金丹青，顧鵬程，王玉杰，胡尚欽，汪軍成，馬小樂(lè)，司二靜，姚立蓉，李葆春

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.省部共建干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

禾本科鵝觀草屬是小麥族中最大的屬，在抗病方面的農(nóng)藝學(xué)特性值得被關(guān)注[1-4]。偏穗鵝觀草（Roegneria komarovii（Nevski）Nevski）為鵝觀草屬多年生草本植物，原產(chǎn)于我國(guó)，除新疆、青海、西藏外，分布遍及全國(guó)，多生長(zhǎng)在海拔100～2 300 m的山坡和草地[5]。它具有較強(qiáng)的抗寒能力，對(duì)土壤要求不嚴(yán)格，抗旱、耐鹽堿，在抗病性鑒定中表現(xiàn)為抗條銹病，是小麥的二級(jí)基因源。除此之外，其粗蛋白含量高，可消化率高，是優(yōu)良的牧草，同時(shí)在涵養(yǎng)水源、防風(fēng)固沙、調(diào)節(jié)小氣候等方面也起到了不可忽略的作用。通過(guò)體細(xì)胞雜交技術(shù)將偏穗鵝觀草的有利基因引入小麥，創(chuàng)造優(yōu)異變異材料，對(duì)于小麥抗性遺傳改良具有重要意義。良好的偏穗鵝觀草愈傷組織誘導(dǎo)體系的建立，能夠?yàn)榻⑵膣Z觀草與小麥的原生質(zhì)體融合技術(shù)，創(chuàng)建遠(yuǎn)緣雜交后代，利用該優(yōu)良基因庫(kù)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)于偏穗鵝觀草愈傷組織誘導(dǎo)的研究，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。邢莉萍等[6]以鵝觀草屬的鵝觀草為材料，利用其幼穗未成熟種子幼胚為外植體，使用MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加終質(zhì)量濃度為2～5 mg/L的2，4-D，3～6 mg/L的麥草畏，0～0.5 mg/L的6-BA中的任意1種或2種，在黑暗條件下成功誘導(dǎo)出鵝觀草的愈傷組織，但試驗(yàn)過(guò)程中采用的是升汞對(duì)種子進(jìn)行消毒處理，升汞屬劇毒化學(xué)品，不易處理，對(duì)環(huán)境造成傷害。關(guān)于偏穗鵝觀草無(wú)毒條件下種子消毒及其愈傷組織誘導(dǎo)的研究報(bào)道很少[7-8]，同時(shí)對(duì)于偏穗鵝觀草無(wú)菌實(shí)生苗胚軸愈傷組織的快速誘導(dǎo)及繁殖方法更是未見(jiàn)報(bào)道。

本研究探討無(wú)升汞處理偏穗鵝觀草種子并以其無(wú)菌苗的葉片、葉柄、胚軸為外植體，通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基配方來(lái)獲得偏穗鵝觀草大量?jī)?yōu)質(zhì)的愈傷組織，調(diào)整繼代培養(yǎng)基，獲得繼代培養(yǎng)愈傷組織，以便獲取大量有活力的細(xì)胞及細(xì)胞團(tuán)，為下一步的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及小麥與偏穗鵝觀草原生質(zhì)體融合做準(zhǔn)備。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試偏穗鵝觀草（Roegneria komarovi（iNevski）Nevski）種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌苗的獲取分別采用不同體積分?jǐn)?shù)（45%、50%、55%）的濃硫酸對(duì)偏穗鵝觀草種子進(jìn)行脫皮催芽處理，配合酒精及次氯酸鈉進(jìn)行消毒，并分別設(shè)置消毒時(shí)間對(duì)消毒效果進(jìn)行比較（表1），篩選無(wú)菌苗培養(yǎng)最佳條件。發(fā)芽條件統(tǒng)一為黑暗環(huán)境，溫度28℃，MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH值5.8。統(tǒng)計(jì)了不同方法和處理時(shí)間對(duì)偏穗鵝觀草種子消毒效果及消毒后種子發(fā)芽率的影響，以期篩選出最適消毒條件。

表1 偏穗鵝觀草種子消毒的不同方法和處理時(shí)間設(shè)置Tab.1 Different sterilization methods and processing time of seeds of Roegneria komarovii（Nevski）Nevski

1.2.2 愈傷誘導(dǎo)外植體選擇分別選取無(wú)菌實(shí)生苗的葉片、葉柄和胚軸作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體，分別接入培養(yǎng)基1（MS+2.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5.0 g/L瓊脂）、培養(yǎng)基2（MS+1.0 mg/L氨氯吡啶酸+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5.0 g/L瓊脂）中25～30 d，誘導(dǎo)愈傷發(fā)生，每種外植體在2種培養(yǎng)基中均處理6瓶，每瓶中接入外植體4～20個(gè)，通過(guò)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)情況的觀察來(lái)初步篩選較優(yōu)激素組合[9-10]和外植體。

培養(yǎng)條件：溫度（25±1）℃，光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1 500 lx，濕度70%，pH值5.8。

1.2.3 胚軸的愈傷誘導(dǎo)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)9種培養(yǎng)基（表2），將長(zhǎng)0.5～1.0 cm的無(wú)菌苗胚軸接種到培養(yǎng)基中，研究6-BA、2，4-D和NAA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，30 g/L蔗糖、5 g/L瓊脂、0.1 g/L肌 醇，pH值5.8。每個(gè)處理3次重復(fù)，每次重復(fù)包含30個(gè)胚軸，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)胚軸的誘導(dǎo)率。根據(jù)誘導(dǎo)率篩選適合偏穗鵝觀草胚軸愈傷組織的外源激素。

表2 愈傷誘導(dǎo)正交試驗(yàn)因素水平Tab.2 Factors and levels of orthogonal test for callus induction

1.2.4 外源激素用量的選擇 首先根據(jù)1.2.3優(yōu)選出適合誘導(dǎo)偏穗鵝觀草胚軸愈傷組織的外源激素[11-13]，在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)對(duì)外源激素用量進(jìn)行優(yōu)化[14-16]，設(shè)最佳外源激素質(zhì)量濃度分別為1、5、7 mg/L等3個(gè)梯度，所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，30 g/L蔗糖、5 g/L瓊脂、0.1 g/L肌醇，pH值5.8。將培養(yǎng)7 d的實(shí)生苗胚軸組織接種于以上3種不同質(zhì)量濃度外源激素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

1.2.5 愈傷組織的繼代培養(yǎng)挑選顏色鮮亮、質(zhì)地疏松的愈傷組織接種于誘導(dǎo)愈傷組織效果較好的培養(yǎng)基中，觀察愈傷組織繼代培養(yǎng)的生長(zhǎng)狀況。根據(jù)第1次繼代培養(yǎng)的結(jié)果，以后每25～30 d繼代一次，每次繼代選擇增殖力較強(qiáng)的愈傷。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2003處理，采用正交設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)分析方法，對(duì)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行直觀分析，用minitab 15軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)菌實(shí)生苗的獲取

偏穗鵝觀草種子最適催芽和消毒方法為：種子置于50%的濃硫酸中在條件為30℃，210 r/min的搖床里振蕩1 h做脫皮催芽處理，之后用蒸餾水洗去濃硫酸并置于超凈工作臺(tái)。隨后用無(wú)菌水清洗種子，然后75%的酒精振蕩沖洗3 min，緊接著用無(wú)菌水將種子表面的酒精清洗干凈，再用20%的次氯酸鈉振蕩沖洗15 min，最后用無(wú)菌水將種子表面的次氯酸鈉清洗干凈，獲得偏穗鵝觀草無(wú)菌種子（圖1）。之后用無(wú)菌濾紙吸干接入MS培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)7 d后得到無(wú)菌苗。

圖1 偏穗鵝觀草無(wú)菌實(shí)生苗Fig.1 Sterile seedlings of Roegneria komarovii（Nevski）Nevski

2.2 愈傷組織外植體選擇

利用組合培養(yǎng)基1（MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5.0 g/L瓊脂）、培養(yǎng)基2（MS+1.0 mg/L氨氯吡啶酸+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5.0 g/L瓊脂）分別培養(yǎng)偏穗鵝觀草葉片、葉柄和胚軸。結(jié)果顯示（表3），胚軸最易誘導(dǎo)出愈傷組織，葉柄誘導(dǎo)次之，而葉片的誘導(dǎo)效果最差。2種培養(yǎng)基愈傷組織生長(zhǎng)速度無(wú)明顯差別，以培養(yǎng)基1為例，10 d左右部分胚軸的兩端切口處開(kāi)始膨大，呈淡黃色（圖2-a）；15 d后發(fā)現(xiàn)胚軸兩端不同程度膨大（圖2-b）；20 d左右發(fā)現(xiàn)胚軸在接觸培養(yǎng)基的部位有少量愈傷形成（圖2-c）；28 d后絕大部分莖段有黃綠色愈傷生成（圖2-d）。從材料來(lái)源分析，偏穗鵝觀草愈傷組織誘導(dǎo)是胚軸優(yōu)于葉柄、葉片，且培養(yǎng)基1比培養(yǎng)基2更容易誘導(dǎo)胚軸形成愈傷組織。

表3 不同外植體及不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)率Tab.3 Induction rates of different explants and culture mediums %

圖2 不同時(shí)期偏穗鵝觀草愈傷組織Fig.2 Callus of Roegneria komarovii Nevski）Nevski in different periods

2.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其濃度對(duì)于胚軸誘導(dǎo)愈傷組織的影響

2.3.1 正交試驗(yàn)的極差分析 由表4可知，R2，4-D＞R6-BA＞RNAA,因素B（2，4-D）的極差最大，因素C（NAA）的極差最小。說(shuō)明這3個(gè)因素對(duì)無(wú)菌苗胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響大小為：2，4-D＞6-BA＞NAA。正交表中均值越大，則說(shuō)明代表該因子的水平越好。比較各因子的K值，最大值分別是：因素A的K1、因素B的K2和因素C的K3。從誘導(dǎo)率的極差分析結(jié)果可知，最優(yōu)組合為A1B2C3，即0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D+0.6 mg/L NAA。

表4 偏穗鵝觀草胚軸愈傷組織誘導(dǎo)正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of orthogonal test of callus induction with hypocotyl from Roegneria komarovii（Nevski）Nevski

2.3.2 正交試驗(yàn)的方差分析對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析以反映各因子之間的差異，結(jié)果表明（表5），因素B（2，4-D）對(duì)胚軸的影響顯著，因素A（6-BA）、C（NAA）對(duì)胚軸的誘導(dǎo)作用不顯著，此結(jié)果與極差分析的結(jié)果相符合（表4）。所以，最終確定2，4-D為本試驗(yàn)中誘導(dǎo)偏穗鵝觀草愈傷組織的最佳激素。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)定2，4-D質(zhì)量濃度梯度，篩選出最優(yōu)2，4-D為5.0 mg/L。

表5 偏穗鵝觀草胚軸誘導(dǎo)的方差分析Tab.5 Variance analysis of hypocotyl induction of Roegneria komarovii（Nevski）Nevski

2.4 偏穗鵝觀草愈傷組織增殖培養(yǎng)

將得到的顏色黃綠、質(zhì)地疏松的愈傷組織切割成直徑約0.1～0.2 cm的小塊，然后轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)愈傷組織最佳增殖培養(yǎng)基（MS+5.0 mg/L 2，4-D+0.1 g肌醇+30 g/L蔗糖+5 g瓊脂）中，培養(yǎng)25～30 d后繼續(xù)轉(zhuǎn)接到新的誘導(dǎo)愈傷組織增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代增殖，最終獲得顏色黃綠、結(jié)構(gòu)致密的優(yōu)良愈傷組織材料（圖3），將作為原生質(zhì)體培養(yǎng)的材料及其他研究材料。

圖3 偏穗鵝觀草愈傷組織的繼代培養(yǎng)Fig.3 Subculture of callus of Roegneria komarovii（Nevski）Nevski

3 結(jié)論與討論

本研究篩選到偏穗鵝觀草愈傷組織誘導(dǎo)最佳外植體為胚軸，胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+5.0 mg/L 2，4-D+0.1 g肌 醇+30 g/L蔗糖+5 g瓊脂。利用此培養(yǎng)基能夠成功對(duì)誘導(dǎo)出的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，為小麥和偏穗鵝觀草原生質(zhì)體融合提供技術(shù)支持。

根據(jù)細(xì)胞全能性理論，植物的任何器官都可以作為外植體，但不同組織器官培養(yǎng)成功的難易程度不同，同一植物不同的組織器官再生能力也有很大差異，并且接種材料的部位、植株年齡以及植株的生理狀態(tài)等都會(huì)直接影響組織器官的再生。本試驗(yàn)所選的3種外植體中，胚軸誘導(dǎo)的效果最好，葉柄次之，葉片最差，這可能與取材部位的細(xì)胞分化程度有關(guān)系，胚軸在幼苗階段處于旺盛的生長(zhǎng)狀態(tài)，分生細(xì)胞豐富，易誘導(dǎo)分化；也可能是不同外植體中所含有的內(nèi)源激素不同或細(xì)胞的極性差異。

愈傷組織培養(yǎng)初期，一定濃度的生長(zhǎng)素類物質(zhì)是誘導(dǎo)脫分化、愈傷組織生長(zhǎng)的必要條件[17]。從正交試驗(yàn)分析可以看出，2，4-D對(duì)誘導(dǎo)偏穗鵝觀草胚軸形成愈傷影響最大，可見(jiàn)，2，4-D對(duì)外植體誘導(dǎo)愈傷起著關(guān)鍵作用，這與張獻(xiàn)龍等[18]的報(bào)道相一致。除此之外，也有研究者配合使用2，4-D和6-BA[19-22]或NAA[23-24]進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，但是在分析過(guò)程中，并沒(méi)有對(duì)2，4-D和6-BA的交互作用進(jìn)行分析。本試驗(yàn)研究了2，4-D、6-BA及NAA這3種植物生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)偏穗鵝觀草愈傷誘導(dǎo)的影響，獲得的愈傷多疏松，但其他植物生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響及不同形態(tài)愈傷的誘導(dǎo)還有待進(jìn)一步研究。