姚福田，劉曉峰，趙曉軍，周建波，殷輝，任璐

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，山西 太谷 030801）

植物內(nèi)生細(xì)菌作為一類豐富的微生物資源，在經(jīng)濟(jì)作物種植、環(huán)境保護(hù)、生物醫(yī)療等方面都發(fā)揮著重要的作用。對(duì)植物內(nèi)生菌的生物學(xué)效應(yīng)[1]研究發(fā)現(xiàn)，部分植物內(nèi)生菌可以定殖[2]在植物體內(nèi)，對(duì)宿主植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生促進(jìn)作用[3-4]，還可以增強(qiáng)植物的抗逆能力，例如，可以促進(jìn)植物的耐鹽性[4]以及幫助植物修復(fù)環(huán)境中的有機(jī)物污染[5]，此外，還可以抑制病原真菌[6-8]和細(xì)菌[9]侵染，從而防治各種植物病害[10-12]。

有研究表明，進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化可以顯著提高發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性，且發(fā)酵條件優(yōu)化后可提高抑菌物質(zhì)的產(chǎn)量。朱永明等[13]對(duì)1株貝萊斯芽孢桿菌T-70-1進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，菌株發(fā)酵產(chǎn)生抗菌肽的能力顯著提高；賀玉廣[14]對(duì)加利利鏈霉菌（Streptomyces galilaeus）AF1添加表面活性劑組合進(jìn)行優(yōu)化篩選，結(jié)果表明，發(fā)酵條件優(yōu)化以后可以使該菌株發(fā)酵產(chǎn)物中的抑菌活性物質(zhì)的生物合成量明顯提高。發(fā)酵菌液的穩(wěn)定性有利于工業(yè)化大量生產(chǎn)，施用于田間能達(dá)到良好的防治效果。丁芮涵等[15]對(duì)藍(lán)莓潰瘍病生防鏈霉菌CX3的發(fā)酵產(chǎn)物的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，發(fā)酵產(chǎn)物理化性質(zhì)穩(wěn)定，可投入大規(guī)模生產(chǎn)，開發(fā)成新的生物菌劑用來(lái)防治藍(lán)莓潰瘍病。

醉魚草（Buddleja lindleyanaFortune）屬馬錢科多年生小灌木，主要成分包括黃酮類、三萜類、環(huán)烯醚萜苷類等，具有抗菌殺蟲、抗氧化等生物活性[16]。試驗(yàn)前期從醉魚草莖中篩選出的1株對(duì)多種植物病原真菌具有良好抑菌作用的內(nèi)生細(xì)菌ZJ1。本研究以此菌株作為研究材料，優(yōu)化其發(fā)酵條件，對(duì)其發(fā)酵物的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，旨在為微生物源農(nóng)藥的研發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株植物內(nèi)生細(xì)菌ZJ1從醉魚草莖部組織分離獲得，初步鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）；以核果鏈核盤菌（Monilinia laxa）為指示病菌，均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物化學(xué)保護(hù)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL；BPY培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉浸膏5 g、酵母粉5 g、葡萄糖5 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0；CM培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉浸膏5 g、蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0；LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0；NB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0；NYBD培養(yǎng)基：酵母浸膏5 g、牛肉浸膏8 g、葡萄糖10 g、蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0；YSP培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、蔗糖20 g、酵母浸膏5 g、蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0。

1.2 內(nèi)生細(xì)菌ZJ1發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.1 種子液的制備將保存的菌株ZJ1接種在NA平板上，26℃活化36 h，接種于LB培養(yǎng)液中，28℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.2 發(fā)酵濾液的制備將ZJ1種子液按1%（V/V）的接種量接入LB培養(yǎng)液中，160 r/min，28℃振蕩72 h，4℃、12 000 r/min離心12 min，去除菌體，將所得上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，即為菌株ZJ1發(fā)酵濾液。

1.2.3 發(fā)酵液菌體生長(zhǎng)量測(cè)定測(cè)定發(fā)酵菌液在第24、48、72小時(shí)的OD600值，對(duì)照組為未加種子液的空白培養(yǎng)基，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 發(fā)酵濾液抑菌物質(zhì)積累量測(cè)定采用生長(zhǎng)速率法，以Monilinia laxa為指示菌，空白無(wú)菌培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，采用十字交叉法測(cè)定病原菌直徑，計(jì)算抑菌率。

1.2.5 菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定將ZJ1發(fā)酵濾液按1%（V/V）的接種量接入300 mL LB培養(yǎng)基中，于160 r/min、28℃振蕩培養(yǎng)72 h，期間每隔4 h測(cè)定一次OD600值，對(duì)照為不接菌的空白培養(yǎng)基，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選將ZJ1發(fā)酵濾液按1%（V/V）的接種量接入BPY、CM、LB、NB、NYBD和YSP等6種基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)，160 r/min、28℃振蕩培養(yǎng)72 h，在培養(yǎng)24、36、72 h測(cè)定菌體生長(zhǎng)量以及發(fā)酵終止后最終抑菌物質(zhì)積累量，對(duì)照為不接菌的空白培養(yǎng)基，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。分析確定最佳營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。

1.2.7 最佳碳源篩選將1.2.6篩選出的基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別用等量的乳糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖替換碳源，其他成分保持不變，按照1%的接種量將菌株ZJ1發(fā)酵濾液分別接種到上述培養(yǎng)液中，以1.2.6的方法確定最佳碳源。

1.2.8 最佳氮源篩選將1.2.6篩選出的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源以1.2.7中的最佳碳源固定，分別用牛肉膏+胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏+酵母粉、蛋白胨+酵母粉、胰蛋白胨+酵母粉、牛肉膏+蛋白胨、牛肉膏+酵母粉+蛋白胨替換氮源，其他成分保持不變，按照1%的接種量將內(nèi)生細(xì)菌ZJ1發(fā)酵濾液分別接種到上述培養(yǎng)基中，以1.2.6的方法確定最佳氮源。

1.2.9 最佳發(fā)酵溫度篩選以1.2.6、1.2.7、1.2.8篩選出的最佳碳氮源配制培養(yǎng)基，按照1%的接種量將內(nèi)生細(xì)菌ZJ1發(fā)酵濾液分別接種到培養(yǎng)基中，分別置于26、28、30、35℃下培養(yǎng)，以1.2.6的方法確定最佳發(fā)酵溫度。

1.2.1 0發(fā)酵條件正交優(yōu)化選用上述所篩選出的最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基、碳源、氮源制備培養(yǎng)基，選擇pH、裝液量、接種量、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間5個(gè)因素設(shè)置正交試驗(yàn)表L16（45）（表1），溫度為篩選出的最佳溫度，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

表1 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Orthogonal experiment design of fermentation conditions

1.3 內(nèi)生細(xì)菌ZJ1發(fā)酵液穩(wěn)定性測(cè)定

1.3.1 熱穩(wěn)定性測(cè)定分別將10 mL制備好的ZJ1發(fā)酵濾液置于20、40、60、80、100、121℃水浴處理30 min，待冷卻至室溫后與PDA按1∶9（V/V）比例混勻制備平板，以Monilinia laxa為靶標(biāo)菌采用生長(zhǎng)速率法檢測(cè)抑菌活性，對(duì)照組未經(jīng)水浴處理，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.2 酸堿穩(wěn)定性測(cè)定用HCl和NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液分別將10 mL制備好的ZJ1種子發(fā)酵液pH值調(diào)至1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0，室溫靜置2 h后調(diào)回自然pH值，以上述方法檢測(cè)抑菌活性，對(duì)照組未經(jīng)pH處理，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 紫外輻射穩(wěn)定性測(cè)定分別取10 mL制備好的ZJ1發(fā)酵濾液置于7個(gè)試管中，垂直放置于18 W紫外燈下20 cm處照射12 h，每隔2 h及時(shí)取樣制備平板檢測(cè)抑菌活性，對(duì)照組未經(jīng)紫外照射處理，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.4 對(duì)光的穩(wěn)定性測(cè)定分別取10 mL制備好的ZJ1發(fā)酵濾液置于5個(gè)試管中，垂直放置于18 W白熾燈下20 cm照射48 h，分別在6、12、24、36、48 h及時(shí)取樣制備平板檢測(cè)抑菌活性，對(duì)照組未經(jīng)白熾燈照射處理，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.5 貯存時(shí)間穩(wěn)定性測(cè)定將10 mL制備好的ZJ1發(fā)酵濾液分別黑暗保存于4℃冰箱和室溫，在7、15、30、60 d及時(shí)取樣制備平板檢測(cè)抑菌活性，以新鮮制備的發(fā)酵濾液作為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2010進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分析并繪制圖表；采用SPSS Statistics 26.0軟件進(jìn)行Duncan's新復(fù)極差法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌ZJ1發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 菌株ZJ1生長(zhǎng)曲線的測(cè)定菌株ZJ1的生長(zhǎng)曲線如圖1所示，0～4 h菌株生長(zhǎng)緩慢；4～28 h菌株增長(zhǎng)極快；28～52 h菌株生長(zhǎng)量穩(wěn)定增加；52 h時(shí)細(xì)菌數(shù)量達(dá)到頂峰，之后菌株生長(zhǎng)平穩(wěn)。

圖1 菌株ZJ1生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of ZJ1 strain

2.1.2 菌株ZJ1基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選由圖2可知，根據(jù)Duncan's新復(fù)極差法分析，菌株ZJ1在6種不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h菌體生長(zhǎng)量（OD600）在NYBD中顯著高于其他培養(yǎng)基（P＜0.05），48 h在YSP中菌體生長(zhǎng)量顯著高于其他培養(yǎng)基（P＜0.05），72 h后，菌體生長(zhǎng)量（OD600）由大到小依次為L(zhǎng)B（2.18）＞YSP（2.13）＞BPY（2.11）＞CM（2.09）＞NYBD（1.99）＞NB（1.89），LB培養(yǎng)基菌體生長(zhǎng)量顯著高于其他培養(yǎng)基（P＜0.05）。72 h后測(cè)得菌株ZJ1對(duì)Monilinia laxa的抑菌率從大到小依次為NYB（84.02%）＞YSP（83.46%）＞BPY（81.21%）＞NB（74.99%）＞LB（67.82%）＞CM（63%），在NYBD培養(yǎng)基中的發(fā)酵濾液抑菌率顯著高于CM培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基和BPY培養(yǎng)基（P＜0.05），但與YSP培養(yǎng)基無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。綜上，結(jié)合72 h后菌體生長(zhǎng)量及抑菌活性，選定YSP培養(yǎng)基為菌株ZJ1的最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

圖2 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)菌株ZJ1菌體生長(zhǎng)量及發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.2 Effects of different basic culture medium on bacteria growth and bacteriostatic activity of fermentation broth of ZJ1 strain

2.1.3 菌株ZJ1最佳碳源的篩選由圖3可知，菌株ZJ1在不同碳源下培養(yǎng)24 h后，在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)量顯著高于其他碳源（P＜0.05），培養(yǎng)48、72 h后，在以麥芽糖為碳源的菌體生長(zhǎng)量顯著高于其他碳源（P＜0.05），72 h后菌體生長(zhǎng)量由大到小依次為麥芽糖（2.54）＞乳糖（2.51）＞果糖（2.38）＞蔗糖（2.35）＞甘露醇（2.30）＞葡萄糖（2.28）＞可溶性淀粉（1.89），表明菌株在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好，其次是乳糖（P＜0.05）。菌株代謝產(chǎn)物對(duì)Monilinia laxa的抑菌活性由大到小依次為乳糖（89.80%）＞可溶性淀粉（88.32%）＞甘露醇（88.3%）＞葡萄糖（88.24%）＞麥芽糖（87.56%）＞果糖（87.35%）＞蔗糖（85.43%），表明以乳糖為碳源的發(fā)酵濾液的抑菌率顯著高于其他碳源（P＜0.05）。綜上，選定乳糖作為最佳碳源。

圖3 不同碳源培養(yǎng)基對(duì)菌株ZJ1菌體生長(zhǎng)量及發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.3 Effects of different carbon source culture medium on bacteria growth and bacteriostatic activity of fermentation broth of ZJ1 strain

2.1.4 菌株ZJ1最佳氮源的篩選菌株ZJ1在不同氮源條件下培養(yǎng)24、48 h后，菌體生長(zhǎng)量在牛肉膏+胰蛋白胨中顯著高于其他氮源（P＜0.05），72 h后菌體生長(zhǎng)量由大到小依次為牛肉膏+酵母粉+蛋白胨（2.56）＞牛肉膏+胰蛋白胨（2.55）＞蛋白胨（2.52）＞牛肉膏+蛋白胨（2.50）＞蛋白胨+酵母粉（2.48）＞胰蛋白胨+酵母粉（2.42）＞牛肉膏+酵母粉（2.31），在以牛肉膏+酵母粉+蛋白胨混配為氮源時(shí)顯著高于其他氮源（P＜0.05）。代謝產(chǎn)物對(duì)Monilinia laxa抑菌率由大到小依次為牛肉膏+蛋白胨（90.73%）＞胰蛋白胨+酵母粉（88.83%）＞牛肉膏+酵母粉+蛋白胨（88.79%）＞蛋白胨（88.54%）＞牛肉膏+酵母粉（86.57%）＞蛋白胨+酵母粉（86.53%）＞牛肉膏+胰蛋白胨（84.44%），以牛肉膏+蛋白胨混配為氮源的發(fā)酵濾液的抑菌率顯著高于其他培養(yǎng)基（P＜0.05），以胰蛋白胨+酵母粉、牛肉膏+酵母粉+蛋白胨和蛋白胨為氮源的發(fā)酵濾液的抑菌率之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）（圖4）。綜上，選定牛肉膏+酵母粉+蛋白胨為最佳氮源。

圖4 不同氮源培養(yǎng)基對(duì)菌株ZJ1菌體生長(zhǎng)量及發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.4 Effects of different nitrogen source culture medium on bacteria growth and bacteriostatic activity of fermentation broth of ZJ1 strain

2.1.5 菌株ZJ1最佳發(fā)酵溫度的篩選菌株ZJ1在不同溫度下培養(yǎng)24、48、72 h后菌體生長(zhǎng)量在30℃時(shí)都顯著高于其他溫度（P＜0.05），72 h后，菌體生長(zhǎng)量由大到小依次為30℃（2.56）＞35℃（2.14）＞28℃（2.08）＞26℃（1.95）。菌株對(duì)Monilinia laxa抑菌率由大到小依次為28℃（92.71%）＞30℃（79.09%）＞26℃（73.70%）＞35℃（72.46%），發(fā)酵濾液的抑菌率在溫度為28℃時(shí)顯著高于其他溫度（P＜0.05）。由圖5可知，在同一溫度下，不同時(shí)間發(fā)酵過(guò)程中菌株ZJ1隨著時(shí)間延長(zhǎng)菌體生長(zhǎng)量持續(xù)增加；同一時(shí)間不同溫度下，菌株ZJ1隨著溫度的增加菌體生長(zhǎng)量有明顯不同。綜上分析，28～30℃為菌株ZJ1的最佳發(fā)酵溫度。

圖5 不同發(fā)酵溫度對(duì)菌株ZJ1菌體生長(zhǎng)量及發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.5 Effects of different fermentation temperature on bacteria growth and bacteriostatic activity of fermentation broth of ZJ1 strain

2.1.6 菌株ZJ1發(fā)酵條件的優(yōu)化由表2極差分析可知，所選因素對(duì)ZJ1生長(zhǎng)量（OD600）的影響程度大小依次為pH（A）＞接種量（C）＞轉(zhuǎn)速（D）＞發(fā)酵時(shí)間（E）＞裝液量（B），最優(yōu)水平組合為A3B1C1D4E3，即內(nèi)生細(xì)菌ZJ1最佳培養(yǎng)條件為pH值3.0、裝液量100 mL/500 mL、接種量1%、轉(zhuǎn)速190 r/min、發(fā)酵時(shí)間72 h。

表2 菌株ZJ1發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)分析（OD600）Tab.2 Orthogonal experiment analysis of optimization of fermentation conditions of ZJ1 strain

表3所選因素對(duì)Monilinia laxa的抑制率影響程度大小依次為pH（A）＞裝液量（B）＞發(fā)酵時(shí)間（E）＞接種量（C）＞轉(zhuǎn)速（D），最優(yōu)水平組合為A4B1C1D1E4，即內(nèi)生細(xì)菌ZJ1最佳培養(yǎng)條件為pH值9.0、裝液量100 mL/500 mL、接種量1%、轉(zhuǎn)速100 r/min、發(fā)酵時(shí)間96 h。

表3 菌株ZJ1發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)分析（抑菌率）Tab.3 Orthogonal experiment analysis of optimization of fermentation conditions of ZJ1 strain（Bacteriostatic rate）

綜合方差分析和成本分析，選擇pH 7.0，裝液量100 mL/500 mL，接種量1%，轉(zhuǎn)速190 r/min，發(fā)酵時(shí)間72 h為正交試驗(yàn)優(yōu)化后菌株ZJ1的最佳發(fā)酵條件。

2.2 內(nèi)生細(xì)菌ZJ1發(fā)酵液穩(wěn)定性測(cè)定

2.2.1 熱穩(wěn)定性測(cè)定菌株ZJ1發(fā)酵液經(jīng)6個(gè)不同溫度處理30 min后對(duì)Monilinia laxa抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示（圖6），發(fā)酵液的抑菌率在20、40℃時(shí)顯著高于其他溫度（P＜0.05），其抑菌率達(dá)到86.55%；隨溫度的升高至60℃時(shí)，抑菌作用略有下降，但抑菌率仍保持在80%以上；當(dāng)溫度達(dá)到80℃以上后，抑菌作用明顯減弱，抑菌率最低降至55.72%。

不同小寫字母表示抑菌率在不同溫度下差異顯著（P＜0.05）。下圖同Different lowercase letters indicated significance of the difference in the bacteriostatic rate at different temperatures(P＜0.05).The same as below圖6溫度對(duì)菌株ZJ1發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.6 Effect of temperature on the bacteriostatic activity of fermentation filtrate of ZJ1 strain

2.2.2 酸堿穩(wěn)定性測(cè)定菌株ZJ1發(fā)酵液在不同酸堿度下對(duì)Monilinia laxa抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖7），發(fā)酵液的抑菌率在pH值為7.0時(shí)顯著高于其他pH值（P＜0.05），抑菌率為86.28%，當(dāng)酸堿性發(fā)生變化后，抑菌率出現(xiàn)明顯差異，但仍高于65%。

圖7 酸堿度對(duì)菌株ZJ1發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.7 Effect of different pH values on the bacteriostatic activity of fermentation filtrate of ZJ1 strain

2.2.3 紫外輻射穩(wěn)定性測(cè)定從圖8可以看出，菌株ZJ1發(fā)酵液在不同時(shí)長(zhǎng)的紫外燈照射后對(duì)Monilinia laxa仍有一定抑菌活性，隨著時(shí)間的增加，其抑菌作用略有下降，但是紫外輻射12 h后抑菌率仍然保持在70%以上，且與6 h無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明菌株ZJ1抑菌活性物質(zhì)在紫外燈照射下穩(wěn)定性較強(qiáng)。

圖8 紫外線照射對(duì)菌株ZJ1發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.8 Effect of UV radiation on the bacteriostatic activity of fermentation filtrate of ZJ1 strain

2.2.4 光穩(wěn)定性測(cè)定由圖9可知，菌株ZJ1發(fā)酵液經(jīng)不同時(shí)長(zhǎng)的白熾燈光照后對(duì)Monilinia laxa的抑菌活性沒(méi)有大幅波動(dòng)，其抑菌率總體保持在85%左右，發(fā)酵液的抑菌率在光照時(shí)間長(zhǎng)短下均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖9 光照對(duì)菌株ZJ1發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.9 Effect of light radiation on the bacteriostatic activity of fermentation filtrate of ZJ1 strain

2.2.5 貯存時(shí)間穩(wěn)定性測(cè)定由圖10可知，菌株ZJ1發(fā)酵液分別在室溫、4℃冷藏的環(huán)境下，經(jīng)不同時(shí)長(zhǎng)保存后對(duì)Monilinia laxa的抑菌率保持在80%以上，隨保存時(shí)間增加，抑菌作用無(wú)顯著差異（P＞0.05），但在相同時(shí)間點(diǎn)室溫比4℃條件的抑菌作用略有下降。因此，冷藏有利于菌株ZJ1的保存。

圖10 貯存時(shí)間對(duì)菌株ZJ1發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.10 Effect of storage time on the bacteriostatic activity of fermentation filtrate of ZJ1 strain

3 結(jié)論與討論

微生物發(fā)酵受不同因素影響，是動(dòng)態(tài)的生物學(xué)過(guò)程。本試驗(yàn)篩選出菌株ZJ1的最佳發(fā)酵條件為：YSP基礎(chǔ)培養(yǎng)基為最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基，乳糖為最佳C源，牛肉膏+酵母粉+蛋白胨為最佳N源，28～30℃為最佳發(fā)酵溫度，發(fā)酵時(shí)間72 h，裝液量100 mL/500 mL，接種量1%，轉(zhuǎn)速190 r/min，pH值7.0。

對(duì)菌株ZJ1的發(fā)酵液進(jìn)行測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，其吸光值高低與菌株生長(zhǎng)量呈正相關(guān)，且該發(fā)酵濾液的抑菌活性與濾液中抑菌物質(zhì)積累量呈正相關(guān)。通過(guò)對(duì)菌株ZJ1在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h菌體生長(zhǎng)曲線變化的研究表明，其與何藝琴等[5]對(duì)小麥內(nèi)生細(xì)菌XG-7對(duì)赤霉病菌生物學(xué)特性研究中菌體產(chǎn)量趨勢(shì)相符合，最初為遲緩期所需時(shí)間較少，菌株在適應(yīng)新環(huán)境避免死亡，并且為后續(xù)增值合成、積累充足的酶與能量，生長(zhǎng)緩慢；接著進(jìn)入對(duì)數(shù)期，穩(wěn)定而極快地大量繁殖；最后由于培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)物的蓄積、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗等環(huán)境的改變，死菌數(shù)增加，新繁殖的活菌數(shù)減少，二者逐漸平衡進(jìn)入穩(wěn)定期。微生物通過(guò)發(fā)酵可以大量積累代謝產(chǎn)物，適宜的培養(yǎng)條件與產(chǎn)量密切相關(guān)。劉京蘭等[17]對(duì)內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌CC09產(chǎn)Iturin A搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化的研究表明，發(fā)酵條件優(yōu)化后可提高抗菌脂肽Iturin A的產(chǎn)量；戴蓬博等[18]對(duì)極長(zhǎng)鏈霉菌SL01菌株抑菌活性物質(zhì)的發(fā)酵條件優(yōu)化和穩(wěn)定性研究表明，通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化，可以顯著提高SL01發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性，在中性環(huán)境以及40℃下菌株抑菌活性較穩(wěn)定，對(duì)光和紫外線不敏感。

本試驗(yàn)中，菌株ZJ1的發(fā)酵條件與蔣晶晶等[19]對(duì)貝萊斯芽孢桿菌X1-6-1發(fā)酵條件的優(yōu)化，楊可[20]對(duì)貝萊斯芽孢桿菌TCS001發(fā)酵條件優(yōu)化以及楊勝清[21]對(duì)貝萊斯芽孢桿菌S6發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果及穩(wěn)定性研究有一定差異：發(fā)酵所需的pH值基本都是7，菌株ZJ1與貝萊斯芽孢桿菌X1-6-1的發(fā)酵時(shí)間相同為72 h，與貝萊斯芽孢桿菌TCS001發(fā)酵所需的N源相同；菌株ZJ1的裝液量和接種量較上述3種菌株少，最佳發(fā)酵溫度不同；菌株ZJ1與藍(lán)莓潰瘍病生防鏈霉菌CX3及極長(zhǎng)鏈霉菌SL01都對(duì)光和紫外線不敏感，但藍(lán)莓潰瘍病生防鏈霉菌CX3較為耐堿，分析其差異可能是由菌株來(lái)源及其宿主植物不同、菌株結(jié)構(gòu)不同所引起的。由于田間很少出現(xiàn)強(qiáng)酸強(qiáng)堿以及超高溫環(huán)境，相對(duì)于常規(guī)貝萊斯芽孢桿菌來(lái)說(shuō)，田間環(huán)境適宜菌株ZJ1的發(fā)酵，且該菌株對(duì)溫度耐受性較好，可長(zhǎng)時(shí)間貯存。本研究結(jié)果可為菌株ZJ1開發(fā)成生物菌劑并應(yīng)用于田間奠定理論基礎(chǔ)。