周旭華，蘇 悅

（1.長(zhǎng)治職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 長(zhǎng)治 046000；2.杭州秀川科技有限公司，浙江 杭州 311121）

0 引言

天然和人工合成品的甾體激素，均具有環(huán)戊烷駢多氫菲母核。廢水中主要污染物為稠環(huán)的雜環(huán)有機(jī)物，吡啶及吡啶鹽含量較多。甾體激素制藥廢水具有濃度高、生化性差、生物抑制性高等特點(diǎn)，處理難度較大。生物法具有處理成本低、降解具有特異性和無(wú)二次污染等優(yōu)勢(shì)，目前報(bào)道的甾體制藥廢水高效降解菌株主要有假單胞菌屬（psudomonas sp.）、醋酸桿菌屬（Acetobacter sp.）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）、鐮刀菌屬（Fusarium sp.）、紅球菌屬（Rhodococcus sp.）和鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium sp.）等[1-5]。

本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)進(jìn)行了大量醫(yī)藥化工廢水生物處理的相關(guān)研究。本研究擬從甾體激素制藥廢水的生物處理系統(tǒng)物種分布情況，探究有效降解甾體制藥廢水的可能物種組成，為同類(lèi)廢水工程應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

樣品來(lái)源于湖南某生物制藥公司甾體激素醫(yī)藥原料生產(chǎn)廢水的生化處理系統(tǒng)。菌株分離自曝氣池混合液，高通量測(cè)序樣品來(lái)源于曝氣池的活性污泥。該處理系統(tǒng)已經(jīng)穩(wěn)定運(yùn)行約9個(gè)月，曝氣池運(yùn)行溫度約為45℃。曝氣池的進(jìn)水水質(zhì)基本情況如下：COD 26 876 mg/L，NH3-N 297 mg/L，TP 5.8 mg/L，鹽度2.56%，pH 7.0。采樣時(shí)間為2019年10月14日，4℃冷藏。分離出的菌株由杭州秀川科技有限公司實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、NaCl 10.0 g/L，pH 7.0。121℃滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基：1 L的LB液體培養(yǎng)基加入20.0 g瓊脂。121℃滅菌20 min。

1.3 菌株分離純化

菌株分離：采用梯度稀釋涂布法，將富集液梯度進(jìn)行稀釋，隨后取各梯度的樣品0.1 mL，用無(wú)菌的玻璃涂布棒均勻涂布到LB固體培養(yǎng)基上，分別在30℃和50℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)，定期觀察，直至出現(xiàn)明顯的單菌落[6]。

菌株純化：挑取形態(tài)不同的單菌落至無(wú)菌的LB固體培養(yǎng)基上，多次畫(huà)線，得單菌落。

1.4 形態(tài)學(xué)特征

菌落形態(tài)：觀察平板上菌落培養(yǎng)1～3 d后的形狀、大小、顏色、邊緣、透明程度和突起等。

1.5 DNA提取

取菌液1 mL，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，加100 μL無(wú)菌的MilliQ級(jí)水重懸菌體；煮沸30～40 min；放-20℃環(huán)境2 h以上；12 000 r/min離心5 min，上清液備用。

1.6 PCR擴(kuò)增

引物1：27F（5′-GAGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）。

引物2：1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGAC-3′）擴(kuò)增16S rDNA。擴(kuò)增體系為PCR mix：12.5 μL，引物1：0.5 μL，引物2：0.5 μL，無(wú)菌的MilliQ級(jí)水：10.5 μL，DNA模板：1 μL。擴(kuò)增程序：25 μL反應(yīng)體系35個(gè)循環(huán)；變性：98℃，5 s；退火：55℃，10 s；延伸：72℃，25 s。

1.7 序列分析

將分離純化得到的菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物直接送交杭州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，16S rDNA序列提交至EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)。污泥樣品直接送交生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行高通量宏基因組微生物測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

從樣品中分離純化的14株菌株，大部分可以在中等鹽濃度的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。其中KR1和KR4在50℃培養(yǎng)分離，其余在30℃培養(yǎng)分離。

2.2 形態(tài)學(xué)特征

菌落呈白色或乳白色，其中白色菌落居多。菌落呈圓形，培養(yǎng)1～3 d后，直徑為1～4 mm；表面光滑或粗糙；大多數(shù)不透明，少數(shù)半透明或透明（表1）。

表1 部分分離菌株的形態(tài)學(xué)特征

2.3 測(cè)序結(jié)果

通過(guò)高通量宏基因組微生物測(cè)序共得到去除嵌合體與靶區(qū)域外后的序列數(shù)68 286條，根據(jù)結(jié)果表明，污泥樣品中微生物主要分布在5個(gè)屬，分別為貪銅菌屬（Cupriavidus sp.）53.68%，無(wú)色桿菌屬（Achromobacter sp.）30.67%，橄欖形菌屬（Olivibacter sp.）7.23%，伊 麗 莎 白 菌 屬（Elizabethkingia sp.）2.78%，嗜染料菌屬（Pigmentiphaga sp.）1.79%（圖1）。

圖1 屬水平豐度

圖1為樣品內(nèi)物種豐度，豐度前13的物種按不同的顏色標(biāo)出。

對(duì)從樣品中分離純化的菌株中挑選有代表性的14個(gè)菌株進(jìn)行16S rDNA序列測(cè)定，并提交至EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，14個(gè)菌株分布在5個(gè)屬，其中芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）6株，伊麗莎白菌屬（Elizabethkingia sp.）2株，無(wú)色桿菌屬（Achromobacter sp.）2株，假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）3株，鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium sp.）1株（表2）。

表2 菌株16S rDNA序列的BLAST比較結(jié)果

2.4 基于COG的功能分析

通過(guò)對(duì)已有測(cè)序微生物基因組的基因功能的構(gòu)成進(jìn)行分析后，獲得的物種構(gòu)成推測(cè)樣本中的功能基因的構(gòu)成（圖2）。

圖2 功能預(yù)測(cè)豐度

3 結(jié)語(yǔ)

16S rDNA常用于生物物種的分子進(jìn)化分析，序列分析結(jié)果表明，在生物降解甾體激素制藥廢水中起作用的可能菌群包括貪銅菌屬（Cupriavidus sp.）、無(wú)色桿菌屬（Achromobacter sp.）、橄欖形菌屬（Olivibacter sp.）、伊麗莎白菌屬（Elizabethkingia sp.）、嗜染料菌屬（Pigmentiphaga sp.）、芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobˉacterium sp.）等。假單胞菌屬（psudomonas sp.）和鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium sp.）與已有報(bào)道處理同類(lèi)廢水菌群相同[1，3]。鞘氨醇桿菌屬（Sphingobium）是一類(lèi)具有很強(qiáng)的烷烴、雜環(huán)芳香烴降解能力的革蘭氏陰性細(xì)菌。陸源源[7]也從城市污水處理廠獲得高效降解甾體雌激素的鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium sp.）菌株。

曝氣池混合液梯度稀釋涂布平板在50℃下培養(yǎng)2 d主要生長(zhǎng)芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。在30℃下培養(yǎng)分離純化得到菌株較為豐富，包括伊麗莎白菌（Elizabethkingia anophelis）、無(wú)色桿菌（Achromobacter anxifer）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）、嗜熱鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium thermophilum）。高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）KR1和特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）KR4可以在50℃下較好生長(zhǎng)。周旭華等[8]從高鹽環(huán)境中篩選的一株嗜耐鹽菌株高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis），能高效降解吡啶。孫智毅[9]從焦化廢水中分離出一株具有高效異養(yǎng)硝化-好氧反硝化的貪銅菌屬（Cupriavidus sp.）菌株。孫福艷等[10]從煙草工業(yè)廢水處理廠的污泥中篩選出一株不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）甾體雌激素降解菌株，能以雌酮為底物。高通量測(cè)序和可培分析之間不能完全對(duì)應(yīng)，可能與采用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件有關(guān)，也可能與人工挑選菌落遺漏有關(guān)，也可能與高通量測(cè)序樣品污染有關(guān)，需進(jìn)一步確認(rèn)。