蒲利云，王國(guó)福，楊明秋，汪 坤，李丙順，沈銘輝，夏光遠(yuǎn)，劉洪濤

( 海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，海南 海口 570206)

斧文蛤(Deshayes)，屬軟體動(dòng)物門(mén)，雙殼綱(Bivalvia)，簾蛤科(Veneridae)，文蛤?qū)?)，為暖水性經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)。在我國(guó)主要分布在廣東、廣西、海南和臺(tái)灣沿海，常埋棲于潮下帶至水深20 m左右的砂質(zhì)海底。斧文蛤成體個(gè)體大，肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者的青睞,是我國(guó)東南沿海一帶經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高、具有廣闊養(yǎng)殖開(kāi)發(fā)前景的貝類(lèi)。市面上出現(xiàn)的斧文蛤資源主要來(lái)源于天然海區(qū)的捕撈，由于過(guò)度捕撈及無(wú)繁殖保護(hù)措施等因素影響，其自然資源量急劇下降，但市場(chǎng)需求卻在不斷增加。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)斧文蛤的研究主要集中在系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)、分子標(biāo)記篩選與群體遺傳、營(yíng)養(yǎng)和受精生物學(xué)等方面的，而有關(guān)繁殖生物學(xué)的研究?jī)H見(jiàn)邵艷卿等和張炯明等開(kāi)展的斧文蛤生殖周期及早期發(fā)育和人工育苗試驗(yàn)，其他相關(guān)報(bào)道較少。因此，開(kāi)展斧文蛤親本的促熟與催產(chǎn)技術(shù)研究，填補(bǔ)斧文蛤促熟技術(shù)的空白，為斧文蛤種質(zhì)資源保護(hù)、穩(wěn)定生產(chǎn)人工苗種和苗種規(guī)?；庇峁┝嘶A(chǔ)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 斧文蛤親本 2021年4月 15日，在海南省馮家灣海域捕獲斧文蛤，挑選殼長(zhǎng)3.0～8 cm，體重5～30 g，殼表鮮艷、完整、雙殼閉合有力的個(gè)體作為親本，共1 200個(gè)。解剖觀察，成熟的斧文蛤親本卵巢呈淡黃色，精巢呈乳白色。

1.1.2 培育餌料 以人工培養(yǎng)的角毛藻()、鹽藻()、亞心形扁藻()及等單胞藻活餌料為主，輔以人工配合餌料綠藻粉、螺旋藻粉及干酵母片等。

1.1.3 親本培育池 本試驗(yàn)在海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院瓊?？蒲谢剡M(jìn)行，室外培育水泥池規(guī)格為10 m×1.5 m×1m(長(zhǎng)×寬×深)，池底鋪有細(xì)沙厚度約20 cm，備有充氣石。水泥池上方遮蓋帆布，可防雨防曬，用黑布在四邊圍起可調(diào)節(jié)水泥池亮度。

1.1.4 培育用水處理 從養(yǎng)殖基地岸邊向海里約200 m處區(qū)域設(shè)置取水口抽水，抽上來(lái)的海水，經(jīng)兩次沉淀、砂濾后直接用于親本培育。

1.2 方法

1.2.1 室外水泥池促熟培育法 斧文蛤親本運(yùn)抵基地后洗刷干凈，分別按照40、60、80、100和120個(gè)/m的密度進(jìn)行促熟培育，待培育30 d后比較其成活率和最終的成熟率。培育池水深為0.6～0.8 m，連續(xù)充氣。單胞藻類(lèi)活餌料每天投喂2次，人工配合餌料每天投喂3次。單胞藻類(lèi)活餌料日投餌量按不同培育密度分別為20、30、40、50及60萬(wàn)cells/mL，綠藻粉和螺旋藻粉日投餌量分別為8、12、16、20及24 mg/L；干酵母片日投喂量控制在1～5 mg/L。每天觀察親本活動(dòng)及死亡情況，及時(shí)清理排泄物和死亡的個(gè)體，日換水量為50%～70%，每5～7 d倒池1次。每隔7 d檢查親本性腺的變化情況。親本培育的水溫變化為25.5～30.5 ℃，海水比重在1.020～1.022之間，溶解氧保持在4 mg/L以上，pH值保持在7.8～8.2之間。

1.2.2 人工催產(chǎn)方法

將親本從培育池中撈出，并置于陰涼的地方干露刺激。

將親本放入小容量的玻璃缸或水桶中，注入海水并用加熱棒加熱，使水溫升高約為3 ℃，再用準(zhǔn)備好的冰袋降至常溫，反復(fù)連續(xù)2～3次的刺激。

利用藻液進(jìn)行刺激，即把親本放入容積約為500 L塑料盆中，注入120萬(wàn)cells/mL金藻()及100萬(wàn)cells/mL亞心形扁藻液，約40 min后，藻液顏色逐漸變清，且排放大量有條狀的糞便。

打開(kāi)誘導(dǎo)池排水閥門(mén)，用小型抽水泵往池壁處橫向沖水，并控制好水流壓力，使水能均勻地流過(guò)誘導(dǎo)池池底并對(duì)親本進(jìn)行刺激。

解剖數(shù)個(gè)達(dá)到成熟期的親本取其精子及卵子加入誘導(dǎo)池中，以刺激其它待排放的親本。

1.2.3 分組 根據(jù)以上五種催產(chǎn)方法，設(shè)計(jì)5個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)空白組，Ⅰ組:陰干刺激1.5 h；Ⅱ組:陰干刺激1.5 h+溫度刺激；Ⅲ組:陰干刺激1 h+溫度刺激+藻液刺激1 h。Ⅳ組:陰干刺激1 h+溫度刺激+藻液刺激1 h+流水刺激；Ⅴ組:陰干刺激1 h+溫度刺激+藻液刺激1 h+流水刺激+精卵誘導(dǎo)；空白組為置于水體環(huán)境條件較為穩(wěn)定的室內(nèi)水泥池中讓其自行排放，不采用陰干、溫度、藻液、流水及精卵等方法刺激。

1.2.4 產(chǎn)卵孵化 于5月16日挑選出已經(jīng)達(dá)到成熟期、外殼完整無(wú)破損，閉殼有力，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組親本為100個(gè)，用濃度為10×10的KMnO浸泡約5～10 min，再用過(guò)濾海水沖洗干凈，并置于產(chǎn)卵池待其排放。當(dāng)產(chǎn)卵完成后，及時(shí)移出親本，再經(jīng)過(guò)約3次洗卵，除去多余精液后，移入孵化池內(nèi)進(jìn)行孵化。觀察并記錄下不同實(shí)驗(yàn)組親本的開(kāi)始排放時(shí)間，比較其排放率、受精率及從受精卵發(fā)育至D型幼蟲(chóng)時(shí)出現(xiàn)的畸形率(下稱(chēng)幼蟲(chóng)畸形率)。

2 結(jié)果與分析

2.1 室外水泥池促熟培育

斧文蛤親本經(jīng)過(guò)30 d五種不同培育密度的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化、催熟培育，其最終的成活率及其成熟率的情況詳見(jiàn)表1，親本培育成活率最高的為94.15%，最低的僅為75.33%；而親本成熟率最高的為86.55%，最低的僅為62.46%。由此得出，在幾種不同的培育密度中，培育密度效果最好的是40個(gè)/m，而培育效果最差的密度為120個(gè)/m，并且隨著密度的增大，培育親本的成活率和成熟率均在逐漸地下降。此外，密度為40～80個(gè)/m的范圍時(shí)，其成活率及成熟率均比較接近。5月15日，解剖成熟的親本進(jìn)行觀察，其性腺非常飽滿，精巢呈乳白色，而卵巢則呈淡黃色，有手指輕輕一壓溢出大量游離的精子和卵子。在高分辨率的顯微鏡下觀察，精子細(xì)胞大多數(shù)已發(fā)育為成熟的精子，精子游動(dòng)頻繁，活力較為旺盛；而大多數(shù)卵黃形成后期卵母細(xì)胞已發(fā)育變成成熟的卵母細(xì)胞，卵子形狀正常。通過(guò)比較得出，利用室外水泥池對(duì)斧文蛤親本進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化培育，促使性腺發(fā)育成熟是可行的，并且培育密度控制在40～80個(gè)/m范圍時(shí)，均可獲得較好的培育效果。

表1 不同培育密度條件下最終的成活率及其成熟率的比較

2.2 親本人工誘導(dǎo)排放

斧文蛤親本在不同刺激強(qiáng)度和誘導(dǎo)步驟的作用下，被誘導(dǎo)后的開(kāi)始排放時(shí)間、排放率、受精率及幼蟲(chóng)畸形率的具體變化情況見(jiàn)表2。從空白組開(kāi)始，五個(gè)實(shí)驗(yàn)組伴隨著刺激強(qiáng)度和誘導(dǎo)步驟的加強(qiáng)及增加，親本從誘導(dǎo)后至精卵開(kāi)始排放所需要的時(shí)間越短，排放率也逐漸增加，而受精率則下降，幼蟲(chóng)畸形率也不斷地增加。這充分說(shuō)明空白組的親本由于沒(méi)有外部因素的刺激，屬于自然排放，只有性腺達(dá)到游離狀態(tài)時(shí)才能排放精卵；Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組試驗(yàn)組采用陰干、溫度及藻液一種或多種刺激方法的組合，大部分達(dá)到排放期的親本均能排放精子和卵子，從刺激后到精卵開(kāi)始排放需要的時(shí)間較長(zhǎng)，但由于排放的精子和卵子成熟度較好，因此，獲得比較高的受精率，且出現(xiàn)的幼蟲(chóng)畸形率也比較低；而Ⅳ試驗(yàn)組增加了流水刺激的步驟，Ⅴ組又在Ⅳ組強(qiáng)度的基礎(chǔ)上再增加了異性產(chǎn)物刺激，隨著刺激強(qiáng)度和步驟的增加，處于成熟期和部分尚未達(dá)到成熟的性腺都排放出精卵，雖然排放率提高了，但排放的精子和卵子由于成熟度不夠，因此，造成受精率的降低，且幼蟲(chóng)畸形率則相應(yīng)地增高。

表2 不同誘導(dǎo)方法作用下親本的排放率、受精率及其幼蟲(chóng)畸形率的比較

通過(guò)比較得出，采用陰干刺激1h+溫度刺激+藻液刺激1 h組合誘導(dǎo)時(shí)，只有發(fā)育到排放期的親本才排放精卵，且排放的精卵細(xì)胞成熟度好，受精率較高，幼蟲(chóng)畸形率則比較低。

3 討論

3.1 室外水泥池促熟培育

通過(guò)斧文蛤親本室外水泥池的培育結(jié)果得出，40個(gè)/m的培育密度的成活率和成熟率均為最高，120個(gè)/m的培育密度的成活率和成熟率均為最低，通過(guò)不同密度的比較得出，親本的成活率和成熟率隨著密度的增加而在不斷地降低。其原因主要有，首先，由于培育密度的增加，單位水體親本數(shù)量的增加及餌料投喂的增多，造成代謝產(chǎn)物及食物殘?jiān)牧恳苍谠黾樱觿×伺嘤w的亞硝酸和氨氮量含量在不斷地增加而造成部分親本的死亡，而降低培育的成活率；其次，親本在培育期間，由于親本個(gè)體性腺發(fā)育階段的不同步性，有個(gè)別率先發(fā)育至排放期的親本自然排放了精卵，產(chǎn)生異性產(chǎn)物刺激作用，促使其附近的其他達(dá)到成熟期的親本排放精卵，而影響親本最終的培育成熟率，且與密度低的培育池相比，密度較高的培育環(huán)境更容易發(fā)生該刺激作用。因此，高密度的培育池會(huì)出現(xiàn)較低成熟率。

梁飛龍等、謝玉坎分別進(jìn)行了大珠母貝()、翡翠貽貝()親本室內(nèi)水泥池促熟培育，利用小球藻(sp.)、巴夫藻()、扁藻、混合藻等為培育餌料進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化，均獲得了預(yù)期的效果。筆者前期利用室外水泥池，進(jìn)行古蚶和長(zhǎng)肋日月貝等雙殼貝類(lèi)親本的促熟培育，以鹽藻、扁藻、角毛藻等單胞藻餌料為主，輔以螺旋藻粉、綠藻粉等人工配合餌料，也獲得了預(yù)期的促熟效果。而本次培育斧文蛤也獲得預(yù)期的效果。

因此，利用室外水泥池促熟斧文蛤親本，其效果是非常顯著的。

3.2 親貝誘導(dǎo)排放

陰干刺激、溫度刺激、藻液刺激、流水刺激、異性產(chǎn)物刺激等誘導(dǎo)方法，作為大部分雙殼貝類(lèi)誘導(dǎo)精卵排放的最常用方法。一般情況下，使用多種方法組合比單一種方法誘導(dǎo)的效果要好。

本研究利用性腺發(fā)育至成熟期的斧文蛤親本，進(jìn)行了幾種不同組合的催產(chǎn)方法進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著刺激強(qiáng)度和誘導(dǎo)步驟的加強(qiáng)及增加，斧文蛤親本從誘導(dǎo)后至精卵開(kāi)始排放所需要的時(shí)間越短，排放率也逐漸增加，而受精率則下降，幼蟲(chóng)畸形率也相應(yīng)地提高了。這充分說(shuō)明了斧文蛤親本在多步驟、高強(qiáng)度的刺激作用下，促使一部分未發(fā)育至成熟期的精卵也排放出來(lái)，造成一些精卵不能受精或受精質(zhì)量較差，或部分受精后胚胎發(fā)育不能正常進(jìn)行或部分發(fā)育后變畸形等。與黃海立等對(duì)珠母貝親貝、張志強(qiáng)對(duì)馬氏珠母貝的催產(chǎn)研究及其筆者前期開(kāi)展古蚶和長(zhǎng)肋日月貝研究的結(jié)果一致。