分析τ值表明，性別特異表達基因41%以上的τ>0.8，26%表達基因>0.85。

圖3 羅氏沼蝦性別差異基因平均相對表達量

通過對羅氏沼蝦性別特異性表達基因的進一步分析發(fā)現(xiàn)，性別特異性表達基因在單一性別個體中的平均表達量均顯著高于另一性別個體，雄性個體各器官組織相對表達水平顯著高于雌性各器官組織，且各器官組織間同一性別相對表達量較為穩(wěn)定一致（變異系數(shù)<0.5）[圖4（a）]。如功能注釋為人體寄生動物翅亞綱虱目動物假設(shè)蛋白的基因，該基因在雄性個體表現(xiàn)出顯著的高表達特性，且同一性別各組織之間呈現(xiàn)變異系數(shù)<0.5的趨勢。雌性性別特異性基因的在各器官組織的相對表達水平顯著高于雄性，且變異系數(shù)也<0.5的基因。如功能注釋為負鼠（Monodelphis domestica）核糖體蛋白大亞基L28e的基因，在雌性個體各器官組織表現(xiàn)穩(wěn)定的表達峰度，且各器官組織均顯著高于雄性個體[圖4（b）]。

圖4 性別特異性表達基因在羅氏沼蝦不同器官組織中的相對表達量

3 討論

3.1 羅氏沼蝦性別及器官組織特異性基因挖掘進展

隨著羅氏沼蝦規(guī)模化繁育和人工選育技術(shù)的不斷更新，羅氏沼蝦已經(jīng)初步實現(xiàn)全雄化和全雌化單性群體培育，也是目前唯一完成兩個性別單性化培育的養(yǎng)殖蝦類動物。其他養(yǎng)殖蝦類品種，如南美白對蝦和紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus），還處于關(guān)鍵基因探索階段。雖然以色列研究人員已經(jīng)報道了羅氏沼蝦性別發(fā)育調(diào)控的關(guān)鍵基因iag（insulin-like hormone in androgenic gonad），但關(guān)于iag調(diào)控雄性個體性腺發(fā)育和雌性性腺逆轉(zhuǎn)發(fā)育，特別是實現(xiàn)所有相關(guān)組織器官向雌性化方向逆轉(zhuǎn)發(fā)育方面還未有明確報道。本研究通過挖掘羅氏沼蝦雌雄個體消化和性腺組織器官特異性表達關(guān)鍵基因，提供了有針對性的組織和性別特異性的靶基因?qū)ο髱?，提高了性別發(fā)育的研究效率。

本研究采用的差異基因鑒定分析和τ，有效挖掘了羅氏沼蝦各器官組織的特異性表達基因，建立了羅氏沼蝦消化和性別決定5個主要器官的特異性表達基因庫及器官性成熟的有效表達基因Marker，這與Kryuchkova-Mostacci等和Yanai等對τ的驗證結(jié)果一致。目前組織特異性表達基因在生物器官組織功能、發(fā)育、甚至疾病的發(fā)生過程中都有重要的相應(yīng)分子，而本研究挖掘的消化、性腺的組織特異性基因，彌補了羅氏沼蝦發(fā)育研究中組織特異性標(biāo)識基因缺少的空白。與眼柄器官視覺功能相關(guān)的組織特異性基因的發(fā)現(xiàn)表明，組織特異性表達基因與生物進化有著密切的關(guān)系，同類生物的組織特異性基因有高保守性特征。

3.2 羅氏沼蝦視覺及消化腺特異性基因挖掘

本研究發(fā)現(xiàn)的羅氏沼蝦眼柄組織特異性高表達基因主要包括兩大類別功能基因。一類是KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信號通路注釋為與視覺功能相關(guān)的視紫紅質(zhì)基因，另一類為眼柄特異性的轉(zhuǎn)錄因子，如上游激活因子spp27的亞基基因。其中羅氏沼蝦眼柄視紫紅質(zhì)基因與頂切葉蟻（Acromyrmex echinatior）、歐洲熊蜂（Bombus terrestris）、佛羅里達木蟻（Camponotus floridanus）、熱帶家蚊（Culex quinquefasciatus）等昆蟲的視紫紅質(zhì)基因高度同源，眼柄特異性表達的上游激活轉(zhuǎn)錄因子基因與負鼠的高度同源，表明羅氏沼蝦是甲殼類水生動物向陸地生昆蟲演變的中間體，具有研究節(jié)肢動物從水生變?yōu)殛懮膬r值。

肝胰腺是蝦類等甲殼類動物體內(nèi)最大的組織器官之一和消化腺體，具有分泌消化酶、免疫、造血和免疫等功能，還具有為蝦類動物性成熟儲備營養(yǎng)物質(zhì)的功能。本研究發(fā)現(xiàn)的肝胰腺唯一高表達基因有29個，其中5個在KEGG基因注釋庫中存在同源注釋信息，其中3個分別為與非洲爪蟾（Xenopus tropicalis）抗原樣蛋白E同種型X4基因、果蠅（Drosophila erecta）未定性蛋白和頂切葉蟻的酚氧化酶2基因高度同源，另外2個與蟒蛇（Python bivittatus）未定性蛋白高度同源。已有研究表明，酚氧化酶存在于蝦類動物血細胞中，是蝦類動物重要的免疫系統(tǒng)成員。本研究中，肝胰腺是酚氧化酶的唯一來源，表明肝胰腺不僅是羅氏沼蝦的消化腺體，也是其唯一的造血器官。

3.3 羅氏沼蝦性腺組織及性別特異性基因挖掘

在羅氏沼蝦性腺組織器官精巢和卵巢的組織特異性基因挖掘中發(fā)現(xiàn)，卵巢組織特異性基因表達最為豐富。研究表明，與精巢相比，卵巢發(fā)育過程更加復(fù)雜，發(fā)育過程參與的基因數(shù)量更多。本文在精巢、促雄性腺和卵巢等3個性腺組織特異性基因數(shù)量方面的研究結(jié)果與現(xiàn)有的報道結(jié)果一致，即卵巢中存在更多唯一性高表達基因，其中峰度最高的基因為與KEGG注釋庫中歐洲熊蜂血細胞素同種型的X2基因。該基因是免疫球蛋白和半乳糖結(jié)合雙功能域唾液酸酶的同源基因。在精巢唯一性高表達基因中已知注釋功能的有參與染色體結(jié)構(gòu)維持的中心體蛋白的rho鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)換因子基因，該基因產(chǎn)物與成員蛋白協(xié)同作用形成中心粒，進而參與減速機體有絲分裂。蝦類精子生成過程中精確控制染色體的均勻分布，該基因的高表達和現(xiàn)有研究表明，該基因是羅氏沼蝦保證精子狀態(tài)正常的重要因素。在促雄性腺體中發(fā)現(xiàn)的KEGG注釋為四域蛋白酶抑制劑的基因，可裂解外源生物大分子，從而保護機體精源組織免受外源生物的侵擾。同時促雄性腺體還存在特異性高表達的絲氨酸蛋白酶抑制基因，而絲氨酸蛋白酶抑制基因是雄性動物精子頂體成熟的重要調(diào)節(jié)因子，也是精子成熟所必需。表明羅氏沼蝦促雄性腺體具有與哺乳動物附睪類似的功能，是促進精子進一步成熟的組織器官。

對羅氏沼蝦性別特異性表達基因研究發(fā)現(xiàn)，羅氏沼蝦雄性個體在眼柄、肝胰腺、精巢和促雄性腺中存在共同的雄性特異性高表達、表達穩(wěn)定的功能（變異系數(shù)小于0.5）基因，如與體虱（Pediculus humanus corporis）高度同源的假定蛋白T01223。雌性個體在眼柄、肝胰腺和卵巢中也存在共同的雌性特異性高表達、表達穩(wěn)定的功能（變異系數(shù)小于0.5）基因，如與負鼠高度同源核糖體蛋白L28基因。研究表明，生物體雌雄個體相同組織之間差異基因占37%以上，但是多個組織共有且具有性別特異性的基因還未見報道。這也表明，羅氏沼蝦等水生生物雖然具有ZW染色體系統(tǒng)的性別決定機制，但由于性別可塑性和單個基因決定的因素，該物種性別決定機制更為復(fù)雜，還需深入探索性別特異性基因如何與組織特異性基因協(xié)同發(fā)揮作用，并決定雌雄兩性個體不同的表型特征。