支建道，王鑫磊，吳凌晨，薛暉，趙彥華*

（1.南通閃水生物科技有限公司，江蘇 南通 226000；2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）屬于弧菌科，弧菌屬，為既嗜鹽又嗜溫的革蘭陰性短桿菌，在海產(chǎn)品中大量存在，能夠感染多種水生動物，引起水生動物疾病，對水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)造成危害。副溶血弧菌也作為海產(chǎn)品相關(guān)食源性致病菌引起廣泛關(guān)注。研究表明，副溶血弧菌是一種人與水產(chǎn)養(yǎng)殖動物共染的病原菌，尤其是在南美白對蝦養(yǎng)殖過程中廣泛存在。攜帶特異性質(zhì)粒的副溶血弧菌是引起南美白對蝦急性肝胰腺壞死病暴發(fā)的主要原因。

近年來，針對蝦源副溶血弧菌開展了較多研究。有研究發(fā)現(xiàn)，感染副溶血弧菌的南美白對蝦臨床上呈現(xiàn)食欲減退、大量伏于岸邊、體色由青轉(zhuǎn)微紅的癥狀，解剖可見肝胰臟腫大，胃腸無內(nèi)容物，且傳播及死亡率較高，一旦發(fā)病，2～3 d可全部死亡。為了解副溶血弧菌對南美白對蝦養(yǎng)殖的危害，選取2種殺菌消毒液，開展了其對副溶血弧菌的殺菌效果及對南美白對蝦養(yǎng)殖池塘的抑菌效果的試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

從南美白對蝦中分離的菌株于實驗室-80℃冰箱內(nèi)保存。

1.1.2 消毒液

選取2種消毒液，分別為1和2。消毒液1主要成分為次氯酸，由南通閃水生物科技有限公司提供；消毒液2主要成分為過氧化氫，由瑞士SANOSIL公司提供。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑

LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、TCBS瓊脂培養(yǎng)基平板、TCBS液體培養(yǎng)基及無菌生理鹽水均由廣州環(huán)凱生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.4 試驗設(shè)備

超凈工作臺SW-CJ-1F（蘇凈安泰），37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9162（上海一恒），恒溫?fù)u床Innova 42R（艾本德）。

1.2 方法

1.2.1 菌株復(fù)蘇及純化

將含有菌液的凍存管在室溫下解凍，加入LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h；接種環(huán)劃線接種于TCBS培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h；再次挑取藍(lán)綠色單菌落劃線接種于TCBS培養(yǎng)基；重復(fù)試驗3次后，挑選藍(lán)綠色單菌落接種于TCBS液體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.2 菌懸液制備

將含菌TCBS培養(yǎng)液，4℃離心，棄上清液，加入無菌生理鹽水，混勻離心，棄上清液，反復(fù)3次后，加入無菌生理鹽水制成菌懸液并計數(shù)，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 消毒液試驗濃度

消毒液試驗濃度設(shè)置見表1。

表1 消毒液配制濃度

1.2.4 殺菌試驗

吸取1 mL菌懸液，加入1號無菌管中，2—8號無菌管中各加入900μL無菌生理鹽水，從1號管中吸取100μL菌懸液加入2號管中，依次倍比稀釋，至第7管后棄去，第8管不加入；隨后每管中加入100μL的0.050 mg/L消毒液1，混勻后靜止24 h后，吸取500μL加入TCBS培養(yǎng)基內(nèi)，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察有無細(xì)菌生長。同樣的試驗方法對消毒液1其余濃度及消毒液2所有濃度進(jìn)行試驗，記錄試驗結(jié)果。

1.2.5 抑菌試驗

試驗在南通某南美白對蝦養(yǎng)殖場3個南美白對蝦養(yǎng)殖池塘內(nèi)開展，使用無菌器具取池塘水并編號（1號—3號）。每個塘口設(shè)試驗組2組和對照組1組，其中試驗組分別加入消毒液1和消毒液2，使得最終濃度分別為0.005和1.000 mg/L；對照組不添加。37℃恒溫放置24 h，測細(xì)菌總數(shù)并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌懸液計數(shù)

副溶血弧菌菌懸液計數(shù)為2.81×10CFU/L。

2.2 殺菌效果

消毒液1和消毒液2對副溶血弧菌的殺菌結(jié)果分別見表2和表3。當(dāng)副溶血弧菌濃度為2.81×10CFU/L時，消毒液1最低殺菌濃度為0.005 mg/L，消毒液2最低殺菌濃度為1.000 mg/L。

表2 消毒液1#殺菌結(jié)果①

表3 消毒液2#殺菌結(jié)果①

2.3 抑菌效果

消毒液對南美白對蝦養(yǎng)殖池塘的抑菌結(jié)果見表4。消毒液1和消毒液2在最低濃度殺滅副溶血弧菌的同時，對池塘水的細(xì)菌總數(shù)有明顯的抑制作用。

表4 消毒液抑菌效果