李廣偉, 陳玉鑫, 閆 瑞, 雷怡雪, 陳秀琳1,, 李伯遼1,

(1. 陜西省紅棗重點實驗室(延安大學(xué)), 陜西延安 716000; 2. 延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 陜西延安 716000)

蘋褐帶卷蛾Adoxophyesorana，也稱蘋小卷葉蛾、蘋卷蛾、黃小卷葉蛾，屬鱗翅目(Lepidoptera)卷蛾科(Tortricidae)褐卷蛾屬Pandemis，是危害落葉果樹的一種重要害蟲(周建中等, 1997)。蘋褐帶卷蛾主要分布在亞洲、歐洲和大洋洲，如中國(Songetal., 2014)、韓國(Choetal., 2010; Choietal., 2004)、日本(Parketal., 2008)、希臘(Milonas and Savopoulou-Soultani, 2006)、捷克斯洛伐克(Kocourek and Stará, 2005)、土耳其(Pehlevan and Kovanci, 2017)、新西蘭(Ankersmitetal., 2009)等國家。蘋褐帶卷蛾在國內(nèi)分布遍及東北、華北、華中、西北、西南等地區(qū)。蘋褐帶卷蛾為多食性昆蟲，可危害蘋果Malusdomestica、桃Prunuspersica、梨Pyrusspp.、杏Armeniacaspp.、李Prunussalicina、棗Zizyphusjujuba等30余種植物(Kocourek and Stará, 2005; 孫麗娜等, 2015a; 李廣偉等, 2019)，由于蘋褐帶卷蛾發(fā)生期對寄主植物葉片啃食嚴(yán)重，故通常被認(rèn)為是一種食葉性害蟲，然而該蟲除為害寄主植物葉片外，還可為害花、嫩枝和果實(Pehlevan and Kovanci, 2014; 孫麗娜等, 2015b)，對果實品質(zhì)造成影響繼而導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。隨著陜西省蘋果種植面積的不斷擴大，蘋褐帶卷蛾的危害呈逐年上升趨勢，對該蟲預(yù)測預(yù)報、高效治理技術(shù)的研究亟待開展。目前，雖然尚未見關(guān)于蘋褐帶卷蛾抗藥性的報道，但長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥必然會引發(fā)蘋褐帶卷蛾幼蟲的抗性問題，探索綠色、無公害的監(jiān)測預(yù)警和防治技術(shù)迫在眉睫。

利用植物源引誘劑誘捕是目前監(jiān)測和綠色防控害蟲的一種有效手段，已在多種害蟲的治理中得到廣泛應(yīng)用(Greggetal., 2010; Gharaeietal., 2020)。目前，對蘋褐帶卷蛾生物學(xué)方面的研究較多(孫麗娜等, 2015a; 李廣偉等, 2019; Lietal., 2021)，但有關(guān)蘋褐帶卷蛾嗅覺通訊機制、植物源引誘劑研發(fā)方面的研究鮮有報道。在我國北方地區(qū)，蘋果、桃、梨、杏和棗是蘋褐帶卷蛾最主要的寄主植物，蘋果、桃、西洋梨Pyruscommunis葉片揮發(fā)物以小分子量的醛、醇、酯、萜烯類物質(zhì)為主，且相同的化學(xué)成分在3種果樹揮發(fā)物中重疊較多(Piero and Dorn, 2009; Luetal., 2015; Strapassonetal., 2016)。1-戊烯-3-醇、反-2-己烯醇、異丁醛、棕櫚酸甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯、油酸甲酯和α-水芹烯是棗樹揮發(fā)物中的特異性物質(zhì)(閻雄飛等, 2020)。杏葉片和嫩枝揮發(fā)物中己醛、α-蒎烯、莰烯和3-蒈烯的含量較其他4種果樹高(Zhuetal., 2020)?；谇叭搜芯炕A(chǔ)，本研究選取了蘋果、桃、梨、杏和棗樹葉片和嫩枝釋放的51種揮發(fā)性化合物，測定了蘋褐帶卷蛾成蟲對不同揮發(fā)性化合物的觸角電位(electroantennogram, EAG)反應(yīng)，利用嗅覺雙向選擇試驗測定了對成蟲具有較高EAG反應(yīng)活性揮發(fā)性化合物的行為反應(yīng)，篩選出對成蟲具有引誘活性的揮發(fā)性化合物。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

本試驗所用試蟲為繼代飼養(yǎng)的蘋褐帶卷蛾室內(nèi)種群，蟲源首次采自延安市甘泉縣下寺灣鎮(zhèn)的蘋果園，每年6-9月用蘋果葉片飼喂幼蟲，10月-翌年5月改用桑葉飼喂，成蟲羽化后用5%蜂蜜水補充營養(yǎng)，每年采集田間種群對室內(nèi)種群進行復(fù)壯。飼養(yǎng)條件：溫度25±1℃、相對濕度60%±5%、光周期15L∶9D。本試驗選用試蟲的方法為：待老熟幼蟲化蛹后，將其單獨置于一指形管中(直徑12 mm、高100 mm)并用脫脂棉封口，待成蟲羽化后分雌雄置于250 mL的一次性塑料杯中飼養(yǎng)，并飼喂5%蜂蜜水補充營養(yǎng)。取2日齡健康、活躍的未交配成蟲作為供試?yán)ハx。

1.2 供試揮發(fā)性化合物

參照前人對蘋果(Strapassonetal., 2016)、桃(Piero and Dorn, 2009; Najar-Rodriguezetal., 2013)、梨(Luetal., 2015)、杏(Zhuetal., 2020)和棗(閻雄飛等, 2020)5種蘋褐帶卷蛾主要寄主植物揮發(fā)物鑒定的文獻報道，結(jié)合本實驗室對木棗、富士蘋果葉片揮發(fā)性化合物種類的鑒定結(jié)果，在以上5種寄主植物揮發(fā)物中共選取51種化合物進行EAG反應(yīng)測定，在此基礎(chǔ)上選擇能激發(fā)成蟲顯著EAG反應(yīng)的15種揮發(fā)性化合物進行嗅覺行為選擇試驗。供試揮發(fā)性化合物化學(xué)合成品的名稱、純度和來源見表1，以上揮發(fā)性化合物均使用液體石蠟進行溶解和稀釋，液體石蠟(CAS: 8042-47-5)購自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

表1 供試51種寄主植物揮發(fā)性化合物信息

1.3 對固定劑量揮發(fā)性化合物的觸角電位反應(yīng)測定

蘋褐帶卷蛾對固定劑量揮發(fā)性化合物的EAG反應(yīng)測定參照Topazzini等(1990)和Tian等(2018)的方法進行。首先將待測化合物用液體石蠟稀釋至10 mg/mL的貯備液并置于-20℃冰箱保存待用。使用眼科剪將成蟲觸角從基部剪下，用鋒利刀片在解剖鏡下切除觸角鞭節(jié)端部的鞭小節(jié)，然后使用導(dǎo)電膠(Signa Gel, Parker Laboratories Inc.)將觸角兩端分別固定在2個Syntech PR 05電極上，觸角電位信號經(jīng)過Syntech IDA232放大后與主機相連，通過EagPro V2.0.2軟件記錄觸角電位反應(yīng)的振幅值。將濾紙剪成長4 cm、寬0.5 cm的紙帶，然后緊貼1 mL槍頭內(nèi)壁置入其中，向凹形的紙帶中間位置滴加20 μL(化合物有效成分含量200 μg)待測貯備液，為防止化合物污染氣味管，紙帶上沿距離1 mL槍頭開口不小于6 mm。然后調(diào)節(jié)觸角與氣味刺激管開口距離約1 cm，加濕的連續(xù)氣體和脈沖刺激氣體均由Syntech CS-55刺激氣流發(fā)生器控制，連續(xù)氣體的流量為450 mL/min，脈沖刺激氣體流量為120 mL/min，每種化合物的刺激時間設(shè)置為0.5 s，為了消除觸角連續(xù)刺激造成的系統(tǒng)誤差，兩次刺激間隔時間不小于60 s。每根觸角測定69種化合物，化合物的刺激順序隨機排列，每種化合物重復(fù)測定10根以上觸角的有效數(shù)據(jù)，每一試蟲僅使用其中一根觸角。 測定每種化合物前、后均需測定以液體石蠟為對照的EAG反應(yīng)絕對值(分別記為EAGCK1和EAGCK2)，成蟲對不同化合物的EAG反應(yīng)相對值=處理EAG反應(yīng)絕對值-(EAGCK1+EAGCK2)/2。為方便闡述成蟲對寄主植物揮發(fā)性化合物EAG反應(yīng)的強弱，規(guī)定如果EAG反應(yīng)相對值≥1 mV，表示對某種揮發(fā)性化合物具有強烈的EAG反應(yīng)活性；0.5 mV≤EAG反應(yīng)相對值<1 mV，則表示具有較強的EAG反應(yīng)活性；0.3 mV≤EAG反應(yīng)相對值<0.5 mV，則表示具有中等程度的EAG反應(yīng)活性；EAG反應(yīng)相對值<0.3 mV，則表示EAG反應(yīng)活性較弱。

1.4 對不同劑量揮發(fā)性化合物刺激的觸角電位反應(yīng)測定

在測定蘋褐帶卷蛾成蟲對固定劑量揮發(fā)性化合物EAG反應(yīng)強度的基礎(chǔ)上，選擇能夠激發(fā)雌蟲或雄蟲產(chǎn)生最大EAG反應(yīng)的15種揮發(fā)性化合物進行劑量梯度刺激的觸角電位反應(yīng)試驗。將待測化合物用液體石蠟配制成0.001, 0.01, 0.1, 1.0, 10.0和100.0 mg/mL 6種不同濃度的刺激物貯備液。按照與1.3節(jié)中相同的方法制備氣味源，使之不同劑量梯度的氣味源載有化合物有效成分的含量分別為0.02, 0.2, 2.0, 20, 200和2 000 μg，同種物質(zhì)不同劑量梯度刺激物的測定順序為從低劑量到高劑量進行，測定每種劑量的刺激物前、后均需測定以液體石蠟刺激為對照的EAG反應(yīng)值。一根觸角測定一種化合物的劑量反應(yīng)，每種劑量梯度的化合物重復(fù)測定10根觸角的有效反應(yīng)值。

1.5 室內(nèi)行為反應(yīng)測定

利用本實驗室發(fā)明的小型蛾類昆蟲嗅覺行為選擇測試裝置(ZL201821473705.5)，測定蘋褐帶卷蛾成蟲對15種具有顯著EAG反應(yīng)活性揮發(fā)性化合物的室內(nèi)行為反應(yīng)。嗅覺行為測定裝置的組成構(gòu)件：抽氣裝置、氣流流量控制裝置、空氣凈化裝置、行為測試裝置和光照控制裝置，所有部件用四氟乙烯管連接，氣流的方向依次為：微型空氣泵、活性炭過濾柱、氣體流量計、蒸餾水加濕裝置、氣味源誘集室、喇叭形連接管，最后通入試蟲活動室。測試時將整個行為裝置置于光照控制室內(nèi)，控制室頂面、兩側(cè)面和前側(cè)各布置3個8 W的冷光源白熾燈管，控制室外覆蓋黑色布遮光。試蟲感受氣味物質(zhì)刺激后產(chǎn)生行為反應(yīng)：如果氣味源物質(zhì)對試蟲有引誘作用，試蟲會逆著氣味流動的方向經(jīng)喇叭形連接管進入氣味源誘集室；如果氣味源物質(zhì)對試蟲有驅(qū)避作用，試蟲會逃避氣味刺激，呈現(xiàn)向釋放口附近聚集的現(xiàn)象；如果氣味源物質(zhì)對試蟲沒有作用，試蟲不會表現(xiàn)出明顯的趨避反應(yīng)。具體操作方法為：待蘋褐帶卷蛾老熟幼蟲化蛹后，將單頭蛹置于指形管中并用脫脂棉封口，成蟲羽化后分雌雄分別置于一次性塑料杯內(nèi)飼養(yǎng)，并飼喂5%蜂蜜水補充營養(yǎng)。將2日齡成蟲在20:00-22:00時段移入測試室并適應(yīng)30 min，然后將1 mL 10 mg/mL(有效成分含量10 mg)的化合物貯備液加入帶孔的內(nèi)填有脫脂棉的小瓶內(nèi)，然后將其置于氣味源室。用液體石蠟刺激作為對照。將行為測試裝置緊密連接，確保無漏氣發(fā)生。然后開通氣泵，調(diào)節(jié)流量計的氣流速度至700 mL/min。第2日8:00分別記錄進入氣味源室、對照室的成蟲數(shù)量。每種化合物重復(fù)測定3次，每次30頭試蟲。每組試驗結(jié)束后使用無水乙醇清洗所有玻璃管件和四氟乙烯管，然后置于60℃烘箱烘干待用。根據(jù)公式：選擇率(%)=選擇味源室總蟲數(shù)/(選擇味源室總蟲數(shù)+選擇對照室總蟲數(shù))×100%計算試蟲的選擇率。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 23.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。利用單因素方差分析結(jié)合S-N-K法多重比較檢驗蘋褐帶卷蛾成蟲對同種類型不同揮發(fā)性化合物之間EAG反應(yīng)相對值的差異顯著性以及同一物質(zhì)不同劑量梯度之間的EAG反應(yīng)的差異顯著性。利用獨立樣本t檢驗分析雌、雄蟲對同種揮發(fā)性化合物EAG反應(yīng)的差異顯著性，成對樣本t檢驗分析成蟲選擇氣味源室和空白對照氣味源室的選擇率的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 對固定劑量寄主植物揮發(fā)性化合物的EAG反應(yīng)

蘋褐帶卷蛾成蟲對51種寄主植物揮發(fā)性化合物的觸角電位反應(yīng)結(jié)果見圖1。雌成蟲(F=29.63;df=12, 165;P<0.0001)和雄成蟲(F=15.28;df=12, 152;P<0.0001)對13種醇類化合物的EAG反應(yīng)活性存在明顯差異，雌蟲對1-己醇的EAG反應(yīng)相對值最大(0.572±0.050 mV)，顯著高于對其他同類物質(zhì)的EAG反應(yīng)值(P<0.05)；對順-3-己烯-1-醇、反-2-己烯-1醇、1-庚醇、異辛醇的EAG反應(yīng)活性呈中等水平(EAG反應(yīng)相對值介于0.366～0.478 mV之間)，對1-癸醇、正十四醇、正十六醇、橙花叔醇的反應(yīng)最弱(EAG反應(yīng)相對值小于0.14 mV)；雄蟲對3-甲基-1-丁醇、1-戊烯-3-醇、順-3-己烯-1-醇、反-2-己烯醇、1-己醇和1-庚醇的反應(yīng)較強(EAG反應(yīng)相對值均大于0.50 mV)，對正十六醇和橙花叔醇的反應(yīng)最弱(EAG反應(yīng)相對值均小于0.02 mV)(圖1: A)。雌雄成蟲對同種醇類物質(zhì)的反應(yīng)存在差異，如雄蟲對3-甲基-1-丁醇(t=-3.317,df=21,P=0.003)、1-癸醇(t=-3.546,df=24,P=0.002)和正十四醇(t=-3.969,df=24,P=0.001)的EAG反應(yīng)相對值極顯著強于雌蟲，雄蟲對1-戊烯-3-醇(t=-2.958,df=22,P=0.015)、順-3-己烯-1-醇(t=-2.427,df=21,P=0.024)和芳樟醇(t=-2.494,df=24,P=0.020)的EAG反應(yīng)相對值顯著強于雌蟲(圖1: A)。與對其他種類化合物的EAG反應(yīng)相比，蘋褐帶卷蛾成蟲對醛類物質(zhì)的EAG反應(yīng)相對值整體最高，雌雄蟲對己醛、庚醛、辛醛和反-2-己烯醛的EAG反應(yīng)相對值介于0.75～1.30 mV之間，屬51種化合物中反應(yīng)最為強烈的化合物。雄蟲對己醛(t=-2.299,df=19,P=0.033)、庚醛(t=-2.752,df=19,P=0.013)、苯甲醛(t=-3.117,df=19,P=0.006)、癸醛(t=-2.468,df=19,P=0.023)、十二醛(t=-5.376,df=19,P<0.0001)的EAG反應(yīng)顯著強于雌蟲(圖1: B)。在待測的18種酯類物質(zhì)中，雌蟲對乙酸丁酯、丙酸丁酯、乙酸異戊酯、乙酸-順-3-己烯酯、丁酸丁酯、水楊酸甲酯的EAG反應(yīng)相對值中等大小，介于0.32～0.49 mV之間;雄蟲對乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸丁酯、乙酸-順-3-己烯酯、丁酸丁酯、己酸乙酯、異戊酸-順-3-己烯酯、三甲基巴豆酸乙酯的EAG反應(yīng)相對值較大，介于0.52～0.71 mV之間(圖1: C)。除雌、雄蟲對丁酸丁酯(t=-1.676,df=18,P=0.111)、梨酯(t=0.760,df=18,P=0.414)、水楊酸甲酯(t=-0.776,df=18,P=0.448)、鄰苯二甲酸二丁酯(t=2.841,df=18,P=0.111)、油酸甲酯(t=-1.249,df=18,P=0.228)和棕櫚酸甲酯(t=-2.216,df=18,P=0.826)的EAG反應(yīng)相對值無顯著差異外，雄蟲對其他12種酯類物質(zhì)的EAG反應(yīng)顯著強于雌蟲(圖1: C)。蘋褐帶卷蛾雌、雄成蟲對萜烯類化合物的EAG反應(yīng)均較弱，對α-羅勒烯、α-蒎烯、β-石竹烯、3-蒈烯、(-)-α-水芹烯、β-月桂烯、角鯊烯和莰烯8種化合物的EAG反應(yīng)相對值均小于0.30 mV。雌成蟲對(-)-α-水芹烯(t=2.227,df=18,P=0.039)和莰烯(t=3.431,df=18,P=0.003)的EAG反應(yīng)相對值顯著強于雄蟲(圖1: D)。在待測的2種腈類和1種烯烴化合物中，雄蟲對苯甲腈(t=-6.696,df=18,P<0.0001)和檸檬腈(t=-5.669,df=18,P<0.0001)的EAG反應(yīng)較強(EAG反應(yīng)相對值分別為0.699±0.064和0.730±0.057 mV)，且顯著強于雌蟲(EAG反應(yīng)相對值分別為0.247±0.022和0.356±0.034 mV)，雌雄蟲對2-甲基-1-苯基丙烯的反應(yīng)均較弱，且兩者之間無顯著差異(t=1.698,df=18,P=0.107)(圖1: E)。

圖1 蘋褐帶卷蛾成蟲對51種寄主植物揮發(fā)性化合物的EAG反應(yīng)

2.2 對不同劑量寄主植物揮發(fā)性化合物的EAG反應(yīng)

從51種揮發(fā)性化合物中選擇了反-2-己烯-1-醇、順-3-己烯-1-醇、1-己醇、反-2-己烯醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、苯甲醛、乙酸丁酯、乙酸異戊酯、三甲基巴豆酸乙酯、乙酸-順-3-己烯酯、苯甲腈和檸檬腈15種能夠激發(fā)蘋褐帶卷蛾雌蟲或雄蟲最強EAG反應(yīng)的化合物，測定了成蟲對不同劑量化合物刺激的EAG反應(yīng)。由圖2可知，當(dāng)化合物劑量從0.02 μg增大至2 μg時，雌、雄蟲對各種化合物的EAG反應(yīng)相對值無顯著變化，表明2 μg的化合物并沒有達到觸角的反應(yīng)閾值(圖2: A-O)；當(dāng)化合物劑量達20 μg時，雌、雄蟲對反-2-己烯-1-醇、順-3-己烯-1-醇、反-2-己烯醛、己醛、辛醛、壬醛，雄蟲對苯甲醛的EAG反應(yīng)相對值顯著增大(圖2: A-E, I, M)，對其他8種化合物的EAG反應(yīng)強度增大不明顯；當(dāng)化合物劑量增大至200 μg時，雌雄蟲對所有化合物的EAG反應(yīng)相對值顯著增強(圖2: A-O)；當(dāng)化合物劑量達2 000 μg時，雌雄蟲對反-2-己烯-1-醇、雄蟲對順-3-己烯-1-醇和苯甲醛的EAG反應(yīng)相對值不再增大(圖2: A, B, I, M)，表明化合物的刺激量達到了飽和，雌、雄蟲對其他化合物的EAG反應(yīng)相對值較前一劑量的化合物相比仍顯著增大，尚無法判斷2 000 μg的化合物刺激量是否達到EAG最大反應(yīng)值(圖2: B-O)。

圖2 蘋褐帶卷蛾成蟲對15種不同劑量梯度揮發(fā)性化合物的EAG反應(yīng)

2.3 對部分EAG反應(yīng)活性揮發(fā)物的行為反應(yīng)

選擇了能激發(fā)蘋褐帶卷蛾雌成蟲或雄成蟲最強EAG反應(yīng)的15種寄主植物揮發(fā)物，包括順-3-己烯-1-醇、反-2-己烯-1-醇、1-己醇、己醛、反-2-己烯醛、庚醛、辛醛、壬醛、苯甲醛、己酸-順-3-己烯酯、乙酸異戊酯、乙酸丁酯、三甲基巴豆酸乙酯、苯甲腈和檸檬腈，進行了行為選擇試驗。由圖3可以看出，蘋褐帶卷蛾雌蟲對己醛、庚醛、辛醛和乙酸-順-3-己烯酯的選擇率相對較高，分別達69.70%±1.47%, 63.80%±3.95%, 60.57%±3.65%和58.33%±3.29%。 同時成對樣本t檢驗表明雌蟲選擇己醛、庚醛、辛醛和乙酸-順-3-己烯酯氣味源的總蟲數(shù)顯著高于選擇對照組氣味源的總蟲數(shù)(P<0.05)，表明雌蟲對以上4種單體揮發(fā)物具有明顯的正趨性(圖3: A)。雄蟲對1-己醇、庚醛、乙酸異戊酯和苯甲腈的選擇率較高，分別達62.16%±3.19%, 57.28%±1.61%, 59.01%±2.06%和57.86%±2.00%，成對樣本t檢驗亦表明雄蟲選擇1-己醇、庚醛、乙酸異戊酯和苯甲腈氣味源的總蟲數(shù)顯著高于選擇對照組氣味源的總蟲數(shù)(P<0.05)，揭示以上4種揮發(fā)物對雄蟲具有明顯的引誘活性(圖3: B)。蘋褐帶卷蛾成蟲對其他待測單體揮發(fā)物無明顯趨性。在以上15種待測揮發(fā)物中，未檢測到對成蟲具有驅(qū)避作用的化合物。

圖3 蘋褐帶卷蛾雌(A)和雄(B)成蟲對15種寄主植物揮發(fā)物的行為反應(yīng)

3 討論

昆蟲觸角電位技術(shù)通過電位信號放大系統(tǒng)可直接記錄昆蟲對揮發(fā)性信息化學(xué)物質(zhì)的電生理反應(yīng)，具有很高的選擇性和靈敏性，能對不同種類、不同濃度的揮發(fā)物刺激做出反應(yīng)，是目前篩選性信息素及其類似物、寄主植物揮發(fā)物活性物質(zhì)的重要手段(閆鳳鳴, 2011)。本研究發(fā)現(xiàn)蘋褐帶卷蛾成蟲對供試51種寄主植物揮發(fā)物中的29種揮發(fā)物的EAG反應(yīng)具明顯性別差異。雌蟲僅對(-)-α-水芹烯和莰烯的EAG反應(yīng)顯著高于雄蟲，對剩余27種揮發(fā)性化合物的EAG反應(yīng)均顯著低于雄蟲(圖1: A-E)。這表明蘋褐帶卷蛾雄成蟲對寄主植物揮發(fā)物的刺激響應(yīng)更加靈敏。一般來講，昆蟲特別是雌性昆蟲更加依賴寄主植物釋放的揮發(fā)物來定位最佳的營養(yǎng)寄主和產(chǎn)卵寄主植物以完成卵的發(fā)育及子代幼蟲(或若蟲)的生長(Sunetal., 2014)，雌蟲常常對寄主植物揮發(fā)物的EAG反應(yīng)振幅更大、更靈敏，如小菜蛾P(guān)lutellaxylostella雌蟲對反-2-己烯醛、反-2-己烯-1-醇、庚醛、異硫氰酸-2-苯乙酯等的EAG反應(yīng)明顯強于雄蟲(Wuetal., 2020)，馬鈴薯麥蛾P(guān)hthorimaeaoperculella雌成蟲對27種馬鈴薯莖和葉片揮發(fā)物中的25種化合物的EAG反應(yīng)相對值顯著強于雄蟲(Dasetal., 2007)。然而，蘋褐帶卷蛾近緣種蘋果褐卷蛾Epiphyaspostvittana雄成蟲對29種寄主植物揮發(fā)物中的大部分化合物其EAG反應(yīng)值強于雌蟲(Sucklingetal., 1996)；蘋果蠹蛾Cydiapomonella雄成蟲對26種從蘋果樹(品種: Golden Smothee)不同生長時期采集鑒定到的揮發(fā)物的EAG反應(yīng)相對值均強于雌蟲(Casadoetal., 2006)；此外，也有報道有些昆蟲對寄主植物揮發(fā)物的反應(yīng)沒有明顯的性別差異。如葡萄花翅小卷蛾Lobesiabotrana雌雄成蟲對寄主植物葡萄Vitisvinifera和大戟瑞香Daphnegnidium葉片揮發(fā)物的EAG反應(yīng)無顯著差異(Pérez-Aparicioetal., 2019)。綜上可以看出，不同種類鱗翅目昆蟲的雌雄蛾對寄主揮發(fā)物的反應(yīng)存在差異。

蘋褐帶卷蛾成蟲對不同類型揮發(fā)物的EAG反應(yīng)活性存在差異，如雄蟲對醛類、腈類揮發(fā)物的平均EAG反應(yīng)相對值整體較高(分別為0.726和0.715 mV)，對酯類和醇類揮發(fā)物的平均EAG反應(yīng)相對值中等(分別為0.452和0.399 mV)，對萜烯類揮發(fā)物的EAG反應(yīng)相對值較低(0.178 mV)(圖1: A-E)?；衔锕倌軋F是引起成蟲對不同類型揮發(fā)物EAG反應(yīng)強度產(chǎn)生差異的原因之一，如反-2-己烯-1-醇、1-己醇和1-庚醇與反-2-己烯醛、己醛和庚醛在結(jié)構(gòu)組成上分別僅為官能團羥基和醛基的差異，但雄成蟲對反-2-己烯醛(0.937±0.076 mV)、己醛(1.251±0.084 mV)和庚醛(1.259±0.105 mV)的EAG反應(yīng)相對值分別顯著高于對反-2-己烯-1-醇(0.503±0.060 mV)、1-己醇(0.630±0.078 mV)和1-庚醇的(0.551±0.052 mV)(圖1: A-B)。此外，氣味分子碳鏈長度也是影響成蟲對揮發(fā)物EAG反應(yīng)強弱的因素，如異丁醛、己醛(反-2-己烯醛)、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛和十二醛的碳鏈依次增長，雄蟲對以上相同劑量揮發(fā)物刺激的EAG反應(yīng)相對值呈先增大后減小的趨勢[EAG反應(yīng)相對值分別為0.137±0.028, 1.251±0.084(0.937±0.076), 1.259±0.105, 1.017±0.096, 0.746±0.061, 0.425±0.053和0.254±0.030 mV]，碳鏈長度介于C6-C9的醛類物質(zhì)具有較高的EAG反應(yīng)相對值。氣味分子的官能團和碳鏈長度之所以影響昆蟲EAG反應(yīng)的強弱，主要在于刺激昆蟲觸角的氣味分子通過擴散作用進入位于觸角感覺器的極孔后能否被觸角感覺器淋巴液中的運輸?shù)鞍兹鐨馕督Y(jié)合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)或化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)結(jié)合并轉(zhuǎn)運其通過觸角淋巴液的疏水屏障到達嗅覺感受神經(jīng)元(olfactory receptor neurons, ORNs)，從而激活ORNs產(chǎn)生電脈沖(Pelosi and Maida, 1995; Zhouetal., 2009; Fleischeretal., 2018; Jiaetal., 2021)。OBPs和CSPs蛋白具有6個α螺旋形成的狹長結(jié)合口袋(Zhengetal., 2015; Younasetal., 2018)，揮發(fā)物氣味分子能否進入結(jié)合口袋并被轉(zhuǎn)運主要受氣味分子碳鏈長度以及構(gòu)成官能團的某種原子與位于結(jié)合蛋白口袋開口處的關(guān)鍵氨基酸殘基形成特殊的化學(xué)鍵而“鎖著”氣味分子(Thodeetal., 2008; Gaubertetal., 2020)。此外，昆蟲觸角表面分布著不同類型的感覺器，研究已證實分布在毛形感器、錐形感器和耳狀感器內(nèi)的ORNs可以響應(yīng)不同寄主植物揮發(fā)物的刺激(Ammagarahalli and Gemeno, 2015; MacKayetal., 2015; Cuietal., 2018)，由于昆蟲觸角上不同類型的感覺器的數(shù)量和密度存在差異，加之浸漬在每種感覺器內(nèi)部的ORNs的數(shù)量也不僅相同，導(dǎo)致昆蟲對不同類型及其同種類型不同分子量大小的寄主植物揮發(fā)物的EAG反應(yīng)存在較大差異。

EAG反應(yīng)強弱表明昆蟲對揮發(fā)性刺激物的敏感程度，暗示這些化合物的存在可能導(dǎo)致昆蟲產(chǎn)生驅(qū)避或吸引行為，嗅覺行為選擇試驗?zāi)軌蜻M一步明確揮發(fā)物對昆蟲的具體作用(閻雄飛等, 2020)。此次選擇了對蘋褐帶卷蛾成蟲具有強烈EAG反應(yīng)活性的15種揮發(fā)物進行了行為選擇試驗，發(fā)現(xiàn)僅有己醛、庚醛、辛醛和乙酸-順-3-己烯酯4種揮發(fā)物對雌蟲具有明顯的室內(nèi)引誘效果，1-己醇、庚醛、乙酸異戊酯和苯甲腈對雄蟲表現(xiàn)出顯著的室內(nèi)吸引作用，其他具有EAG反應(yīng)活性的揮發(fā)物均對雌雄蟲無明顯的引誘或驅(qū)避作用(圖3)。絕大部分寄主植物釋放的揮發(fā)物種類多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不同種類的揮發(fā)物以一定比例和濃度存在，構(gòu)成了某種植物特有的化學(xué)氣味指紋圖譜(Barataetal., 2002; 馬艷等, 2018)。昆蟲通過感受和識別寄主植物揮發(fā)物中由若干種組分以特定比例組成的混合物來定位營養(yǎng)寄主和產(chǎn)卵寄主植物(Luetal., 2012)，昆蟲基于嗅覺選擇行為對寄主植物的趨性反饋往往是通過辨別若干種揮發(fā)物形成的特定混合組分來實現(xiàn)的。如桃梢揮發(fā)物乙酸-順-3-己烯酯、順-3-己烯-1-醇、苯甲醛、反-2-己烯醛和苯甲腈均能夠激發(fā)梨小食心蟲雌成蟲強烈的EAG反應(yīng)，單組分化合物均對雌成蟲無明顯引誘作用，但當(dāng)以上5種揮發(fā)物以質(zhì)量比為69.74∶14.62∶13.24∶2.25∶0.15組成的混合物對雌成蟲表現(xiàn)出與天然桃梢揮發(fā)物相同的吸引力(Pind and Dorn, 2007)；煙草揮發(fā)物反-β-羅勒烯、乙酸-順-3-己烯酯、庚醛和反-β-石竹烯以質(zhì)量比為0.25∶0.06∶0.1∶0.5(mg)組成的4組分混合物對已交配煙青蟲Helicoverpaassulta雌蟲具有與寄主植物揮發(fā)物相當(dāng)?shù)奈芰?Sunetal., 2012)。本試驗僅僅測試了15種單體揮發(fā)性化合物對蘋褐帶卷蛾的引誘能力，具有EAG反應(yīng)活性的揮發(fā)性化合物組成的混合物對蘋褐帶卷蛾成蟲的引誘能力尚不清楚，有待進一步深入研究。

行為選擇試驗從蘋褐帶卷蛾雌雄蛾中分別篩選出4種化合物對其有吸引作用，但其中僅庚醛對雌雄蛾均有吸引作用，而其他揮發(fā)性化合物僅對單一性別的成蟲有吸引作用，表明雌雄蛾對寄主植物揮發(fā)物的行為反應(yīng)存在很大差異，同種寄主植物吸引雌雄蟲的揮發(fā)物組成并不相同，開發(fā)植物源引誘劑時應(yīng)針對雌雄蟲分別進行活性揮發(fā)物的篩選。本試驗篩選到的己醛、庚醛、辛醛、乙酸-順-3-己烯酯、1-己醇、苯甲腈等揮發(fā)性化合物作為行為活性組分已在其他鱗翅目昆蟲中得到驗證(Piro and Dorn, 2007; Uefuneetal., 2017; Lietal., 2020)。乙酸異戊酯屬于桃梢和果實中含量較低的揮發(fā)物，能夠激發(fā)蘋褐帶卷蛾雌雄蛾較強烈的EAG反應(yīng)，但僅對雄蛾具有引誘活性，推測乙酸異戊酯是吸引蘋褐帶卷蛾雄蟲的特異性物質(zhì)。乙酸異戊酯是西方蜜蜂Apismellifera釋放的警戒信息素組分，能夠刺激它們做出攻擊或者防御行為(Bochetal., 1962; Boch and Shearer, 1966)；金龜子Oplostomusharoldi以西方蜜蜂釋放的乙酸異戊酯為嗅覺信號尋找蜂巢進而搶食幼蜂(Fombongetal., 2016)。乙酸異戊酯作為寄主植物揮發(fā)物引誘昆蟲的研究尚未見報道，乙酸異戊酯為什么對蘋褐帶卷蛾雄蛾具有引誘作用，而對雌蛾無引誘活性，尚需要借助昆蟲觸角單感覺器測量系統(tǒng)(single sensillum recording, SSR)測定雌雄蟲觸角上不同感覺器對乙酸異戊酯響應(yīng)的不同以及觸角中嗅覺相關(guān)蛋白對該物質(zhì)的識別能力的差異。

本研究利用EAG反應(yīng)試驗篩選了大量對蘋褐帶卷蛾雌雄蛾具有電生理活性的揮發(fā)性化合物，通過雙向行為選擇試驗發(fā)現(xiàn)1-己醇、己醛、庚醛、辛醛、乙酸-順-3-己烯酯、乙酸異戊酯和苯甲腈7種揮發(fā)性化合物對雌蛾或者雄蛾具有明顯的室內(nèi)引誘活性，是開發(fā)植物源引誘劑的潛在化合物。今后應(yīng)在此工作的基礎(chǔ)上，利用“差減”組合試驗進一步篩選對蘋褐帶卷蛾成蟲具有田間高效誘集作用的揮發(fā)物組分配方，開發(fā)植物源引誘劑嘗試開展蘋褐帶卷蛾的綠色無公害治理。