張 堃，呂向坤，焦艾麗，丁雪蕾

（1. 中國人民解放軍陸軍第八十二集團(tuán)軍醫(yī)院 婦兒科，河北 保定 071000；2. 石家莊市第四醫(yī)院 婦科，河北 石家莊 050035）

先兆流產(chǎn)被定義為陰道出血，子宮頸閉合，胎兒宮內(nèi)存活[1]，是妊娠早期最常見的并發(fā)癥。其公認(rèn)危險(xiǎn)因素包括高齡（產(chǎn)婦年齡超過35 歲）、既往流產(chǎn)、肥胖和吸煙，此外，子宮畸形、宮頸機(jī)能不全、多囊卵巢、糖尿病控制不佳、母體感染、免疫功能障礙以及環(huán)境毒素暴露也均可誘導(dǎo)先兆流產(chǎn)發(fā)生[2]。經(jīng)驗(yàn)性建議孕婦臥床休息及使用孕激素為先兆流產(chǎn)常用治療手段，但沒有足夠證據(jù)證明臥床休息可以預(yù)防流產(chǎn)[3]，使用孕激素治療先兆流產(chǎn)也一直存在爭議[4]。臨床實(shí)踐中，當(dāng)確定特定原因時，應(yīng)采用定向治療來預(yù)防流產(chǎn)，但先兆流產(chǎn)病因復(fù)雜且難以確認(rèn)，研究發(fā)現(xiàn)，炎癥參與整個妊娠演變過程，炎癥相關(guān)參數(shù)與妊娠并發(fā)癥密切相關(guān)[5]。Th1 和Th2 細(xì)胞是Th 細(xì)胞的主要亞群，具有不同的細(xì)胞因子產(chǎn)生模式，正常的母體妊娠與Th2 型細(xì)胞因子偏倚為主，Th1/Th2 失衡易導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生[6]。菟絲子為旋花科藥用植物，其有效成分為菟絲子總黃酮（TFCC），具有止瀉、滋補(bǔ)肝腎、益精壯陽和安胎等多種藥理功效[7]，但目前關(guān)于TFCC 是否可通過調(diào)節(jié)Th1/Th2 細(xì)胞因子失衡進(jìn)而影響先兆流產(chǎn)大鼠妊娠結(jié)局的報(bào)道較少。故本實(shí)驗(yàn)擬通過藥物預(yù)處理探討TFCC 對米非司酮誘導(dǎo)的先兆流產(chǎn)大鼠妊娠結(jié)局的影響及作用機(jī)制，以期為先兆流產(chǎn)治療策略制定提供一定的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 7 周齡SPF 級SD 大鼠雌性50只，雄性25 只，體質(zhì)量為（180 ± 20）g，購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號為SCXK（豫）2017-0001。恒溫（22 ～ 24℃）、恒濕（50% ～ 60%）環(huán)境條件下普通飼養(yǎng)，12 h 光-暗交替，適應(yīng)1 周。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)所在單位倫理委員會審批，批號：LJDBSEJTJYY 202005220056。

1.1.2 藥品、主要試劑和儀器 TFCC （純度≥98%）購自南京普怡生物科技有限公司；黃體酮膠囊（50 mg，國藥準(zhǔn)字H20041902）購自浙江仙琚制藥股份有限公司；IL-4、IFN-γ、TNF-α、IL-10 ELISA 試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；兔抗IFN-γ 單克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；IL-4 多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；雌二醇、黃體酮ELISA 試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司；RT-qPCR 儀（美 國Bio Rad 公 司）；Varioskan Flash 型多功能酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；FluorChem E 型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國ProteinSimple 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組、給藥及造模 適應(yīng)性飼養(yǎng)期間，雌鼠每日進(jìn)行陰道涂片以確定發(fā)情周期，將處于動情期雌鼠按2 ∶1 與雄鼠合籠，期間進(jìn)行陰道涂片，鏡下見有大量鐮刀形精子，記為妊娠1 d，未懷孕大鼠則于下個動情期繼續(xù)合籠交配，均成功妊娠。隨機(jī)將孕鼠分為對照組、模型組、TFCC 低劑量組、TFCC 高劑量組及黃體酮組，每組各10 只，其中，TFCC 低劑量組、TFCC 高劑量組及黃體酮組孕鼠于妊娠1 d 分別灌胃給藥3 mg/（kg·d）TFCC、6 mg/（kg·d）TFCC、6 mg/（kg·d）黃體酮，對照組及模型組大鼠灌胃等量生理鹽水，連續(xù)給藥10 d。妊娠11 d 時，模型組、TFCC 低劑量組、TFCC 高劑量組及黃體酮組大鼠均灌胃米非司酮（4 mg/kg）以誘導(dǎo)先兆流產(chǎn)，對照組僅灌胃等量生理鹽水。

1.2.2 樣品采集與處理 1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉各組大鼠，腹主動脈取血，靜置凝固后取血清，3 000 r/min，4℃離心10 min 后取上清液用于ELISA檢測；脫頸處死孕鼠，摘取子宮組織并解剖，記錄活胚數(shù)、死胚數(shù)并計(jì)算流產(chǎn)率，流產(chǎn)率（%）=死胚數(shù)/（活胚數(shù)+死胚數(shù)）×100%；生理鹽水洗滌子宮組織后分別保存于4%多聚甲醛及液氮以用于組織學(xué)染色、RT-qPCR 及Western blot 檢測。

1.2.3 HE 染色 子宮組織經(jīng)4%多聚甲醛固定過夜，常規(guī)石蠟包埋并制備為4 μm 切片，二甲苯脫蠟、乙醇水化，蘇木素染核后鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，伊紅染色30 s，脫水、透明，中性樹膠封片后，于光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖片。

1.2.4 ELISA 法檢測孕鼠血清相關(guān)水平 取離心所得的血清上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作步驟測定雌二醇、黃體酮、IFN-γ、IL-4、TNF-α及IL-10水平。

1.2.5 RT-qPCR 法檢測孕鼠子宮組織GATA-3、IL-4、T-bet、IFN-γ mRNA 相對表達(dá)水平 提取孕鼠子宮組織總RNA，將純度及完整性良好的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以其為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1；PCR 擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s 共40 個循環(huán)，72℃10 min充分延伸。制備RT-PCR反應(yīng)體系，2 000 r/min，離心5 min，于實(shí)時熒光定量PCR 儀內(nèi)進(jìn)行檢測定量。以GAPDH 作為內(nèi)參，以對照組大鼠作為對照，2-ΔΔCt法計(jì)算最終目的基因的相對表達(dá)量。

表1 GATA-3、IL-4、T-bet、IFN-γ 及內(nèi)參引物序列Tab. 1 GATA-3, IL-4, T-bet, IFN-γ and their reference primers

1.2.6 Western blot 技術(shù)檢測孕鼠子宮組織IL-4、IFN-γ 蛋白相對表達(dá)情況 取液氮中子宮組織，碾碎后移入預(yù)冷裂解液中裂解，12 500 r/min，4°C 離心15 min，取上清液。BCA法測定蛋白濃度后加熱變性。利用SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白（壓縮膠60 V，22 min；分離膠120 V，70 min），后將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜上（恒壓90 V，4℃，90 min），5%脫脂奶粉封閉40 min 后，于一抗（均1 ∶1 000 稀釋）內(nèi)4℃孵育過夜，1 × TBST 洗滌3 次，15 min/次；后于HRP 偶聯(lián)二抗（1 ∶10 000 稀釋）內(nèi)室溫孵育2 h，1 × TBST 洗滌3 次，15 min/次；后于ECL 顯影試劑中反應(yīng)1 ～ 2 min，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)曝光并記錄，Image J 軟件分析條帶灰度值，以IL-4、IFN-γ與內(nèi)參GAPDH 灰度值比值表示蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 孕鼠活胚數(shù)、死胚數(shù)及流產(chǎn)率

與對照組比較，模型組孕鼠活胚數(shù)減少，死胚數(shù)及流產(chǎn)率升高（P< 0.05）；與模型組比較，各給藥組孕鼠活胚數(shù)增加，死胚數(shù)及流產(chǎn)率降低（P< 0.05）；與黃體酮組比較，TFCC 低、高劑量組孕鼠活胚數(shù)減少，死胚數(shù)及流產(chǎn)率增加（P< 0.05）；與TFCC 低劑量組比較，TFCC 高劑量組孕鼠活胚數(shù)增加，死胚數(shù)及流產(chǎn)率降低（P< 0.05），見表2。

表2 孕鼠活胚數(shù)、死胚數(shù)及流產(chǎn)率比較（±s，n = 10）Tab. 2 Comparison of live embryos, dead embryos and abortion rate in pregnant rats （±s，n = 10）

表2 孕鼠活胚數(shù)、死胚數(shù)及流產(chǎn)率比較（±s，n = 10）Tab. 2 Comparison of live embryos, dead embryos and abortion rate in pregnant rats （±s，n = 10）

注：模型組與對照組比較，*P < 0.05；各給藥組與模型組比較，#P < 0.05；TFCC 組與黃酮組比較，&P < 0.05；TFCC 高劑量組與TFCC 低劑量組比較，※P < 0.05，下表同。

組別 活胚數(shù)/只 死胚數(shù)/只 流產(chǎn)率/%對照組 9.10 ± 0.70 0.70 ± 0.64 6.89 ± 5.92模型組 2.40 ± 0.80* 7.10 ± 0.94* 65.95 ± 8.66*黃體酮組 7.80 ± 0.98# 1.70 ± 0.64# 18.03 ± 6.01#TFCC 低劑量組 4.30 ± 1.10#& 5.90 ± 1.04#& 52.54 ± 11.25#&TFCC 高劑量組 6.50 ± 1.02#&※ 3.70 ± 1.19#&※ 35.93 ± 10.38#&※F 83.360 87.275 76.905 P 0.000 0.000 0.000

2.2 各組孕鼠子宮形態(tài)變化

HE 染色結(jié)果顯示，對照組孕鼠子宮蛻膜細(xì)胞染色均勻，細(xì)胞排列緊密、規(guī)則。與對照組比較，模型組孕鼠子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞排列疏松，間質(zhì)致密，見有炎性浸潤；與模型組比較，TFCC 低、高劑量組及黃體酮組孕鼠子宮組織結(jié)構(gòu)損傷情況逐漸改善，見圖1。

2.3 各組孕鼠血清雌二醇、黃體酮、IL-4、IFN-γ、TNF-α 及IL-10 水平

與對照組比較，模型組孕鼠血清雌二醇、黃體酮、IL-4 及IL-10 水平降低，IFN-γ、TNF-α 水平升高（P< 0.05）；與模型組比較，各給藥組孕鼠血清雌二醇、黃體酮、IL-4 及IL-10 水平升高，IFN-γ、TNF-α 水平降低（P< 0.05）；與黃體酮組比較，TFCC 低、高劑量組孕鼠血清雌二醇、黃體酮、IL-4及IL-10 水平降低，IFN-γ、TNF-α 水平升高（P<0.05）；與TFCC 低劑量組比較，TFCC 高劑量組孕鼠血清雌二醇、黃體酮、IL-4 及IL-10 水平升高，IFN-γ、TNF-α 水平降低（P< 0.05），見表3。

表3 孕鼠血清雌二醇、黃體酮、IL-4、IFN-γ、TNF-α、IL-10 水平比較（±s，n = 10）Tab. 3 Comparison of serum levels of estradiol, progesterone, IL-4, IFN-γ, TNF-α and IL-10 in pregnant rats（±s，n = 10）

表3 孕鼠血清雌二醇、黃體酮、IL-4、IFN-γ、TNF-α、IL-10 水平比較（±s，n = 10）Tab. 3 Comparison of serum levels of estradiol, progesterone, IL-4, IFN-γ, TNF-α and IL-10 in pregnant rats（±s，n = 10）

組別 雌二醇/（pg/mL） 黃體酮/（ng/mL） IL-4/（pg/mL） IFN-γ/（pg/mL） TNF-α/（pg/mL） IL-10/（pg/mL）對照組 287.64 ± 29.60 19.71 ± 2.84 361.62 ± 28.00 57.69 ± 5.72 34.53 ± 4.16 77.59 ± 5.33模型組 198.46 ± 20.91* 10.34 ± 1.53* 248.96 ± 28.40* 88.59 ± 7.01* 59.84 ± 4.79* 48.14 ± 4.37*黃體酮組 269.35 ± 22.94# 16.89 ± 1.37# 336.65 ± 22.31# 64.37 ± 7.21# 39.99 ± 2.56# 70.55 ± 6.22#TFCC 低劑量組 218.65 ± 18.62#& 12.03 ± 1.57#& 278.63 ± 27.77#& 80.89 ± 7.13#& 52.30 ± 3.33#& 52.60 ± 4.29#&TFCC 高劑量組 241.45 ± 20.45#&※ 14.55 ± 1.51#&※ 306.21 ± 21.13#&※ 72.04 ± 5.63#&※ 44.25 ± 2.97#&※ 61.54 ± 6.19#&※F 25.274 41.150 30.416 35.511 75.288 52.198 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 各組孕鼠子宮組織GATA-3、IL-4、T-bet 及IFN-γ mRNA 相對表達(dá)情況

與對照組比較，模型組孕鼠子宮組織中GATA-3、IL-4 mRNA 相對表達(dá)水平降低，T-bet、IFN-γ mRNA相對表達(dá)水平升高（P< 0.05）；與模型組比較，各給藥組孕鼠子宮組織中GATA-3、IL-4 mRNA 相對表達(dá)水平升高，T-bet、IFN-γ mRNA 相對表達(dá)水平降低（P< 0.05）；與黃體酮組比較，TFCC 低、高劑量組孕鼠子宮組織中GATA-3、IL-4 mRNA 相對表達(dá)水平降低，T-bet、IFN-γ mRNA 相對表達(dá)水平升高（P<0.05）；與TFCC 低劑量組比較，TFCC 高劑量組孕鼠子宮組織中GATA-3、IL-4 mRNA相對表達(dá)水平升高，T-bet、IFN-γ mRNA 相對表達(dá)水平降低（P< 0.05），見表4。

表4 相關(guān)因子mRNA 相對表達(dá)水平比較（±s，n = 10）Tab. 4 Comparison of mRNA relative expression levels of related factors（±s，n = 10）

表4 相關(guān)因子mRNA 相對表達(dá)水平比較（±s，n = 10）Tab. 4 Comparison of mRNA relative expression levels of related factors（±s，n = 10）

組別 GATA-3 IL-4 T-bet IFN-γ對照組 0.98 ± 0.03 1.03 ± 0.07 0.99 ± 0.03 1.01 ± 0.07模型組 0.32 ± 0.05* 0.28 ± 0.08* 3.45 ± 0.75* 8.52 ± 1.82*黃體酮組 0.84 ± 0.07# 0.74 ± 0.11# 1.49 ± 0.58# 2.79 ± 1.13#TFCC 低劑量組 0.48 ± 0.05#& 0.42 ± 0.11#& 2.75 ± 0.51#& 6.09 ± 1.05#&TFCC 高劑量組 0.62 ± 0.05#&※ 0.58 ± 0.11#&※ 2.11 ± 0.46#&※ 4.19 ± 1.23#&※F 266.617 89.076 34.930 58.552 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.5 各組孕鼠子宮組織IL-4、IFN-γ 蛋白相對表達(dá)量

與對照組比較，模型組孕鼠子宮組織中IL-4 蛋白相對表達(dá)量降低，IFN-γ 蛋白相對表達(dá)水平升高（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組孕鼠子宮組織中IL-4 蛋白相對表達(dá)量升高，IFN-γ 蛋白相對表達(dá)水平降低（P< 0.05）；與黃體酮組比較，TFCC 低、高劑量組孕鼠子宮組織中IL-4 蛋白相對表達(dá)量降低，IFN-γ 蛋白相對表達(dá)水平升高（P< 0.05）；與TFCC低劑量組比較，TFCC 高劑量組孕鼠子宮組織中IL-4蛋白相對表達(dá)量升高，IFN-γ 蛋白相對表達(dá)水平降低（P< 0.05），見表5、圖2。

表5 IL-4、IFN-γ 蛋白相對表達(dá)量比較（±s，n = 10）Tab. 5 Comparison of the relative expression levels of IL-4 and IFN-γ protein（±s，n = 10）

表5 IL-4、IFN-γ 蛋白相對表達(dá)量比較（±s，n = 10）Tab. 5 Comparison of the relative expression levels of IL-4 and IFN-γ protein（±s，n = 10）

組別 IL-4 IFN-γ對照組 0.81 ± 0.09 0.09 ± 0.03模型組 0.11 ± 0.02* 0.74 ± 0.06*黃體酮組 0.36 ± 0.05# 0.20 ± 0.04#TFCC 低劑量組 0.19 ± 0.04#& 0.46 ± 0.05#&TFCC 高劑量組 0.29 ± 0.04#&※ 0.32 ± 0.05#&※F 262.746 286.577 P 0.000 0.000

3 討論

TFCC 為菟絲子主要活性成分，研究發(fā)現(xiàn)其可提高生殖激素相關(guān)受體、降低大鼠流產(chǎn)率、增加胚胎重量，減少子宮組織中蛻膜細(xì)胞損傷進(jìn)而介導(dǎo)抗流產(chǎn)作用[8-9]。另有研究表明，胎兒早期流產(chǎn)孕婦血液中雌二醇水平比對照組低86.7%，黃體酮水平比對照組低70.2%，黃體酮與月經(jīng)周期、著床有關(guān)，對維持妊娠至關(guān)重要，并可促進(jìn)胎盤產(chǎn)生雌二醇，預(yù)防策略中黃體酮主要用于先兆流產(chǎn)、反復(fù)流產(chǎn)及早產(chǎn)，胎盤內(nèi)分泌異常是胎兒胎盤功能障礙的標(biāo)志[10]，故本實(shí)驗(yàn)選擇黃體酮治療作為陽性對照。結(jié)果顯示，TFCC 作用效果雖弱于黃體酮，但也可呈劑量依賴性改善先兆流產(chǎn)孕鼠子宮組織結(jié)構(gòu)及蛻膜細(xì)胞損傷，降低死胚數(shù)及流產(chǎn)率，提高活胚數(shù)量，并可顯著提高血清黃體酮及雌二醇水平，提示TFCC 可能通過改善先兆流產(chǎn)大鼠子宮損傷及胎盤功能障礙進(jìn)而改善先兆流產(chǎn)大鼠妊娠結(jié)局而發(fā)揮抗流產(chǎn)作用，對先兆流產(chǎn)預(yù)防或治療同樣具有積極意義。

妊娠期間，各種免疫效應(yīng)因子和分子參與的免疫微環(huán)境建立了特定的母體對半異體胎兒的耐受性，其中Th1 免疫在胚胎著床期間占主導(dǎo)地位，以利于滋養(yǎng)細(xì)胞入侵；胎盤植入后，早期炎性Th1 免疫迅速向Th2 抗炎免疫轉(zhuǎn)移，通過平衡Th1 免疫保護(hù)胎兒，并調(diào)節(jié)胎兒和胎盤的發(fā)育，Th1/Th2 平衡對于在母體-胚胎界面建立免疫耐受至關(guān)重要[11]。Th1 細(xì)胞主要產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IFN-γ，可刺激細(xì)胞炎癥并參與細(xì)胞免疫和排斥過程[12-13]；Th2 細(xì)胞因子主要為IL-4、IL-10 等，可激活B 細(xì)胞抗體的產(chǎn)生并拮抗Th1 細(xì)胞因子，對維持妊娠至關(guān)重要[14-15]。實(shí)驗(yàn)通過評估血清中上述因子水平，發(fā)現(xiàn)模型大鼠Th1/Th2 免疫失衡，經(jīng)TFCC 治療后，先兆流產(chǎn)孕鼠血清TNF-α、IFN-γ 水平降低，IL-4、IL-10 水平升高，提示TFCC 可能促進(jìn)Th2 細(xì)胞因子免疫偏向，改善母體免疫耐受而發(fā)揮抗流產(chǎn)作用。T-bet 為Th1 細(xì)胞中特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)IFN-γ 產(chǎn)生并啟動Th1 發(fā)育；GATA-3 是一種鋅指蛋白，可在Th2 細(xì)胞中選擇性表達(dá)，對所有Th2 細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控至關(guān)重要，T-bet 上調(diào)及GATA-3 下調(diào)可提示免疫失衡，與流產(chǎn)相關(guān)[16]。實(shí)驗(yàn)中，模型孕鼠子宮組織中T-bet mRNA、IFN-γ mRNA 及蛋白相對表達(dá)水平升高，GATA-3 mRNA、IL-4 mRNA 及蛋白相對表達(dá)水平降低，表明先兆流產(chǎn)大鼠不良妊娠結(jié)局與免疫失衡并偏向Th1 免疫有關(guān)，TFCC 可有效逆轉(zhuǎn)此情況。

4 結(jié)論

TFCC 可改善先兆流產(chǎn)大鼠子宮結(jié)構(gòu)損傷、胎盤功能障礙及妊娠結(jié)局，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡偏向Th2 免疫反應(yīng)，進(jìn)而恢復(fù)先兆流產(chǎn)大鼠免疫狀態(tài)有關(guān)，提示先兆流產(chǎn)治療藥物的潛在靶點(diǎn)，也為TFCC 應(yīng)用提供了參考資料，具有一定的臨床試驗(yàn)價(jià)值。