朱平華 王文華 別峰偉 高江濤

神經(jīng)膠質(zhì)瘤作為常見的原發(fā)性腦腫瘤，具有惡性度高、增值快、侵襲性強(qiáng)等特征，其中多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)約占所有顱內(nèi)腫瘤的40%，預(yù)后較差，平均存活期僅為14個(gè)月[1-2]。膠質(zhì)瘤的手術(shù)、放化療方面在近年來(lái)取得了顯著的進(jìn)步，但是其治療效果未達(dá)到理想[3]。烷化劑替莫唑胺(temozolomide,TMZ) 作為新一代化療藥物，是目前治療GBM最為治療效果最好的化療藥物，主要通過(guò)對(duì)多重DNA位點(diǎn)甲基化來(lái)發(fā)揮細(xì)胞毒性作用[4-5]。由于GBM細(xì)胞對(duì)烷化劑存在化療抵抗，因此TMZ輔助治療延長(zhǎng)GBM患者的存活期的程度有限，大概3個(gè)月作用[6]。APD-核糖基化因子4C(ADP-ribosylation factor4C，ARL4C)屬于ARF亞家族成員之一，參與細(xì)胞內(nèi)的囊泡運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，有研究證實(shí)ARL4C參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但具體機(jī)制尚不清楚[7-8]。因此本研究探討ADP-核糖基化樣因子4C在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及對(duì)替莫唑胺敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年2月至2020年2月本院收治腦膠質(zhì)瘤患者45例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《神經(jīng)膠質(zhì)瘤WHO(2007)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)》[9]，經(jīng)手術(shù)后病理確診為腦膠質(zhì)瘤；②KPS評(píng)分>60分；③血常規(guī)及其他生化指標(biāo)基本正常； ④患者簽署自愿受試同意書，患者及其家屬需簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 合并精神疾病患者；②合并其他惡性腫瘤患者；③合并其他器官嚴(yán)重性病變患者。

1.2 RT-qPCR檢測(cè)ARL4C表達(dá)水平

檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織中ARL4C的mRNA表達(dá)水平，使用RevertAid First Strand cDNA sythesis kit 試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Lightcycler 480 SYBR Green Ⅰ Master 試劑盒進(jìn)行RT-qPCR，以GAPDH作為內(nèi)參基因。mRNA的相關(guān)定量用2-△△Ct法。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃ 15 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 s，40 ℃ 1 min，以上共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.3 治療方法及化療耐藥分析

所有患者均采用替莫唑胺(江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20040637)化療，口服替莫唑胺實(shí)際劑量為75 mg/m2·d-1，持續(xù)6 周。長(zhǎng)期給予患者口服保肝、升血藥物輔助治療。用藥時(shí)間與劑量根據(jù)患者反應(yīng)情況酌情增減。治療過(guò)程中，密切觀察患者臨床表現(xiàn)，每周復(fù)查患者血、尿、便常規(guī)，隔周復(fù)查患者主要生化物學(xué)指標(biāo)。若不良反應(yīng)較為嚴(yán)重，且對(duì)癥治療無(wú)明顯效果，給予減量或者停藥處理?；颊呖筛鶕?jù)耐藥評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[10]分為敏感和耐藥，敏感為患者在化療完成后處于完全緩解狀態(tài)，后期復(fù)發(fā)間隔6個(gè)月以上，耐藥為患者在化療完成后處于癥狀未緩解狀態(tài)或者處于完全緩解狀態(tài)但是后期復(fù)發(fā)間隔在6個(gè)月以內(nèi)。

1.4 RT-qPCR檢測(cè)ARL4C表達(dá)水平

檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織中ARL4CmRNA表達(dá)水平，使用RevertAid First Strand cDNA sythesis kit 試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Lightcycler 480 SYBR Green Ⅰ Master 試劑盒進(jìn)行RT-qPCR，以GAPDH作為內(nèi)參基因。mRNA的相關(guān)定量用2-△△Ct法。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃ 15 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 s，40 ℃ 1 min，以上共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ARL4C表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)果顯示，ARL4C mRNA表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、WHO分級(jí)密切相關(guān)(P<0.05)，而與腫瘤大小、性別、年齡無(wú)關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 ARL4C表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤臨床病理特征的關(guān)系

2.2 腦膠質(zhì)瘤耐藥情況與ARL4C水平的關(guān)系

敏感組患者ARL4C水平顯著低于耐藥組(P<0.05)，見表2。

表2 腦膠質(zhì)瘤耐藥情況與ARL4C水平的關(guān)系

2.3 ARL4C水平對(duì)化療藥物敏感性的多因素分析

根據(jù)Logistic多因素回歸分析結(jié)果，ARL4C表達(dá)水平均是影響腦膠質(zhì)瘤對(duì)化療藥物敏感性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表3。

表3 ARL4C水平對(duì)化療藥物敏感性的多因素分析

3 討論

膠質(zhì)瘤是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)常見的原發(fā)性腦腫瘤，一般起源于白質(zhì)的膠質(zhì)細(xì)胞，浸潤(rùn)性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤是最為常見的膠質(zhì)瘤[11]。根據(jù)其惡性程度分為四級(jí)，其中Ⅰ、Ⅱ級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的惡性程度較低，預(yù)后較好；高級(jí)別星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤包括Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)，其中Ⅲ級(jí)為多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤，包括多形性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、多形性寡突星形角質(zhì)細(xì)胞瘤和多形性寡突膠紙細(xì)胞瘤，Ⅳ級(jí)為膠質(zhì)細(xì)胞瘤[12-13]。但是通過(guò)手術(shù)、放療、化療及靶向治療等手段緩解病情、延長(zhǎng)生存時(shí)間、改善生存質(zhì)量[14]。手術(shù)治療是目前治療腦膠質(zhì)瘤的首選，主要是從腦內(nèi)切除瘤組織，但往往不能將瘤細(xì)胞完全從腦內(nèi)清除，通常還需要進(jìn)行放化療治療[15]。替莫唑胺作為烷化劑，可通過(guò)輔助化療延長(zhǎng)患者生存期[16]。替莫唑胺是目前公認(rèn)的治療多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤最有效的化療藥物，能夠通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA多重點(diǎn)位甲基化發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，但是大多數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)耐藥[17-18]。替莫唑胺主要通過(guò)DNA鳥嘌呤6位氧的甲基化發(fā)揮細(xì)胞毒作用[19]。替莫唑胺盡管能顯著延長(zhǎng)膠質(zhì)瘤患者的存活期，但程度有限，主要在于多形性膠母細(xì)胞瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑的存在化療抵抗[20]。其具體機(jī)制是DNA鳥嘌呤6位氧甲基轉(zhuǎn)移酶的高表達(dá)導(dǎo)致的固有性耐藥與接受替莫唑胺化療后DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)的下降或缺失所引起的獲得性耐藥[21]。

ARL4C屬于一類小G蛋白，是Ras相關(guān)GTP酶的亞家族，主要參與介導(dǎo)細(xì)胞的擴(kuò)散和遷移過(guò)程[22]。ARL4C作為ARL4家族的成員之一，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵基因[23]。ARL4C參與了多種生理功能，比如AI依賴性膽固醇分泌過(guò)程[24]。有研究報(bào)道在人腎癌細(xì)胞中ARL4C與α-微管蛋白之間存在相互作用，ARL4C在結(jié)腸癌和肺腺癌中均呈現(xiàn)高表達(dá)，與胃癌的腹膜傳播以及不良預(yù)后密切相關(guān)[25]。本研究中ARL4C mRNA的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、WHO分級(jí)密切相關(guān)，提示ARL4C 表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤的臨床病理特征相關(guān)，與已有的研究結(jié)果一致[26]。此外還發(fā)現(xiàn)敏感組患者ARL4C水平顯著低于耐藥組。ARL4C水平表達(dá)水平均是影響腦膠質(zhì)瘤對(duì)化療藥物敏感性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示ARL4C與替莫唑胺的敏感性存在相關(guān)性，但是具體機(jī)制尚不明確，還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述，本研究中ADP-核糖基化樣因子4C在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、WHO分級(jí)關(guān)系密切，且與替莫唑胺敏感性有關(guān)，旨在為腦膠質(zhì)瘤的治療提供臨床指導(dǎo)意義。但是本研究存在一定的局限性，納入樣本量不足以及選取中心單一，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以及更具前瞻性的研究試驗(yàn)。