宋曄娜 俞程程 陳宇珂

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，據(jù)估計每年約有100萬新發(fā)病例，并有大約20萬人死于膀胱癌[1]。膀胱分為肌層浸潤性和非肌層浸潤性，20%～25%的患者在首診時即被確定為肌層浸潤性膀胱癌。肌層浸潤性膀胱癌是患者死亡的主要原因，其長期生存率不理想，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險較高[2]。肌層浸潤性膀胱癌預(yù)后不良可能歸因于對膀胱癌的分子特征和生物學(xué)機(jī)制認(rèn)識不足。因此，尋找可靠的預(yù)測預(yù)后的生物標(biāo)志物加以提前干預(yù)，對預(yù)測臨床預(yù)后、指導(dǎo)治療具有重要意義。細(xì)胞凋亡是由基因控制的有序生理過程，細(xì)胞內(nèi)各組分在這一過程中相互協(xié)調(diào)，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起重要作用，在細(xì)胞代謝過程中，一旦細(xì)胞凋亡失衡，將會導(dǎo)致許多疾病。細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡，研究表明細(xì)胞凋亡在各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，但是其與膀胱癌的關(guān)系卻并未得到研究[3]。文章旨在明確膀胱癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，以更好地了解膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 基因表達(dá)與差異表達(dá)基因分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站下載膀胱癌樣本的轉(zhuǎn)錄組RNA測序數(shù)據(jù)，包括患者年齡、性別、病理分級、臨床分期、病理TNM（tumor node metastasis）分期、總生存時間等臨床信息。抗生素耐藥基因（antibiotic resistance genes，ARGs）集從基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）下載，其中包括163個通過胱天蛋白酶激活而定義凋亡的基因。使用R軟件的limma軟件包，在轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中進(jìn)行了膀胱癌和非腫瘤樣品之間的差異表達(dá)基因（DEGs，differentially expressed genes）。然后在匹配DEG之后鑒定差異表達(dá)的ARG。

1.2 ARGs的鑒定及預(yù)測模型的建立

通過單因素Cox回歸分析確定與OS顯著相關(guān)的ARGs（P＜0.05）。通過多因素Cox回歸分析最終確定與OS相關(guān)的ARG（P＜0.05）。以多變量Cox回歸為基礎(chǔ)，采用glmnet軟件包，應(yīng)用OS相關(guān)的ARGs建立預(yù)后模型。每位患者的ARGs風(fēng)險評分計算如下：風(fēng)險評分=[（系數(shù)mRNA1）×（mRNA1的表達(dá)）]+[（系數(shù)mRNA2）×（mRNA2的表達(dá)）]+……+[（系數(shù)mRNAn）×（mRNAn的表達(dá)）]。根據(jù)中位風(fēng)險評分將所有膀胱癌患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，通過生存ROC程序包進(jìn)行ROC分析，并用AUC評估其判別力。

1.3 AGRs預(yù)后模型與其他臨床病理特征的獨(dú)立性

為了確定該預(yù)后模型是否在其他臨床特征中有意義，將癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)集中的所有臨床病理特征，包括年齡、性別、病理分級、臨床分期、病理TNM分期，分為兩組?；颊叻譃椋耗挲g≤65歲、年齡＞65歲；女性、男性；病理等級高、等級低；Ⅰ/Ⅱ期、Ⅲ/Ⅳ期；病理性T1/2、T3/4；病理性N0、N1。Kaplan-Meier分析用于評估每個亞組中高危組和低危組之間的總生存時間（overall survival，OS）差異。

1.4 預(yù)后相關(guān)的ARG的臨床應(yīng)用

通過R軟件包“ggpubr”分析與預(yù)后相關(guān)的ARGs與臨床病理特征（包括年齡、性別、病理等級、臨床分期、病理TNM分期）的相關(guān)性。將所有具有臨床病理特征的患者分為兩組，分別為年齡≤65歲和年齡＞65歲的亞組，女性和男性亞組，病理分級的高和低亞組，臨床Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ期亞組，病理T1/2和T3/4組，病理N0和N1/2/3組。通過R軟件通過Wilcox檢驗比較每個亞組之間的差異表達(dá)。

1.5 觀察指標(biāo)

觀察研究病例患者的性別、年齡、腫瘤分期、腫瘤分級、淋巴結(jié)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理特征，比較膀胱癌組織與非腫瘤組織之間差異表達(dá)的ARG，篩選差異基因。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

所有統(tǒng)計均使用R 3.6.1和GraphPad Prism 7（San Diego，CA，USA）進(jìn)行。計量資料表示為（±s），計數(shù)資料以n（%）表示。通過R軟件的Wilcox檢驗比較組之間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)集中的409例膀胱癌患者的臨床病理特征

在筆者的研究中，TCGA數(shù)據(jù)集中共有409例膀胱癌患者，其中106例女性和303例男性患者。他們的病理階段從Ⅰ期到Ⅳ期不等。T分期從1～4，N分期從0～3，M分期從0～1。見表1。

表1 TCGA數(shù)據(jù)集中膀胱癌癥患者的臨床病理特征

2.2 膀胱癌組織與非腫瘤組織之間差異表達(dá)的ARG

本研究共納入409例具有RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床隨訪信息的原發(fā)性膀胱癌患者。膀胱癌與非腫瘤組織之間存在4 880個DEG，見表2）。與163個AGR匹配后，膀胱癌與非腫瘤組織之間存在40個AGR，包括21個下調(diào)基因和19個上調(diào)基因，見圖1a。然后，將火山圖可視化以顯示PCa與非腫瘤組織之間差異表達(dá)的ARGs的表達(dá)模式，見圖1b。

圖1 在膀胱癌和非腫瘤組織中不同表達(dá)的ARGs

2.3 與預(yù)后相關(guān)的五個ARG 單變量

Cox回歸分析中共有9個ARG與OS顯著相關(guān)，多變量Cox回歸分析中有5個ARG，它們分別是AIFM3、CASP6、EMP1、GSN、TAP1，見表2。

表2 ARGs相關(guān)OS的單變量和多變量Cox回歸分析

2.4 ARGs相關(guān)的預(yù)后模型構(gòu)建和驗證

Kaplan-Meier生存曲線表明，低危組的死亡率低于高危組（P＜0.001），見圖2a。與OS相關(guān)的預(yù)測基因的ROC曲線如圖所示。圖2b中的AUC為0.686，風(fēng)險評分的分布，OS狀態(tài)和預(yù)后性5種ARG的熱圖如圖2c所示。高危組的患者預(yù)后較差，而低危組的患者預(yù)后較好。

圖2 KM生存分析、TCGA-BC數(shù)據(jù)集中的時間依賴性ROC曲線和預(yù)后相關(guān)ARG的風(fēng)險評分評估

2.5 與預(yù)后相關(guān)的ARGs模型與其他臨床病理特征的獨(dú)立性

圖3顯示了根據(jù)預(yù)后相關(guān)ARGs按臨床特征分層的亞組的KM生存結(jié)果。與其他臨床病理特征無關(guān)，低風(fēng)險組的預(yù)后要好于高風(fēng)險組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 臨床分層亞組的K-M生存分析

3 討論

在癌變過程中正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞，避免細(xì)胞死亡是導(dǎo)致這種惡性轉(zhuǎn)化的重要細(xì)胞變化之一。20世紀(jì)70年代，Kerr等人將凋亡與潛在惡性細(xì)胞的消除、增殖和腫瘤進(jìn)展聯(lián)系起來[4]。惡性腫瘤細(xì)胞逃避凋亡的途徑很多，包括破壞促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間的平衡，破壞死亡受體信號通路等[5-6]。凋亡是一種受基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡，研究[6]表明細(xì)胞凋亡在各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。然而凋亡相關(guān)基因在膀胱患者中的預(yù)后價值研究還很有限。因此，筆者嘗試從多個凋亡相關(guān)基因構(gòu)建一個風(fēng)險評分模型，以提高膀胱癌患者生存率的預(yù)測能力。

本研究中筆者結(jié)合TCGA和GSEA數(shù)據(jù)庫來篩選膀胱腫瘤和正常組織中差異表達(dá)的ARG，并對ARG進(jìn)行了單變量Cox回歸分析和多元Cox回歸分析，最終筆者篩選了5個ARG（AIFM3、CASP6、EMP1、GSN、TAP1），它們與膀胱癌患者的生存率顯著相關(guān)。多項研究表明這些基因在腫瘤發(fā)生中起重要作用。EMP1可用作多種腫瘤的潛在生物標(biāo)志物，包括卵巢癌、骨肉瘤和乳腺葉狀腫瘤[7-9]。EMPs家族的成員包括EMP1，EMP2和EMP3，EMP1也被稱為CL-40或腫瘤相關(guān)膜蛋白（tumor-associated membrane protein，TMP）。研究表明[10]EMP1參與細(xì)胞黏附、增殖和分化，在腫瘤形成和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。一些研究[7-9]表明EMP1可能是包括卵巢癌等多種腫瘤的潛在生物標(biāo)志物。Miao等[11]發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，高表達(dá)的EMP1通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)EMP1在骨肉瘤組織中表達(dá)上調(diào)，并且與淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，它可通過IRX2/MMP9軸刺激骨肉瘤的惡性進(jìn)展。Singh等[12]發(fā)現(xiàn)在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病治療過程中EMP1過度表達(dá)，且EMP1的mRNA表達(dá)可作為兒童B-ALL患者風(fēng)險分層的潛在生物標(biāo)記物。

Caspase是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的家族，在介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡和維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。根據(jù)其在凋亡級聯(lián)中的功能，Caspase可分為啟動子（Caspase-2、-8、-9）或 執(zhí) 行 子（Caspase-3、-6、-7）32。Caspase-6（CASP6）表達(dá)為一種非活性酶原[13]。已有研究[14]表明，單獨(dú)過表達(dá)CASP6可促進(jìn)細(xì)胞凋亡和死亡，在人類癌癥基因調(diào)查中發(fā)現(xiàn)許多CASP6特異性底物與腫瘤相關(guān)。具有代表性的腫瘤相關(guān)CASP6底物包括雙鏈斷裂修復(fù)蛋白RAD21、腫瘤細(xì)胞抗原p53和TP53；乳腺癌1型易感蛋白BRCA1；補(bǔ)充XP-G細(xì)胞的DNA修復(fù)蛋白ERCC5；DNA錯配修復(fù)蛋白MLH1；ras相關(guān)蛋白Rab-10、RB10。因此，CASP6與這些已知的腫瘤相關(guān)底物之間的串?dāng)_表明CASP6可能參與了癌癥的發(fā)生。幾年前，有報道[15]在腫瘤相關(guān)組織中進(jìn)行了初步的CASP6體細(xì)胞突變研究，在胃癌和結(jié)直腸癌組織中檢測到3個CASP6體細(xì)胞突變，表明CASP6在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有一定作用。

凝膠素（glsolin，GSN）是一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，用于切割和覆蓋肌動蛋白絲，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的周轉(zhuǎn)，在細(xì)胞運(yùn)動中起重要作用。此外，GSN還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、增殖甚至凋亡，已發(fā)表的數(shù)據(jù)表明[16]GSN在肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、宮頸癌、卵巢癌等實(shí)體腫瘤中下調(diào)，表明其對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有調(diào)控作用。早期研究發(fā)現(xiàn)TAP1和TAP2在各種癌癥中均下調(diào)，其與腫瘤預(yù)后有關(guān)。TAP1蛋白的過表達(dá)被認(rèn)為是乳腺癌侵襲性的指標(biāo)，這可能是由于高級別腫瘤下調(diào)TAP1的能力較低，或由于在產(chǎn)生IFN-γ的微環(huán)境中較高的免疫浸潤濃度，導(dǎo)致TAP亞基被上調(diào)[17]。在大腸癌中，帶有神經(jīng)周圍浸潤的腫瘤中TAP1的水平降低，這使得TAP1的下調(diào)成為Ⅰ期和Ⅱ期疾病患者的預(yù)后因素[18]。在食道癌中，發(fā)現(xiàn)癌癥組織中TAP1蛋白的上調(diào)是不利的預(yù)后因素[19]。

為了確定這些特異性基因是否可作為膀胱癌預(yù)后因子，筆者構(gòu)建了一個基于5個基因的的預(yù)測模型。單因素和多元Cox回歸分析結(jié)果表明，筆者發(fā)現(xiàn)了一種新的分子生物學(xué)標(biāo)志物和凋亡相關(guān)危險信號，可用于準(zhǔn)確預(yù)測膀胱癌患者的臨床預(yù)后。筆者用K-M分析驗證了這一點(diǎn)，并觀察到高危分患者的生存率明顯較差。這些結(jié)果表明，五基因風(fēng)險評估法具有較高的預(yù)后評估價值，不僅是預(yù)測膀胱癌患者預(yù)后的一種新方法，而且有助于臨床醫(yī)師制定個性化的治療方案。