朱明婧 徐志文 徐誠

1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(南寧 530021)； 2 柳州市科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科

喉內(nèi)肌可以協(xié)調(diào)聲帶運動，使聲帶產(chǎn)生內(nèi)收、外展及緊張等精確變化[1，2]。環(huán)杓后肌是聲帶唯一的外展肌，環(huán)杓側(cè)肌是聲帶內(nèi)收運動的最主要的肌肉，本課題組前期完成了舌骨上下肌群與喉內(nèi)肌的同步電生理實驗，發(fā)現(xiàn)下頜舌骨肌、甲狀舌骨肌與環(huán)杓側(cè)肌肌電相似，而頦舌骨肌、胸骨甲狀肌與環(huán)杓后肌肌電相似[3，4]。 乙酰膽堿(Ach)是神經(jīng)元與效應(yīng)器如肌肉細(xì)胞之間傳遞信息的化學(xué)物質(zhì)，運動的產(chǎn)生要由突觸前膜釋放乙酰膽堿，與突觸后膜的乙酰膽堿受體(nAChR)及運動終板(MEP)結(jié)合，觸發(fā)下一級的Na+-K+-ATP酶系列[5]。肌纖維的類型決定其功能，慢肌纖維(myosin heavy chain Ⅰ，MHC-Ⅰ)的能量來源主要靠有氧氧化，收縮力較弱且緩慢，但不易疲勞；快肌纖維(myosin heavy chain Ⅱ,MHC-Ⅱ)能量來源主要靠無氧酵解，收縮快，但持續(xù)時間短[6]。本研究將在肌電類同的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討相應(yīng)喉內(nèi)、外肌肉的Ach、nAChR和Na+-K+-ATP酶的濃度、MEP水平、肌纖維類型構(gòu)成方面的異同點，為下一步精準(zhǔn)選擇相應(yīng)喉外肌支配神經(jīng)進(jìn)行神經(jīng)移植或神經(jīng)肌蒂移植治療聲帶麻痹提供參考。

1 材料和方法

1.1實驗動物 10只健康成年犬(雌雄不拘)購買自廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，所有實驗研究均已取得廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

速眠新Ⅱ聯(lián)合戊巴比妥鈉聯(lián)合麻醉犬后，取雙側(cè)頦舌骨肌、胸骨甲狀肌與環(huán)杓后肌做比較，取下頜舌骨肌、甲狀舌骨肌與環(huán)杓側(cè)肌作比較，均取神經(jīng)入肌點肌肉。一部分置于-80℃冰箱保存，一部分置于4%多聚甲醛中保存。

1.2ELISA法檢測各肌肉Ach、AChR、Na+-K+-ATP酶濃度 取神經(jīng)入肌點組織塊1 g，加入9 ml的PBS溶液，使用組織勻漿機進(jìn)行碎裂，并離心取上清液(4 ℃，8 000 rpm,10 min)，用ELISA試劑盒設(shè)置3個復(fù)孔測量待測樣品的蛋白濃度；15 min內(nèi)使用酶標(biāo)儀在450 nm處讀取光密度值(OD值)。使用EXCEL表根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程計算濃度。再乘以稀釋倍數(shù)(45 x)，即為待測樣品的濃度。

1.3乙酰膽堿酯酶染色觀察各肌肉中運動終板的數(shù)量 Karnovsky-Roots亞鐵氰化銅法顯示運動終板。取神經(jīng)入肌點0.3 cm處新鮮肌肉組織，固定于4%多聚甲醛中，制作成8微米厚度冰凍切片，置于Karnovsky-Roots孵育液中2 h至切片呈紅棕色。每組隨機取5張切片先在100倍低倍鏡下確定目標(biāo)，并換至200倍鏡下計數(shù)各組動物每張切片AchE反應(yīng)陽性的MEP，換至400倍高倍鏡照相，每張切片至少記錄4個視野中的MEP個數(shù)。

1.4ATP酶染色觀察各肌纖維中MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ個數(shù)及橫截面積 ATP酶染色顯示MHC-Ⅰ型(灰色)、MHC-Ⅱ型(黑色)肌纖維，取目標(biāo)肌肉后將標(biāo)本儲存于-80 ℃冰箱內(nèi)，取橫截面制作成8微米厚冰凍切片，進(jìn)行堿性ATP酶染色，在Image Pro 6.0圖像分析軟件下，隨機選取5個視野(200x)，記錄Ⅰ型(灰色)Ⅱ型(黑色)肌纖維個數(shù)及面積，MHC-II/MHC-I個數(shù)比及橫截面積比。

1.5熒光定量PCR檢測nAChR、MHC-Ⅰ、MHC-ⅡmRNA的表達(dá) 用Trizol提取各肌肉組織的總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，與各類相關(guān)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，以GAPDH作為內(nèi)參，檢測各組肌肉基因以及內(nèi)參表達(dá)量，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，10 min，變性95 ℃，10 s,退火60 ℃，30 s，40個循環(huán)。結(jié)果用2-△△Ct進(jìn)行相對定量分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的資料采用單因素方差分析，非正態(tài)分布的資料采用非參數(shù)檢驗進(jìn)行比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各肌肉Ach、AChR、Na+-K+-ATP酶的濃度 各肌肉Ach、AChR、Na+-K+-ATP酶濃度見表1，可見下頜舌骨肌的Ach濃度低于環(huán)杓側(cè)肌(P<0.05)，Na+-K+-ATP酶濃度高于環(huán)杓側(cè)肌(P<0.05)，nAChR濃度差異無統(tǒng)計示意義(P>0.05)；甲狀舌骨肌Ach、Na+-K+-ATP酶和nAChR濃度與環(huán)杓側(cè)肌差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。胸骨甲狀肌的Ach濃度低于環(huán)杓后肌(P<0.05)，Na+-K+-ATP酶濃度高于環(huán)杓后肌(P<0.05)，nAChR濃度差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)；頦舌骨肌Ach濃度、Na+-K+-ATP酶、nAChR濃度與環(huán)杓后肌均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 各肌肉中Ach、nAChR、Na+-K+-ATP酶濃度

2.2各肌肉中運動終板的數(shù)量 Karnovsky-Roots亞鐵氰化銅法鏡下觀MEP呈棕褐色橢圓或圓形結(jié)構(gòu)附于肌纖維表面，各肌肉MEP計數(shù)結(jié)果為：下頜舌骨肌8.75±1.04個/視野，甲狀舌骨肌8.50±1.41個/視野，環(huán)杓側(cè)肌9.37±1.06個/視野，頦舌骨肌7.13±0.83個/視野，胸骨甲狀肌7.5±1.07個/視野，環(huán)杓后肌7±1.07個/視野,下頜舌骨肌、甲狀舌骨肌與環(huán)杓側(cè)肌之間，頦舌骨肌、胸骨甲狀肌與環(huán)杓后肌之間的運動終板數(shù)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

2.3ATP酶染色觀察各肌肉的肌纖維中MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ個數(shù)及橫截面積的結(jié)果 各肌肉的肌纖維中MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ個數(shù)及橫截面積的結(jié)果見表2,可見下頜舌骨肌和甲狀舌骨肌的MHC-Ⅱ/MHC-Ⅰ的個數(shù)比與環(huán)杓側(cè)肌相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，下頜舌骨肌和甲狀舌骨肌的MHC-Ⅱ與MHC-Ⅰ的橫截面積比與環(huán)杓側(cè)肌相比有顯著性差異(P<0.05)，頦舌骨肌的MHC-Ⅱ/MHC-Ⅰ個數(shù)比和MHC-Ⅱ與MHC-Ⅰ橫截面積比與環(huán)杓后肌相比均有顯著性差異(P<0.05)，胸骨甲狀肌的MHC-Ⅱ/MHC-Ⅰ個數(shù)比與環(huán)杓后肌相比無顯著差異(均P>0.05)，但MHC-Ⅱ與MHC-Ⅰ橫截面積比與環(huán)杓后肌相比有顯著性差異(P<0.05)(表2,圖2)。

表2 各肌肉中MHC-Ⅱ/MHC-Ⅰ個數(shù)比及橫截面積比

2.4各肌肉nAChR、MHC-Ⅰ、MHC-ⅡmRNA的表達(dá) 各肌肉nAChR、MHC-Ⅰ、MHC-ⅡmRNA的表達(dá)見表3，可見，環(huán)杓側(cè)肌nAChR的mRNA表達(dá)量與下頜舌骨肌及甲狀舌骨肌比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，環(huán)杓后肌nAChR的mRNA表達(dá)量與頦舌骨肌及胸骨甲狀肌比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。環(huán)杓側(cè)肌MHC-Ⅰ的mRNA表達(dá)高于下頜舌骨肌，與甲狀舌骨肌差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);環(huán)杓后肌MHC-Ⅰ的mRNA表達(dá)低于頦舌骨肌(P<0.05)，與胸骨甲狀肌差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。環(huán)杓側(cè)肌MHC-Ⅱ的mRNA表達(dá)低于甲狀舌骨肌(P>0.05)，與下頜舌骨肌無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，環(huán)杓后肌MHC-Ⅱ的mRNA表達(dá)低于胸骨甲狀肌(P>0.05)，與頦舌骨肌差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

圖1 各肌肉Karnovsky-Roots亞鐵氰化銅法染色圖(×400) 1a. 下頜舌骨肌; 1b.甲狀舌骨肌; 1c.環(huán)杓側(cè)肌; 1d.頦舌骨肌; 1e.胸骨甲狀肌; 1f.環(huán)杓后肌(黑色箭頭所指即為運動終板)

圖2 各肌肉的ATP酶法染色圖(×200) 2a.下頜舌骨肌; 2b.甲狀舌骨肌; 2c.環(huán)杓側(cè)肌; 2d.頦舌骨肌; 2e. 胸骨甲狀肌; 2f.環(huán)杓后肌(藍(lán)色箭頭所指即為MHC-Ⅰ肌纖維,黃色箭頭所指即為MHC-Ⅱ肌纖維)

表3 各肌肉nAChR，MHC-Ⅰ，MHC-ⅡmRNA表達(dá)

3 討論

單側(cè)聲帶麻痹(unilateral vocal cord paralysis,UVCP)常表現(xiàn)為聲嘶，伴有發(fā)聲費力、咳嗽、誤吸、飲水嗆咳、吞咽困難等[7]，雙側(cè)聲帶麻痹(bilateral vocal cord paralysis,BVCP)甚至出現(xiàn)呼吸困難、窒息等癥狀[8]。當(dāng)前UVCP的外科治療手段包括神經(jīng)或神經(jīng)肌蒂移植術(shù)、甲狀軟骨成形術(shù)、杓狀軟骨內(nèi)移術(shù)、聲帶注射成形術(shù) 等[9]，BVCP的治療方法包括氣管切開術(shù)、神經(jīng)再支配手術(shù)、杓狀軟骨切除術(shù)、聲帶橫斷切開術(shù)、聲帶側(cè)移固定術(shù)、喉起搏術(shù)以及肉毒桿菌注射術(shù)等[10]，但存在效果反復(fù)、操作復(fù)雜、成本高等問題。理論上，重建喉肌的神經(jīng)再支配并恢復(fù)聲帶的運動功能是治療喉返神經(jīng)損傷致聲帶麻痹最理想的方法；聲帶運動過程中環(huán)杓后肌司聲帶外展功能，主要由環(huán)杓側(cè)肌司聲帶內(nèi)收功能。肌肉運動終板產(chǎn)生的電流取決于Ach與nAChR的比例和濃度，同時也受二者結(jié)合的速率常數(shù)影響，Ach與nAChR結(jié)合導(dǎo)致肌肉的動作電位和持續(xù)的肌肉收縮[11，12]。本研究結(jié)果顯示甲狀舌骨肌與環(huán)杓側(cè)肌的Ach、nAChR和Na+-K+-ATP酶水平無顯著性差異，頦舌骨肌與環(huán)杓后肌的Ach、nAChR和Na+-K+-ATP酶水平亦無顯著性差異；濃度無差異的Ach與乙酰膽堿受體結(jié)合，激活Na+-K+-ATP酶通道，從而可以產(chǎn)生相似程度的動作電位和收縮力，本結(jié)果與前期肌電研究[3,4]的結(jié)論一致。從肌纖維類型看，Ⅰ型肌纖維有抗疲勞的作用，主要在維持固定姿勢和長期有氧活動方面發(fā)揮作用；Ⅱ型肌纖維在短時間、高強度、快速活動中發(fā)揮作用。從本研究結(jié)果看甲狀舌骨肌與環(huán)杓側(cè)肌肌纖維類型相似，MHC-Ⅱ/MHC-Ⅰ個數(shù)比、MHC-Ⅰ的mRNA表達(dá)方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義，甲狀舌骨肌MHC-Ⅱ/MHC-Ⅰ橫截面積比低于環(huán)杓側(cè)肌，MHC-Ⅱ的mRNA表達(dá)量高于環(huán)杓側(cè)肌，頦舌骨肌MHC-Ⅱ的mRNA表達(dá)量與環(huán)杓后肌無統(tǒng)計學(xué)差異，而MHC-Ⅱ/MHC-Ⅰ個數(shù)比、 MHC-Ⅱ/MHC-Ⅰ橫截面積比, MHC-Ⅰ的mRNA表達(dá)量不同，這些不同可能與該肌肉在犬進(jìn)食過程中的咀嚼運動量、發(fā)聲以及其他日常生活中負(fù)荷程度和生物功能有關(guān)，且與肌肉的大小、解剖位置都有一定的相關(guān)性。但有研究顯示Ⅰ型與Ⅱ型肌纖維可以互相轉(zhuǎn)換，通過增減運動量和運動負(fù)荷量可以改變，神經(jīng)支配改變后也可產(chǎn)生相應(yīng)變化[13，14]，吸煙等因素也會影響纖維類型的轉(zhuǎn)變[15]。因此，肌纖維類型雖然部分不一致，但是可隨身體需求適應(yīng)而改變。

綜上所述，環(huán)杓側(cè)肌的Ach、nAChR、 Na+-K+-ATP酶、MEP數(shù)量、MHC-Ⅱ/MHC-Ⅰ個數(shù)比、MHC-Ⅰ的mRNA表達(dá)與甲狀舌骨肌比較無統(tǒng)計學(xué)差異，甲狀舌骨肌與環(huán)杓側(cè)肌在乙酰膽堿及組織結(jié)構(gòu)方面有可替代性；頦舌骨肌Ach、nAChR、Na+-K+-ATP酶、MEP數(shù)量、MHC-Ⅱ的mRNA表達(dá)與環(huán)杓后肌類同，雖MHC-Ⅱ/MHC-Ⅰ個數(shù)比及橫截面積比、MHC-Ⅰ的mRNA表達(dá)與環(huán)杓后肌差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但MHC-Ⅰ與MHC-Ⅱ可相互轉(zhuǎn)化，所以該結(jié)果表明頦舌骨肌與環(huán)杓后肌有可替代性。據(jù)此，有利于精準(zhǔn)選擇相應(yīng)喉外肌支配神經(jīng)進(jìn)行神經(jīng)或神經(jīng)肌蒂移植，修復(fù)麻痹喉內(nèi)肌的功能,治療聲帶內(nèi)收或外展麻痹；而且喉外肌與喉內(nèi)肌鄰近，取材方便，創(chuàng)傷較小，不存在排斥反應(yīng)等。但最終選擇神經(jīng)移植、神經(jīng)肌蒂移植或多神經(jīng)肌蒂多點植入，哪種手術(shù)方式效果更好，尚需進(jìn)一步研究。