龍 林，黃 盼，翟紅偉，李清安，胡 輝,3,4，黃茜茜*

（1.勁牌持正堂藥業(yè)有限公司，湖北 黃石 435100；2.勁牌研究院，湖北 黃石 435100；3.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室，湖北 大冶 435100；4.湖北省中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，湖北 黃石 435100）

味連屬是毛茛科中較原始的類群，與產(chǎn)自北美的單種屬組成味連亞科。該屬全球約18 種，從東亞到北美的溫帶和寒溫帶地區(qū)均有分布，我國產(chǎn)6種1變種[1]。中藥味連是我國知名度極高的常用中藥之一，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中便有記載，被列為上品。2020 年版《中國藥典》[2-3]將毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch.（味連）、三角葉黃連Coptis deltoideaC.Y.Cheng et Hsiao（雅連）和云連Coptis teetaWall.收載為中藥黃連的原植物。當(dāng)前市場味連供應(yīng)主要以栽培品為主，很大程度上藥材產(chǎn)地就決定了藥材質(zhì)量。因此，對味連進(jìn)行產(chǎn)地評價，是獲得質(zhì)量上乘藥材的關(guān)鍵。

除產(chǎn)地差異之外，味連還存在用近源植物作為混偽品的問題，進(jìn)一步影響了藥材的質(zhì)量。傳統(tǒng)鑒定方法主要依據(jù)葉片的形狀、小葉的疏密程度及花萼的長度等形態(tài)學(xué)性狀進(jìn)行物種的區(qū)分，而味連加工成藥材后僅保留了根部，很難通過形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定。DNA 條形碼技術(shù)在中藥材鑒定中具有高效、快速、準(zhǔn)確率高等特點，是近年來動植物藥材鑒定的主要方法之一[4]。ITS2 序列被選為藥用植物鑒定的標(biāo)準(zhǔn)DNA 條形碼，并已在多個藥用植物及其近源植物的鑒定中得到驗證。陳士林等[5]建立了信息量豐富的藥材DNA 條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫，涵蓋23 262 種藥用植物的78 847 條序列（http://www.tcmbarcode.cn/china）。

為了研究不同產(chǎn)地對味連藥材的質(zhì)量影響，本實驗參照2020 年版《中國藥典》（一部）黃連藥材項下方法對30 批味連藥材進(jìn)行多指標(biāo)測定。另外，利用DNA 條形碼技術(shù)對味連及其近源植物的ITS2 序列進(jìn)行了分子鑒定，提出一種鑒別味連真?zhèn)蔚姆椒ǎ瑸槲哆B潛在價值的進(jìn)一步探索提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

味連直接于田間采樣，每個藥材產(chǎn)地不少于3批，每批不少于5 kg，共30 批（樣品編號WL1-WL30），經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)葉曉川教授鑒定為正品，樣品信息見表1。復(fù)核樣品由湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院進(jìn)行審核。雅連標(biāo)準(zhǔn)品采購于中國食品藥品檢定研究院，批號：120913-201310；馬尾連，編號：MWL，采自云南維西。另從Gene Bank 下載部分雅連及云連、峨眉味連、五葉味連、五萼味連、短萼味連的ITS2 序列。

表1 味連及其近源植物樣品信息Tab. 1 Sequence information of Coptis chinensis and its near source plants

1.2 儀器

U3000 型高效液相色譜儀、ICAPR 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國賽默飛世尓科技有限公司）；Inertsil ODS-3 色譜柱（日本島津?qū)嶒炂鞑挠邢薰荆?；Agilent ZORBAX SB-18色譜柱、7890B型氣相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；Sceintz-48 型高通量組織研磨機（寧波新芝生物科技有限公司）；T100 型PCR 擴增儀（美國Bio-Rad 有限公司）；DYY-10C 型電泳儀（北京六一儀器廠）；Gel Doc XR 型凝膠成像系統(tǒng)（武漢輝景科技有限公司）。

2 方法

2.1 味連質(zhì)量檢測方法

參照2020 年版《中國藥典》（一部）黃連藥材項下方法，對30 批味連藥材性狀、鑒別、水分、總灰分、二氧化硫殘留量、33 種禁用農(nóng)藥殘留量、浸出物、主要成分含量等指標(biāo)進(jìn)行檢測。同時，還按照2020 年版《中國藥典》（四部）通則相關(guān)方法對樣品重金屬及有害元素、黃曲霉毒素等安全性指標(biāo)進(jìn)行全方位的檢測。

2.2 味連及其近源植物的ITS2 序列鑒定方法

2.2.1 DNA 提取、PCR 擴增及測序 （1） DNA 提取 樣品處理參照陳士林等[6-7]的研究方法，味連藥材樣品用75%乙醇擦拭表面后，刮去外表皮，取樣約60 mg，連同雅連標(biāo)準(zhǔn)品60 mg 使用研磨儀35 Hz，轉(zhuǎn)速1 050，電流0.02A，先研磨2 min，根據(jù)樣品研磨程度，再研磨3 ～ 6 min。然后，用天根DP305 植物基因組DNA 提取離心柱型試劑盒提取味連樣品DNA。提取過程完全按照試劑盒說明書進(jìn)行，其中根類樣品在加入細(xì)胞裂解液后65 ℃水浴2 h（或者56 ℃水浴過夜）。

（2） PCR 反應(yīng)體系 TaqMix 21μL ；引物F 1μL，引物R 1μL；DNA 模板2 ～ 5μL；total 25μL反應(yīng)體系。（通用引物，正向引物2F: 5’-ATGCGATAC TTGGTGTGAAT-3’，反向引物3R: 5’-GACGCTTCTCC AGACTACAAT-3’）[8]。

Touchdown PCR 反 應(yīng) 條 件：2F/3R 引 物 退 火 溫度是56℃，設(shè)定退火溫度范圍Tm+10-Tm-5 為66 ～51℃: 94℃ 4 min；94℃ 30 sec，66℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，65℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，64℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30s ec，63℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃30 sec，62℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，61℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，60℃1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，59℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，58℃ 1 min，72℃1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，57℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，56℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，55℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，54℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃30 sec，53℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，52℃ 1 min，72℃ 1 min（1 cycle）；94℃ 30 sec，51℃ 1 min，72℃ 1 min（20 cycle）；72℃ 10 min。

PCR 擴增產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，對條帶單一且清晰的PCR 產(chǎn)物純化后使用ABI3730XL（Applied Biosystems Co., USA）測序儀進(jìn)行雙向測序。

2.2.2 數(shù)據(jù)處理 測序峰圖利用Codon Code Aligner V4.2.4 校對拼接，去除低質(zhì)量區(qū)和引物區(qū)，從而獲得植物類中藥材ITS2 鑒定序列，據(jù)NCBI和中藥材DNA 條形碼識別系統(tǒng)操作流程，與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，比對算法采用Blast1，E 值設(shè)為1.0×10-5[9]，確定樣品拉丁名后，與2020 年版《中國藥典》規(guī)定的基源物種比對。采用MEGA7.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）對所獲序列進(jìn)行比對分析，并基于K2P 模型進(jìn)行種內(nèi)種間變異位點和遺傳距離的分析，用鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，利用bootstrap（1 000 次重復(fù)）檢驗各分支的支持率。根據(jù)ITS2數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站預(yù)測供試材料的ITS2二級結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果與分析

3.1 《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)檢測項

30 批味連藥材水分、總灰分、浸出物、指標(biāo)成分含量等測定結(jié)果見表2。

2020 年版《中國藥典》（一部）黃連藥材中規(guī)定味連藥材水分≤14%，總灰分≤5.0%，SO2≤150 mg/kg，浸出物≥15.0%，33 種禁用農(nóng)藥殘留量不得檢出，小檗堿≥5.5%，表小檗堿≥0.80%，味連堿≥1.6%，巴馬汀≥1.5%。由表2 可知，有7 個批次味連指標(biāo)成分含量不合格，8 個批次總灰分檢測不合格。

表2 不同批次味連藥材多指標(biāo)測定結(jié)果Tab. 2 Multi-index determination results of different batches of Coptis chinensis

3.2 重金屬及有害元素檢測結(jié)果

按照2020 年版《中國藥典》 （四部）通則“2321鉛、鎘、砷、汞、銅測定法”分別對30 批藥材進(jìn)行了檢測，結(jié)果見表3。

表3 不同批次味連藥材重金屬及有害元素測定結(jié)果Tab. 3 Determination results of heavy metals and harmful elements in different batches of Coptis chinensis

按照《中國藥典》中藥重金屬及有害元素一般性要求鉛不得過5 mg/kg，鎘不得過1 mg/kg，砷不得過2 mg/kg，汞不得過0.2 mg/kg，銅不得過20 mg/kg 的標(biāo)準(zhǔn)，30 批味連重金屬及有害元素檢測中，鉛有3 批，鎘有25 批，銅有11 批達(dá)不到要求。

3.3 黃曲霉毒素

按照2020 年版《中國藥典》（四部）通則“2351黃曲霉毒素測定法”項下的規(guī)定分別對30 批味連藥材進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示黃曲霉毒素B1 均小于1 μg/kg；黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2 和黃曲霉毒素B1 的總量均小于3 μg/kg。按照《中國藥典》中藥黃曲霉毒素一般性要求每1 000 g 藥材含黃曲霉毒素B1 不得過5 μg，黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2 和黃曲霉毒素B1 的總量不得過10 μg的標(biāo)準(zhǔn)，30批藥材黃曲霉毒素均符合要求。

3.4 ITS2 序列比對結(jié)果

33 個樣本的ITS 序列的PCR 及測序成功率均為100%。進(jìn)入NCBI 條形碼鑒定系統(tǒng)網(wǎng)站（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和中藥材DNA 條形碼鑒定系統(tǒng)（http://www.tcmbarcode.cn），對實驗藥材的ITS2序列使用BLAST 方法進(jìn)行鑒定和序列驗證[10]，見表4，結(jié)果顯示實驗序列與各自查詢序列的相似度達(dá)到99%以上，此鑒定結(jié)果說明實驗藥材樣本來源準(zhǔn)確。

表4 不同批次味連在NCBI 和中藥材DNA 條形碼鑒定系統(tǒng)中進(jìn)行序列比對Tab. 4 Sequence comparison of different batches of Weilian in NCBI and DNA barcode identification system of traditional Chinese Medicine

3.5 味連藥材及其近源植物ITS2 序列種間變異分析

味連藥材及其近源植物ITS2 序列共76 條，利用MEGA7.0 計算ITS2 序列的種間K2P 遺傳距離，見表5，結(jié)果顯示，味連種內(nèi)遺傳距離是0.000 ～0.003，味連和雅連種間遺傳距離是0.034 ～0.045，味連和云連的種間遺傳距離是0.046 ～0.062，味連和峨眉味連的種間遺傳距離是0.041 ～0.073，味連和五裂味連的種間遺傳距離是0.048 ～0.080，味連和五葉味連的種間遺傳距離是0.141 ～0.152，味連和短萼味連的種間遺傳距離是0.034 ～0.041，味連和馬尾連的種間遺傳距離是0.262 ～0.322。味連和其它味連種間的遺傳距離遠(yuǎn)大于味連種內(nèi)遺傳距離。所以ITS2 序列能很好的鑒定味連藥材到味連種。

表5 味連種內(nèi)及其近源植物種間K2P 距離Tab. 5 K2P distance between species of Coptis chinensis and its near source plants

3.6 味連藥材及其混偽品的NJ 樹鑒定

基于味連、雅連、云連、峨眉味連、五葉味連、五萼味連、短萼味連及馬尾連的ITS2 序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)聚類樹見圖1，結(jié)果表明味連、雅連、云連、峨眉味連、五葉味連、五萼味連、短萼味連聚成一大支，馬尾連單獨聚為一大支，在植物學(xué)分類上，馬尾連屬于唐松草屬，而其它7 種味連均屬于味連屬，也可判斷8 個品種之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。另外，味連、峨眉味連和五葉味連各自聚成一小支的支持率均在90%以上。因此ITS2 序列作為DNA 條形碼可以很好的將味連藥材與其他近源植物區(qū)分開。

3.7 味連及其近源植物的ITS2 序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

根據(jù)http://its2.bioapps.biozentrum.uniwuerzburg.de/所預(yù)測的供試樣本的ITS2 二級結(jié)構(gòu)見圖2，結(jié)果可以看出8 個物種在二級結(jié)構(gòu)上差異顯著。大味連屬的ITS2 二級結(jié)構(gòu)由1 個中心環(huán)、一個半環(huán)和4 個螺旋區(qū)組成，每個螺旋區(qū)上又有大小不等、數(shù)目各異的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。首先，馬尾連的中心環(huán)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，與其他味連屬的藥材差異較大，容易區(qū)分；其次，五裂味連的中心環(huán)結(jié)構(gòu)與其他味連種差別較大，也容易區(qū)分；最后，峨眉味連、云連、雅連、味連、短萼味連和五葉味連藥材的螺旋區(qū)上的莖環(huán)數(shù)量和大小不同，能夠進(jìn)行區(qū)分。可見，通過ITS2 序列的二級結(jié)構(gòu)能夠鑒別味連與其近源植物。

4 討論

黃連屬大宗中藥材，但來源混雜，《中國藥典》就規(guī)定了三種基原。味連作為黃連藥材的市場主導(dǎo)品種，其質(zhì)量代表了黃連藥材的整體質(zhì)量。30 批味連藥材中，含量不合格占比23.33%，主要集中在四川省大邑縣、什邡市、彭州市、峨眉山市等川中地區(qū)，可能與當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件有關(guān)，這些地區(qū)與雅連主產(chǎn)區(qū)（四川洪雅）接近，可能更適宜雅連的生長。總灰分不合格占比26.67%，主要集中在湖北省恩施市、利川市，這可能與當(dāng)?shù)氐耐寥罈l件有關(guān)，也有可能是當(dāng)?shù)厮a(chǎn)“雞爪連”易包裹泥沙，藥材初加工時未處理干凈而導(dǎo)致總灰分超標(biāo)。

30 批味連藥材的重金屬及有害元素、農(nóng)藥殘留量、黃曲霉毒素等安全性指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，參照《中國藥典》中對中藥重金屬及有害元素的一般性要求，味連易出現(xiàn)鎘、銅、鉛超標(biāo)，尤其是鎘元素超標(biāo)。

除此之外，味連還面臨近源植物偽品混入的風(fēng)險。在我國，味連有6 種1 變種，孫濤等[11]研究表明通過ITS2 序列可以鑒定味連屬3 個物種6 份樣品，其樣品種類和樣品量不夠充分，只用了ITS2 核酸信息進(jìn)行分析鑒定。綜合市場應(yīng)用與供求情況，共采集到30 個味連樣品及Gene Bank 下載的味連屬其它5個種和1 個變種的樣品，利用DNA 條形碼技術(shù)進(jìn)行鑒定研究，獲得味連及其近源植物DNA 條形碼序列，并通過使用ITS2 核酸信息及其二級結(jié)構(gòu)信息聯(lián)合分析，能夠顯著提升ITS2 的物種鑒定效率[12]。

5 結(jié)論

味連藥材易出現(xiàn)有效成分含量和總灰分不合格，安全性指標(biāo)方面易出現(xiàn)鎘、銅、鉛超標(biāo)，藥材質(zhì)量方面需重點關(guān)注。利用DNA 條形碼技術(shù)，通過ITS 序列能夠成功準(zhǔn)確鑒定出味連藥材及其混偽品，并基于K2P 模型構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹判斷樣品間的進(jìn)化關(guān)系，這不僅為正確區(qū)分味連藥材、減少市場上混淆品的使用，規(guī)范、安全地利用味連藥材資源提供方法支持，而且為味連種質(zhì)資源評價、遺傳多樣性研究和豐富味連屬DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫提供幫助。