曹志秀(實(shí)樸檢測(cè)技術(shù)(上海)股份有限公司，上海 201108)

0 引言

烷基酚類化合物(Alkylphenols, APs)是一種具有生物毒性的內(nèi)分泌干擾物，可在環(huán)境中長(zhǎng)期存在，難降解，具有很強(qiáng)的雌激素活性，通過(guò)環(huán)境進(jìn)入人體后富集，嚴(yán)重干擾生物的生殖發(fā)育，造成諸多不利影響[1-2]。其作為重要的化工原料，由人工合成，廣泛用于各行各業(yè)中，如：塑料生產(chǎn)、工業(yè)用洗滌劑、食品及化妝品包裝材料、醫(yī)療器械等諸多領(lǐng)域[3]，且使用量巨大，從而通過(guò)多種途徑殘留在空氣、水、土壤中，并遷移、蓄積，嚴(yán)重污染人們的日常生活環(huán)境。尤為嚴(yán)重的是，食品包裝中的烷基酚原料會(huì)通過(guò)食物直接進(jìn)入人體，危害人類健康[4]。目前，國(guó)外很多組織協(xié)會(huì)都已對(duì)烷基酚類化合物尤其是壬基酚和辛基酚提出了限值規(guī)定[5]。

我國(guó)是烷基酚使用大國(guó)，預(yù)防和控制烷基酚污染尤為重要。但國(guó)內(nèi)暫無(wú)正式發(fā)布的對(duì)環(huán)境土壤中APs的分析方法標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)報(bào)道也很少，紡織品、食品和化妝品等行業(yè)有APs相關(guān)分析方法的標(biāo)準(zhǔn)和報(bào)道，其中對(duì)雙酚A、壬基酚和辛基酚的研究較多[6-7]，前處理方式主要有索氏提取、超聲提取、振蕩提取。其中索氏提取法花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，過(guò)程繁瑣，需要消耗大量有機(jī)溶劑，會(huì)產(chǎn)生大量有害廢液。振蕩提取可能會(huì)造成目標(biāo)物損失。而利用超聲波提取可保證提取效率，且操作簡(jiǎn)單高效，是提取方法的理想選擇。儀器分析方法集中在氣相色譜質(zhì)譜法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、液 相 色譜-串聯(lián) 質(zhì) 譜 法(HPLC-MS-MS)。GC-MS法在分析樣品前一般需要衍生化處理，增加了實(shí)驗(yàn)過(guò)程的復(fù)雜性，影響方法穩(wěn)定性，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作要求高[8]。HPLC-MS-MS法靈敏度高、定性準(zhǔn)確、檢出限低，但對(duì)儀器性能要求高，操作不易掌握[9-11]。HPLC法的原理簡(jiǎn)單，無(wú)需高溫汽化，無(wú)需衍生，無(wú)需優(yōu)化質(zhì)譜條件，且實(shí)驗(yàn)成本低，儀器穩(wěn)定性強(qiáng)，易于推廣[12-14]。本文采用高效液相色譜法對(duì)土壤中的烷基酚進(jìn)行測(cè)定。用乙腈提取，PEP固相萃取小柱凈化，經(jīng)Zorbax Eclipse Plus C18柱分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，該方法簡(jiǎn)捷、高效、靈敏度高、準(zhǔn)確，滿足對(duì)土壤中多種烷基酚的定量分析檢測(cè)要求，為場(chǎng)地環(huán)境土壤樣品的污染監(jiān)控提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品及試劑

甲醇和乙腈(色譜級(jí)，美國(guó)Thermo f isher公司)，10種烷基酚標(biāo)品：雙酚 A(1 000 mg/L)、4-叔丁基苯酚(純度99.90%)、4-丁基苯酚(純度99.30%)、4-戊基苯酚(純度99.74%)、4-己基苯酚(純度99.70%)、4-叔辛基苯酚(純度98.65%)、4-庚基苯酚(純度99.49%)、4-支鏈壬基酚(純度99.90%)、4-辛基苯酚(1 000 mg/L)、 4-壬基苯酚(純度99.72%)(均為有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)，正己烷、二氯甲烷(色譜級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，超純水(美國(guó)Millipore純水機(jī))，固相萃取柱：填料為苯乙烯和二乙烯苯共聚物(PEP，500 mg/6 mL，天津博納艾杰爾公司)，其他未注明的試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥。

1.2 儀器設(shè)備

Thermo U3000高效液相色譜儀(美國(guó) Thermo f isher 公司)，檢測(cè)器：可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器，色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，粒徑為5.0 μm，美國(guó)安捷倫公司)，氮吹儀N-EVAP-112 (美國(guó) Organomation 公司)，超聲波清洗儀YQ-820C (上海易凈超聲波儀器有限公司)，離心機(jī)TGL-16MS (上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，漩渦混合儀SCRC- M3，電子天平等其他實(shí)驗(yàn)室常規(guī)設(shè)備。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取烷基酚各標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解配制成濃度為1 000 mg/L的烷基酚單標(biāo)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確吸取適量的烷基酚單標(biāo)儲(chǔ)備液，混勻，用乙腈配制成濃度為1 mg/L的10種烷基酚標(biāo)準(zhǔn)使用液。用乙腈-水混合溶液(體積比為1∶1)將標(biāo)準(zhǔn)使用液稀釋成濃度分別為1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取約10 g(精確至0.01 g)的土壤樣品，置于事先加入適量硅藻土的50 mL離心管中，充分研磨，使樣品呈小顆?；蚍勰?，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩2 min，于超聲波清洗機(jī)中超聲處理20 min，用離心機(jī)以4 000 r/min離心3 min，收集萃取液于另外的棕色玻璃樣品瓶中。向殘?jiān)性偌尤?0 mL乙腈，渦旋振蕩2 min，按上述步驟重復(fù)提取2次，合并3次萃取液，用超純水稀釋至200 mL，用0.45 μm濾膜抽濾，待凈化。

凈化：PEP固相萃取柱經(jīng)10 mL正己烷、10 mL二氯甲烷、10 mL甲醇和10 mL實(shí)驗(yàn)用水活化后，將過(guò)濾后的萃取液全部轉(zhuǎn)移至固相萃取柱上，流速控制在3～5 mL/min。再用10 mL甲醇淋洗，利用負(fù)壓抽干小柱，用2 mL甲醇和5 mL二氯甲烷洗脫，流速為2～4 mL/min，收集洗脫液于離心管中。

濃縮：將洗脫液于40℃下緩慢濃縮至1.0 mL 以下，加入3 mL乙腈，再濃縮至1.0 mL以下，反復(fù)操作2次，此時(shí)溶劑被置換為乙腈，用乙腈定容至1.0 mL，渦旋振蕩1 min，過(guò)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜于2 mL進(jìn)樣瓶中，4 ℃保存供上機(jī)分析。

選用經(jīng)烘烤過(guò)的石英砂代替待測(cè)試樣，進(jìn)行空白試驗(yàn)。

1.5 液相色譜參考條件

色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18 (4.6 mm×250 mm，粒徑為 5.0 μm)；流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：水；洗脫方式：梯度洗脫，0～15 min，40%～60%A，15～35 min，60%～85%A，保持2 min，37～38 min，85%A～40%A，回到初始流動(dòng)相后保持6 min；進(jìn)樣體積：20.0 μL；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；熒光檢測(cè)器波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)227 nm，發(fā)射波長(zhǎng)315 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法優(yōu)化

2.1.1 分析檢測(cè)條件優(yōu)化

本文分別采用甲醇/水、乙腈/水、甲醇/1%氨水溶液、乙腈/1%氨水溶液作為流動(dòng)相，在相同儀器條件下，對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分離檢測(cè)，根據(jù)分離效果確定最佳組合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇和酚類間形成氫鍵后會(huì)導(dǎo)致峰型拖尾，為了消除拖尾現(xiàn)象，可在流動(dòng)相中加入適量堿，但是加入堿會(huì)干擾部分目標(biāo)化合物的分離效果，而采用乙腈/水為流動(dòng)相時(shí)各目標(biāo)化合物的峰型均尖銳對(duì)稱。所以本方法選擇乙腈和水作為流動(dòng)相。

本方法以乙腈和水為流動(dòng)相，采用Zorbax Eclipse Plus C18(4.60 mm×250 mm，粒徑為5.0 μm)色譜柱進(jìn)行梯度優(yōu)化，通過(guò)不斷調(diào)整流動(dòng)相的比例及其變化速率，使得10種烷基酚化合物的色譜峰彼此分離，得到最佳梯度洗脫程序。此外，由于土壤樣品基質(zhì)復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)大，初始流動(dòng)相比例設(shè)置為乙腈∶水(40∶60)，流速為1.0 mL/min，可降低基質(zhì)對(duì)雙酚A的干擾。本方法可在40 min內(nèi)分離土壤中10種烷基酚類物質(zhì)，峰型尖銳，分離效果良好。優(yōu)化后的10種烷基酚類化合物的標(biāo)準(zhǔn)譜圖如圖1所示。

圖1 10種烷基酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)色譜圖(質(zhì)量濃度為20 μg/L)

2.1.2 提取條件優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取10.0 g土壤空白樣品，用標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.3)加標(biāo)后制備成濃度為10 μg/kg的土壤空白加標(biāo)樣品，分別采用乙腈和甲醇進(jìn)行超聲萃取，其他處理步驟同1.4，在相同的色譜條件下檢測(cè)，對(duì)比兩者的提取效果。結(jié)果顯示，用乙腈超聲萃取時(shí)，雙酚A、4-叔丁基苯酚、4-丁基苯酚、4-戊基苯酚、4-己基苯酚、4-叔辛基苯酚、4-庚基苯酚、4-支鏈壬基酚、4-辛基苯酚、4-壬基苯酚的平均回收率分別為92.7%、78.2%、95.9%、96.0%、94.2%、94.5%、95.0%、97.8%、95.5%、94.3%，用甲醇超聲萃取時(shí)，雙酚A、4-叔丁基苯酚、4-丁基苯酚、4-戊基苯酚、4-己基苯酚、4-叔辛基苯酚、4-庚基苯酚、4-支鏈壬基酚、4-辛基苯酚、4-壬基苯酚的平均回收率分別為90.1%、80.7%、91.8%、96.0%、92.5%、90.2%、87.1%、85.1%、97.9%、82.7%。由此可見(jiàn)，用乙腈超聲萃取時(shí)大部分化合物的提取效率略優(yōu)于甲醇，因此選擇乙腈作為提取溶劑。制備4份濃度為10 μg/kg的土壤空白加標(biāo)樣，用乙腈作為提取溶劑，研究不同超聲處理時(shí)間(10 min、20 min、40 min、60 min)對(duì)提取效率的影響。結(jié)果表明超聲處理時(shí)間對(duì)目標(biāo)化合物的提取效率基本沒(méi)有影響，回收率均達(dá)85%以上。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

取1.3中系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按濃度由低到高的順序用上述色譜條件(1.5)依次進(jìn)樣測(cè)定，以烷基酚類化合物各組分的峰面積為縱坐標(biāo)Y，以其系列濃度為橫坐標(biāo)X，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。如表1所示，在1～100 μg/L線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.995以上。稱取10.0 g土壤空白樣品，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液得到濃度值為0.1 μg/kg的樣品7份，經(jīng)前處理后測(cè)定7次，每次進(jìn)樣量為20.0 μL，按公式(1)計(jì)算方法檢出限MDL：

表1 線性回歸參數(shù)和檢出限

式中：n為試樣的測(cè)定次數(shù)；t為自由度為n-1，置信度為99%時(shí)的t分布(單側(cè))；S為n次平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

其中當(dāng)n=7，置信度為99%時(shí)，t=3.143。

結(jié)果表明本方法的檢出限為0.2～0.5 μg/kg，測(cè)定下限為0.8～2.0 μg/kg。

2.3 精密度和準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確稱取10.0 g土壤空白樣品，用標(biāo)準(zhǔn)溶液加標(biāo)，加標(biāo)濃度分別為1 μg/kg、10 μg/kg、100 μg/kg，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)平行，經(jīng)提取、凈化濃縮后，上機(jī)測(cè)試，計(jì)算6次平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和回收率。結(jié)果表明，在1～100 μg/kg范圍內(nèi)，10種烷基酚類化合物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍在0.152%～2.870%之間，回收率范圍在74.0%～101.0%之間，如表2所示。該方法的精密度和回收率良好。

表2 土壤中10種烷基酚類化合物的精密度和平均回收率(n=6)

2.4 樣品定量分析

采集某企業(yè)場(chǎng)地6個(gè)不同區(qū)域的表層(0.5 m)、中層(1.0 m)、深層(2.0 m)土壤樣品，共18批，用本方法進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，烷基酚有檢出，其中辛基酚含 量為7.96～143 μg/kg，雙 酚A含量為0.92～229 μg/kg，其他化合物的含量較低，或者沒(méi)有檢出。本方法靈敏度高，檢出限低，穩(wěn)定性好，適用于土壤中烷基酚類殘留量的測(cè)定。

3 結(jié)語(yǔ)

本文采用高效液相色譜法對(duì)土壤中烷基酚類化合物進(jìn)行分離測(cè)定。采用乙腈超聲萃取，PEP固相萃取小柱凈化，Zorbax Eclipse Plus C 18柱分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，10種烷基酚類化合物峰型尖銳，分離效果良好，精密度和回收率良好，且采用熒光檢測(cè)器檢測(cè)，較紫外檢測(cè)器靈敏度高，可獲得較低的檢出限，10種烷基酚的檢出限達(dá)到0.2～0.5 μg/kg。該方法靈敏度高，準(zhǔn)確，高效，滿足對(duì)土壤中烷基酚類化合物的定性定量檢測(cè)要求，為土壤中烷基酚監(jiān)測(cè)提供參考。