鄧小果

(海南開放大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村學(xué)院，海南 ?？?570208)

黃花美冠蘭(Eulophia flava(lindley)Hookerf.)是一種觀賞價(jià)值很高的野生蘭科植物，其花葶側(cè)生，粗壯，高可達(dá)1m；總狀花序直立，長28～32cm，疏生10余朵花；單花輪生，每節(jié)著生3朵小花，節(jié)間距1.5cm左右；花大，黃色，直徑達(dá)4cm以上；花期5—6月。早在1987年，中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院在海南島花卉種質(zhì)資源考察中，就將黃花美冠蘭列為重點(diǎn)推薦的野生蘭種類[1]，引入海南熱帶植物園馴化栽培。黃花美冠蘭的組織培養(yǎng)[2]、核型分析[3]、切花保鮮[4]都有相關(guān)的研究。

化學(xué)誘變育種是用化學(xué)誘變劑處理植物材料，以誘發(fā)遺傳物質(zhì)的突變，從而引起形態(tài)特征的變異，然后根據(jù)育種目標(biāo)，對這些變異進(jìn)行鑒定、培育和選擇，最終育成新品種，成本低、操作簡單，能夠產(chǎn)生常規(guī)育種方法難以獲得的新基因和新性狀[5,6]。目前化學(xué)誘變主要應(yīng)用于對農(nóng)作物的處理，再通過多世代對突變體進(jìn)行選擇和鑒定，直接或間接地培育成生產(chǎn)上能利用的農(nóng)作物品種[7-9]。

觀賞植物在化學(xué)誘變中大多采用秋水仙素誘導(dǎo)多倍體[10-13]，蝴蝶蘭[14]、文心蘭[15]EMS離體化學(xué)誘變技術(shù)有相關(guān)報(bào)道，黃花美冠蘭EMS的離體化學(xué)誘變研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)采用組織培養(yǎng)與化學(xué)誘變技術(shù)相結(jié)合，通過液體浸泡法將不同濃度的EMS對黃花美冠蘭原球莖作不同時(shí)間處理，經(jīng)EMS處理后的原球莖再分化成苗。與傳統(tǒng)雜交育種選育，大大減輕了工作量，加快了選育進(jìn)程，拓寬了黃花美冠蘭新品種選育的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為海南大學(xué)提供的健壯的黃花美冠蘭原球莖。

1.2 誘變劑及培養(yǎng)基

1.2.1 誘變劑

EMS(甲基磺酸乙酯)為瑞士生產(chǎn)，將帶有刻度的燒杯和無菌水在121℃(1.1kg·cm-1)下滅菌30min，在超凈工作臺上用過濾滅菌器將EMS原液配成濃度分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% 5種濃度的溶液，隨用隨配。

1.2.2 培養(yǎng)基

增殖培養(yǎng)基：MS加BA 3.0mg·L-1加NAA 0.1mg·L-1加10%CM加AC 1g·L-1加蔗糖30g·L-1加瓊脂6g·L-1；分化培養(yǎng)基：MS加BA 3.0mg·L-1加NAA 0.1mg·L-1加土豆50g·L-1加AC 1g·L-1加蔗糖30g·L-1加瓊脂6g·L-1。

1.3 方法

1.3.1 EMS處理

選取生長旺盛，大小基本均勻的黃花美冠蘭原球莖，在超凈工作臺上用鑷子將其單個(gè)剝離，用不同濃度EMS的進(jìn)行處理。EMS處理濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%。處理時(shí)間為4h、6h、8h，處理后用無菌水沖液沖洗3～5次；以無菌水處理作為對照。

1.3.2 處理材料的培養(yǎng)

將處理后的原球莖接到增殖培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種40個(gè)原球莖，每個(gè)處理重復(fù)3次，所有材料均在同一條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度26±1℃，每天光照12h，30d后統(tǒng)計(jì)死亡率。培養(yǎng)過程中觀察原球莖的生長情況。

死亡率(%)=死亡原球莖數(shù)/接種原球莖數(shù)×100%

1.3.3 原球莖分化

將繼代后存活的原球莖繼續(xù)轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度26±1℃，每天光照12h，30d后觀察生長情況并統(tǒng)計(jì)分化率。

分化率(%)=分化成芽原球莖數(shù)/接種原球莖數(shù)×100%

1.3.4 EMS對黃花美冠蘭微核的影響

1.3.4.1 試驗(yàn)方法

濃度分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的EMS溶液；時(shí)間為4h、8h。對照(CK)不含EMS。

取接種3d后正處于生長旺盛期的原球莖，于4℃冰箱中，用卡諾氏固定劑(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1v/v)固定24h。置70%乙醇中保存。

1.3.4.2 染色制片

在室溫中用改良石灰酸品紅染液染色，常規(guī)壓片法制片。統(tǒng)計(jì)微核率。

MCN(%)=觀察到的MCN數(shù)/觀察的細(xì)胞總數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS對黃花美冠蘭原球莖生長的影響

將原球莖放入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%不同濃度的EMS濃度中浸泡4h、6h、8h后，接種到增殖培養(yǎng)基中，結(jié)果如表1。

各處理所得的原球莖死亡率在經(jīng)過反正弦角度代換在SAS系統(tǒng)上進(jìn)行鄧肯比較。得出，F(xiàn)=442.86，P<0.01，表明處理間的差異達(dá)極顯著。由表1可知，不同EMS濃度及處理時(shí)間對原球莖的存活有很大的影響。在EMS處理黃花美冠蘭原球莖過程中，隨著EMS處理濃度增大，處理的材料生理損傷較大，材料出現(xiàn)褐化，白化現(xiàn)象。經(jīng)過EMS處理的原球莖早期生長緩慢，14d后部分原球莖逐漸出現(xiàn)白化或褐化現(xiàn)象，并逐漸死亡。對照原球莖無白化現(xiàn)象，經(jīng)EMS誘變后的死亡率明顯高于對照組，在相同的處理時(shí)間內(nèi)，隨EMS濃度升高原球莖的死亡率升高明顯。相同濃度的長時(shí)間處理，死亡率明顯增加。在濃度為1.0%，處理時(shí)間為8h時(shí)，原球莖全部死亡。高濃度需要較短處理時(shí)間就可使原球莖致死，低濃度需要較長處理時(shí)間。

表1 黃花美冠蘭經(jīng)EMS處理后死亡率的方差分析

圖1 經(jīng)EMS處理后受損傷的原球莖

2.2 EMS處理對原球莖芽的分化的影響

將EMS處理過的原球莖轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，15d后，原球莖分化出芽，EMS對芽的誘導(dǎo)產(chǎn)生較大的影響。各處理所得的原球莖分化率在經(jīng)過反正弦角度代換在SAS系統(tǒng)上進(jìn)行鄧肯比較。得出，F(xiàn)=669.24，P<0.01，表明處理間的差異達(dá)極顯著。

由表2可知，處理時(shí)間長的分化率低于處理時(shí)間短的分化率。在相同的處理時(shí)間內(nèi)，隨著EMS濃度的增加，原球莖的分化率普遍呈現(xiàn)下降趨勢。在EMS處理相同的濃度下，所有處理組合的原球莖分化率都是隨著EMS處理時(shí)間的升高而降低。除了在處理濃度為0.4%時(shí)，時(shí)間為4h和6h下的原球莖分化率比EMS濃度為0.2%時(shí)的高。

表2 黃花美冠蘭原球莖經(jīng)EMS處理后分化率的方差分析

2.3 EMS處理原球莖后對細(xì)胞核的影響

EMS誘發(fā)黃花美冠蘭原球莖的細(xì)胞微核率及其統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3。各組所得微核百分率在經(jīng)過反正弦角度代換在SAS系統(tǒng)上進(jìn)行鄧肯比較。得出F=165.55，P<0.01。處理間的差異達(dá)到極顯著。從表3可以看出，對照沒有出現(xiàn)微核，用EMS處理過的原球莖都能產(chǎn)生微核，當(dāng)處理時(shí)間相同時(shí)，在0%～1.0%范圍內(nèi)，隨著濃度升高，原球莖細(xì)胞微核率提高，當(dāng)濃度相同時(shí)，隨著時(shí)間的延長，原球莖細(xì)胞微核率也提高，最高微核率出現(xiàn)在濃度為0.8%，處理時(shí)間為8h中，最低微核率出現(xiàn)在對照組中。本試驗(yàn)中觀察到的微核主要以單微核居多，也出現(xiàn)雙微核。微核的出現(xiàn)是由于上次有絲分裂過程中染色體受損形成的斷片或染色體活動(dòng)異常而造成的。

表3 EMS對黃花美冠蘭原球莖細(xì)胞微核數(shù)的誘變效應(yīng)

圖2 EMS處理原球莖后產(chǎn)生的細(xì)胞微核

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)將原球莖放入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%等不同濃度的EMS濃度中浸泡4h、6h、8h后，接種到增殖培養(yǎng)基中，觀察原球莖的生長情況和分化率。在培養(yǎng)過程中，原球莖的死亡率隨著濃度和時(shí)間的增加而增加，在濃度為0.4%處理時(shí)間為4h、6h，原球莖的分化率較好，說明原球莖在受損傷后，又恢復(fù)生長，其中可能包含較多的突變細(xì)胞。濃度為0.4%處理時(shí)間為8h和濃度為0.6%處理時(shí)間為6h時(shí)，原球莖的死亡率分別為52.91%和57.77%，約為對照50%，可作為創(chuàng)造黃花美冠蘭PLB突變體的參考濃度。通過對處理過的原球莖進(jìn)行細(xì)胞學(xué)上的觀察，發(fā)現(xiàn)處理后的細(xì)胞都出現(xiàn)了微核。

目前誘變的主要目的是獲得變異體，對于組培誘變體系的控制方向和定性、定量研究方面，目前開展的試驗(yàn)較少；變異性狀是否有利尚有待于后期的檢驗(yàn)和鑒定，變異體有效鑒定方法的研究也有待于進(jìn)一步研究和完善。因此，如何控制誘變方式和技巧以實(shí)現(xiàn)變異性狀的定向控制還需要深層次的研究。