陸惠芳

（蘇州市吳江區(qū)疾病預防控制中心，江蘇 蘇州 215200）

食品微生物研究是一項非常重要的科研工作。食品中的微生物群落結構、種類、數(shù)量以及微生物的代謝活動等方面的研究，對于確保食品的安全性和質量具有至關重要的意義[1-2]。傳統(tǒng)的微生物研究方法需要進行微生物的培養(yǎng)和分離，不僅耗時費力，而且可能存在漏檢或誤檢的情況。隨著高通量測序技術的發(fā)展，食品微生物研究領域中的研究方法也得到了革新[3]。

高通量測序技術的引入，可直接從食品樣品中提取DNA 并進行大規(guī)模測序，以此來研究食品中微生物的群落組成、數(shù)量和活動等方面的情況[4]。這種方法具有高靈敏度、高準確性和高效率等特點，不僅能夠提高微生物檢測的準確性，而且還能夠對微生物的基因組結構和功能等方面進行深入研究[5]。高通量測序技術在食品微生物研究領域中的應用范圍非常廣泛，如可用于檢測食品中的致病微生物、研究食品加工過程中微生物的變化、探究微生物與食品品質關系等。此外，高通量測序技術還可為食品安全保障提供科學依據(jù)和技術支持。

高通量測序技術在食品微生物研究領域中的應用已成為研究人員熱衷追求的技術之一[6]。相信未來隨著技術的不斷發(fā)展和完善，高通量測序技術將會在食品微生物研究中發(fā)揮更為重要的作用，為食品安全保障提供更加可靠的技術手段，成為食品微生物研究領域中的熱門技術[7]。

1 高通量測序技術原理及技術流程

高通量測序技術是一種利用大規(guī)模并行測序的方法，快速高效地對樣品中的DNA 或RNA 進行測序，從而得到其序列信息的技術。其基于光學信號檢測技術和生物化學反應原理，可將樣品DNA/RNA序列信息轉化為光學信號進行檢測和記錄。

1.1 樣品處理

需要對樣品進行處理，如提取DNA/RNA 等，再進行純化和濃縮，以獲得足夠的DNA/RNA 量進行下一步的操作。此外，為避免污染和失真，還需要進行質量檢測和核酸定量等步驟。

1.2 DNA/RNA 文庫構建

需要構建DNA/RNA 文庫，即將樣品DNA/RNA片段插入適當?shù)妮d體中，如Illumina 公司的TruSeq Nano DNA Library Prep Kit 等。這一步是測序前的重要準備工作，對后續(xù)的測序質量和準確性有著至關重要的影響。

1.3 測序平臺選擇

根據(jù)不同的測序目的和需求，需要選擇不同的測 序 平 臺，如Illumina、PacBio、Oxford Nanopore等。其中，Illumina 測序平臺是最常用的高通量測序平臺之一，其核心技術是橋式擴增和測序-bysynthesis 技術，可在較短的時間內高效地測序大量的DNA/RNA 樣品。

1.4 測序操作

在進行測序操作時，首先需要對文庫進行芯片上的捕獲和擴增，隨后使用光學技術進行測序，如Illumina 平臺中的單端測序、雙端測序和Mate-Pair測序等。在測序過程中，利用不同熒光標記的核酸堿基在測序芯片上的順序排列，記錄每一個堿基的光學信號，從而得到樣品的DNA/RNA 序列信息。

1.5 數(shù)據(jù)分析

測序完成后，需要對所得到的數(shù)據(jù)進行處理和分析，包括數(shù)據(jù)質量控制、去除低質量序列、拼接序列、比對序列和注釋基因等步驟。這些步驟需要借助生物信息學工具和軟件進行處理，如Trim Galore、Bowtie、BLAST 等。

2 食品微生物樣品的DNA 提取和質量控制

2.1 樣品的采集和處理

對于食品微生物樣品的DNA 提取和質量控制來說，樣品的采集和處理是至關重要的一步。樣品的采集應該盡可能地避免污染和損傷，以保證提取到的DNA 質量和數(shù)量的準確性。在采集前，應該做好消毒和洗手等步驟，選擇適當?shù)牟杉ぞ吆腿萜?，并避免過度處理和劇烈搖晃等可能影響樣品DNA 的因素。

樣品的質量控制也是非常重要的一步。通過一系列的實驗和檢測，可評估樣品的純度、完整性、濃度和大小等因素，以確保提取出的DNA 質量和數(shù)量的可靠性。一些常見的樣品質量控制方法包括電泳分析、紫外分光光度計測定、比色法檢測和熒光分析等。根據(jù)實驗需求和樣品特點，可選擇合適的方法和工具進行樣品質量控制，以保證后續(xù)實驗的準確性和可靠性。

2.2 DNA 提取方法及質量控制

在食品微生物研究領域，從樣品中提取高質量的DNA 是進行分子生物學實驗的關鍵步驟。由于不同類型的食品微生物樣品具有不同的特點，因此在DNA 提取方法和質量控制方面也存在一定的差異。

常用的DNA 提取方法包括酚/氯仿法、磁珠法、酶解法和離心柱法等。其中，酚/氯仿法是最常用的方法之一，其原理是通過酚/氯仿溶解細胞膜和蛋白質，從而分離出DNA。這種方法操作簡單、成本較低，適用于大多數(shù)微生物樣品。磁珠法則利用表面修飾的磁珠吸附目標DNA，從而實現(xiàn)DNA 的快速、高效提取。該方法適用于不同來源的樣品，但通常需要較高的設備和試劑成本。酶解法和離心柱法則適用于不同類型的樣品，如酵母、真菌、環(huán)境樣品等。

對于DNA 提取后的質量控制，常用的方法包括比色法、熒光分析、凝膠電泳分析等。其中，比色法和熒光分析可測定DNA 的濃度和純度，以評估DNA 樣品的質量；凝膠電泳分析則可確定DNA 的大小和完整性。通過這些方法可評估提取出的DNA是否可用于后續(xù)實驗，是否需要進行進一步純化和濃縮等處理。此外，也可利用定量PCR 等方法評估DNA 的純度和濃度。

3 高通量測序數(shù)據(jù)的處理和分析

3.1 數(shù)據(jù)質量控制和過濾

高通量測序數(shù)據(jù)量龐大，質量也存在一定的波動，因此需要進行數(shù)據(jù)質量控制和過濾，以保證后續(xù)分析的準確性和可靠性。

在數(shù)據(jù)質量控制和過濾的基礎上，進行進一步的分析，如比對、組裝、注釋和功能分析等。這些分析的準確性和可靠性也依賴于數(shù)據(jù)的質量。因此，在實際操作中，研究人員需要根據(jù)具體情況選擇合適的質量控制和過濾方法，同時根據(jù)數(shù)據(jù)的特點和實驗需求進行優(yōu)化和調整。

3.2 群落組成分析

在食品微生物樣品中，微生物群落的組成結構和多樣性是研究的重點之一。在高通量測序數(shù)據(jù)處理和分析中，群落組成分析是一個重要的分析流程。

群落組成分析主要包括物種注釋和分類兩個方面。物種注釋是將高通量測序數(shù)據(jù)中的序列與已知物種的參考數(shù)據(jù)庫進行比對，從而確定序列對應的物種分類信息。在群落組成分析中，通常使用SILVA、Greengenes、NCBI 等公共數(shù)據(jù)庫作為物種注釋的參考數(shù)據(jù)庫。分類則是根據(jù)物種注釋結果，統(tǒng)計各個分類單位（如門、綱、目、科、屬和種）的豐度，從而揭示樣品中微生物群落的組成結構。

在實際操作中，群落組成分析可通過多種軟件實現(xiàn)。其中，常用的軟件包括QIIME、mothur、MG-RAST 等。這些軟件包提供了一系列分析流程和工具，可完成數(shù)據(jù)的質量控制、物種注釋、分類、群落多樣性計算和比較等分析。例如，QIIME 可完成物種注釋、群落豐度統(tǒng)計、群落多樣性計算等分析；mothur 可進行OTU 聚類、物種注釋、多樣性計算等；MG-RAST 則可進行物種注釋、功能注釋等分析。

群落組成分析的結果可通過各種圖表展示。例如，熱圖、曲線圖、餅圖和條形圖等可直觀地展示各個分類單位的豐度和比例分布。此外，群落多樣性指數(shù)，如Shannon 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、Simpson 指數(shù)等也是衡量樣品微生物群落多樣性的重要指標。

3.3 基因功能注釋和代謝通路分析

在高通量測序數(shù)據(jù)處理和分析中，基因功能注釋和代謝通路分析是重要的分析流程。這些分析有利于深入了解微生物基因功能和代謝通路在食品微生物中的作用，為研究微生物在食品加工、儲存等過程中的功能和作用提供重要信息?；蚬δ茏⑨尩哪康氖菍⒏咄繙y序數(shù)據(jù)中的序列與已知基因功能的參考數(shù)據(jù)庫進行比對，從而確定序列對應的功能信息。在食品微生物研究領域，KEGG 數(shù)據(jù)庫是一個常用的參考數(shù)據(jù)庫，其中包含了廣泛的代謝通路信息和基因注釋信息。代謝通路分析通常使用KEGG Pathway 數(shù)據(jù)庫，基于物種注釋結果和基因功能注釋結果進行通路注釋和豐度統(tǒng)計，從而確定樣品微生物代謝通路的豐度和比例分布。代謝通路分析有利于更深入地了解樣品微生物的生理特征和代謝機制。

在實際操作中，基因功能注釋和代謝通路分析可通過多種軟件實現(xiàn)。例如，MG-RAST、STAMP、KOBAS 等軟件包可完成KEGG 數(shù)據(jù)庫中的基因注釋、代謝通路注釋和豐度統(tǒng)計等功能。此外，R 軟件和Python 等編程語言也可用于代謝通路分析和可視化。

4 高通量測序技術在食品微生物研究中的應用

4.1 食品中微生物群落結構的分析

高通量測序技術在食品中微生物群落結構的分析已經成為食品微生物學研究中的一個重要領域。通過對食品樣品中微生物DNA的高通量測序和分析，可獲得豐富的微生物群落信息，方便了解食品微生物的種類、數(shù)量和分布等方面的信息。

在進行食品微生物群落結構的分析之前，需要對樣品進行處理和準備。一般來說，對于食品樣品的DNA 提取和純化需要特別注意，因為食品中存在多種干擾物質，如脂肪、多糖、蛋白質等，這些物質可能對DNA 提取和純化造成影響，影響后續(xù)的測序結果。因此，需要選擇合適的DNA 提取方法，如采用商業(yè)化的基于磁珠或硅膠的DNA 提取試劑盒，來克服這些干擾。此外，在進行高通量測序之前，需要將DNA 樣本轉化為文庫。建立文庫的方式有多種，其中包括插入文庫和整合文庫。插入文庫構建方式是將DNA 樣本通過限制性內切酶切割，接上適配體，經過PCR 擴增后構建文庫；整合文庫構建方式則是通過用化學方式將DNA 片段粘合到一起來構建文庫。選擇何種構建文庫方式需要考慮到樣品的性質和后續(xù)分析的目的等因素。

4.2 食品中致病微生物的檢測和鑒定

高通量測序技術在食品中微生物的檢測和鑒定方面具有廣泛的應用前景。通過高通量測序技術對食品中微生物的DNA 序列進行測序，可實現(xiàn)對食品中致病微生物的檢測和鑒定。通常采用的方法是通過建立與該致病微生物DNA序列特異性相應的引物，進行PCR 擴增，再對擴增產物進行高通量測序。同時，基于高通量測序技術的大規(guī)模樣品處理優(yōu)勢，可實現(xiàn)對多個樣品同時進行高通量測序，從而大大提高檢測效率。在致病微生物的檢測和鑒定中，需要將高通量測序得到的數(shù)據(jù)進行質量控制和過濾，再進行序列比對和物種注釋。比對序列通常使用基于參考序列的序列比對算法，如Bowtie2 和BWA 等。在物種注釋方面，通常使用一些常用的基因組數(shù)據(jù)庫，如NCBI、Uniprot 和KEGG 等。同時，通過比對分析，可以對微生物的特征序列（如16S rRNA）進行比較，從而確定微生物的種類和豐度。

4.3 食品加工過程中微生物的變化和演替

在食品加工過程中，微生物的變化和演替是一個復雜的過程，其對食品質量和安全具有重要的影響。高通量測序技術為研究食品加工過程中微生物變化和演替提供了有力的工具和方法。

在食品加工過程中，微生物數(shù)量和種類會發(fā)生變化，且變化的速度和幅度取決于不同的食品加工過程。高通量測序技術通過測序樣品中微生物的DNA序列，可得到微生物群落的豐度和組成信息，從而揭示微生物在不同加工過程中的變化和演替規(guī)律。通常采用的方法是對樣品進行高通量測序，再將測序數(shù)據(jù)進行質量控制和過濾，進行微生物群落結構的分析。在食品加工過程中，不同的微生物之間相互作用，共同影響著微生物群落的演替過程。高通量測序技術不僅可研究微生物群落的豐度和組成，還可探究微生物的代謝通路和基因表達譜等信息，從而深入了解微生物間的相互作用機制。此外，高通量測序技術還可為探究微生物間相互作用的功能基因和代謝通路等提供大量的數(shù)據(jù)支持。

4.4 食品微生物與食品品質關系的研究

高通量測序技術已經被廣泛應用于食品微生物與食品品質之間關系的研究中。隨著消費者對食品安全和品質的關注日益增加，越來越多的研究人員開始關注食品微生物與食品品質之間的關系，同時利用高通量測序技術進行深入研究。

食品微生物在食品加工和貯存過程中會對食品的品質產生影響。因此，研究食品微生物與食品品質之間的關系對于改善食品品質具有重要的意義。利用高通量測序技術可對食品中微生物群落結構進行分析，并挖掘微生物與食品品質之間的關系。

通過高通量測序技術，研究人員可獲得食品中微生物的種類和數(shù)量信息，并探索微生物的功能特性。例如，利用基于16S rRNA 的高通量測序技術可對食品中的細菌群落進行分析，從中篩選出可能對食品品質具有影響的微生物。此外，利用基于ITS的高通量測序技術可對真菌群落進行分析，了解其對食品的影響。此外，研究人員還可將高通量測序技術與其他分析技術相結合，如化學分析和感官評價等，進一步探究微生物與食品品質之間的關系。例如，將高通量測序技術與揮發(fā)性化合物分析相結合，探究微生物代謝產物對食品風味的影響。

5 結語

高通量測序技術已經成為食品微生物學研究領域的重要工具，有利于更深入地了解食品微生物群落的結構、代謝功能、致病微生物的檢測和鑒定等方面。在研究過程中，DNA 提取和質量控制、文庫構建和測序平臺選擇等步驟都需要特別注意，以確保測序數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。在數(shù)據(jù)處理和分析過程中，數(shù)據(jù)質量控制和過濾、群落組成分析、基因功能注釋和代謝通路分析等都是非常重要的環(huán)節(jié)。高通量測序技術的應用已經為深入了解食品微生物的多樣性、變化和演替，以及微生物與食品品質的關系提供了更全面、深入的視角。這些研究成果將有助于更好地保護食品安全、改善食品品質，為人們的健康和生活作出更大的貢獻。