蘇麗娟, 趙鵬飛, 杜運(yùn)良, 關(guān)宇梁, 郭瑞瑤, 陰正興, 宋安東,*

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 鄭州 450002; 2. 大壩(河南)工程技術(shù)有限公司, 鄭州 450018;3. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院, 鄭州 450046)

由于白蟻的等級(jí)多型性、共生微生物、生態(tài)位置和以木質(zhì)纖維素為食的特殊能力，其長(zhǎng)期以來(lái)吸引著生物學(xué)家和研究者為之著迷(Bignell, 2019; Vargo, 2019; Miura and Maekawa, 2020)。由于白蟻與腸道微生物互作及其營(yíng)養(yǎng)生理和生態(tài)等因素使白蟻能夠克服木頭頑固的降解屏障，從而以木質(zhì)纖維素為食，這些微生物包括真核原生動(dòng)物、細(xì)菌和古菌，另外還有一些白蟻存在與巢真菌的外部共生關(guān)系(Brune, 2014; Bignell, 2019; Scharf, 2021)。白蟻的食性廣泛，喜食腐殖化程度高的食物，主要包括枯木、雜草、枯枝落葉、有機(jī)質(zhì)泥土等食物。其中木質(zhì)纖維素通常是指50%～65%的碳水化合物(纖維素和半纖維素)、20%～25%的酚類(木質(zhì)素、單脂醇及其他酚類)、～20%的其他成分如植物次生代謝物和很少量的蛋白(Lange, 2007; Scharf and Tartar, 2008)。其中對(duì)白蟻來(lái)說(shuō)最難降解的是植物次生代謝物(包括多聚乙酰、生物堿、香豆素、糖苷、木脂素、黃酮類、二苯乙烯類、單寧類、萜類和環(huán)庚三烯酚酮等)，木質(zhì)素和相關(guān)的酚類，以及結(jié)晶纖維素，但是白蟻腸道具有強(qiáng)大的解毒酶和抗氧化機(jī)制，可以用來(lái)降解這些有毒成分(Tartaretal., 2009; Sethietal., 2013; Friedmanetal., 2020)。關(guān)于碳水化合物，纖維素和半纖維素聚合物含有β-糖苷鍵，需要白蟻腸道內(nèi)特異性的酶水解，這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、半纖維素酶、酯酶和其他糖苷水解酶(Sethietal., 2013; Scharf, 2015a)。另外，由于木材中的氮含量很低，僅有0.03%～0.10%，因此白蟻生長(zhǎng)中所需要的氨基酸通過(guò)腸道內(nèi)共生的固氮菌來(lái)解決(Bar-Shmueletal., 2020)。

迄今為止人們對(duì)白蟻消化生理的研究從對(duì)其胃腸道結(jié)構(gòu)的理解發(fā)展到纖維素酶等相關(guān)酶和蛋白的解讀，對(duì)腸道內(nèi)蛋白的研究主要集中在木質(zhì)纖維素酶的研究：一是從組學(xué)水平對(duì)木質(zhì)纖維素酶進(jìn)行鑒定和分析；二是對(duì)酶進(jìn)行克隆、表達(dá)和酶學(xué)特性的分析，以期得到能夠開發(fā)利用的酶。白蟻腸道內(nèi)容物中受關(guān)注的木質(zhì)纖維素酶最多，比如白蟻的后腸共生菌Trinervitermestrinervoides的宏基因組結(jié)果發(fā)現(xiàn)25個(gè)纖維素酶和半纖維素酶，包括14個(gè)糖苷水解酶家族蛋白，即8個(gè)GH5, 4個(gè)GH9, 以及2個(gè)GH13, GH2或GH10等，其中有內(nèi)切纖維素酶、外切纖維素酶、木聚糖內(nèi)切酶和α-巖藻糖苷酶等(Rashamuseetal., 2017; Wuetal., 2021)。文獻(xiàn)報(bào)道有100多種經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增再經(jīng)過(guò)異源重組表達(dá)的白蟻或共生的消化酶，占據(jù)絕大多數(shù)的是糖基水解酶(glycosyl hydrolase, GH)(95%)，還有少數(shù)的酚氧化酶/木質(zhì)素酶和酯酶。糖基水解酶主要包括GHF9(42%), GHF5(28%), GHF7(11%), GHF45(9%), GHF1(6%)和GHF11(2%)等(Scharf, 2015b)。

另外有研究報(bào)道不同食物導(dǎo)致白蟻腸道菌群數(shù)量、種類發(fā)生改變。例如，用草質(zhì)和木質(zhì)食物飼喂黃肢散白蟻Reticulitermesflaviceps，腸道菌群結(jié)構(gòu)變化不大，但用農(nóng)作物玉米秸稈飼喂時(shí)，菌群數(shù)量、種類都發(fā)生大幅度減少，可能是木頭和玉米秸稈相比，其三素結(jié)合形式、含量都有很大差異，導(dǎo)致白蟻對(duì)食物喜好選擇性不同，也證明白蟻對(duì)不同食物降解時(shí)存在底物特異性(Huangetal., 2013; Wangetal., 2016; Suetal., 2017)。又由于白蟻腸道內(nèi)的木質(zhì)纖維素酶一部分來(lái)源于白蟻?zhàn)陨?，一部分由腸道微生物分泌，為白蟻降解木質(zhì)纖維素的研究增加了復(fù)雜性和難度(Vargo, 2019)，因此對(duì)底物特異性降解的研究有待于進(jìn)一步深入。本研究用3種飼料(松木、秸稈、濾紙)飼養(yǎng)近暗散白蟻Reticulitermesperilucifugus工蟻，通過(guò)雙向電泳聯(lián)合MALDI-TOF/TOF對(duì)比分析工蟻腸道前中腸和后腸蛋白質(zhì)變化，確定白蟻工蟻腸道蛋白組成如何響應(yīng)不同營(yíng)養(yǎng)成分的變化，為進(jìn)一步了解白蟻的營(yíng)養(yǎng)消化吸收及其調(diào)控機(jī)理，也為挖掘白蟻生物系統(tǒng)中的高效降解酶提供參考。

1 材料與方法

1.1 白蟻采集及樣品準(zhǔn)備

近暗散白蟻采自河南省信陽(yáng)商城縣金剛臺(tái)鄉(xiāng)(31°76′N, 115°54′E)，采集到的白蟻首先進(jìn)行物種鑒定，包括外部形態(tài)(黃復(fù)生等, 2000)和分子鑒定(彭一丁等, 2017)。然后在黑暗、25℃左右、相對(duì)濕度>50%的條件下飼養(yǎng)備用。取3齡以上的白蟻工蟻分3組(每組3個(gè)重復(fù))，放入底部為1%瓊脂、上面加入適量的松木(木質(zhì)素18.5%，纖維素和半纖維素66.2%)、秸稈(木質(zhì)素11.8%，纖維素和半纖維素62.3%)或者濾紙碎屑(纖維素和半纖維素99.9%)的塑料盒中飼養(yǎng)兩周。取白蟻工蟻置于冰盒上，用解剖針從白蟻泄殖口輕輕拉出腸道，將其分為前中腸(前腸和中腸兩段)和后腸兩部分(圖1)，分別裝入2 mL Eppendorf管中，管內(nèi)添加100 mmol/L PBS，5 mmol/L EDTA和1 mmol/L PMSF蛋白酶抑制劑1 mL，-20℃保存?zhèn)溆谩２煌暳巷曫B(yǎng)時(shí)需要解剖的白蟻頭數(shù)不同，松木飼養(yǎng)時(shí)前中腸需要約2 000頭、后腸約1 000頭，秸稈飼養(yǎng)時(shí)前中腸需要約3 500頭、后腸約1 800頭，濾紙飼養(yǎng)時(shí)前中腸需要約3 000頭、后腸約2 000頭。

圖1 近暗散白蟻工蟻腸道解剖示意圖

1.2 腸道及其內(nèi)容物蛋白的提取和純化

取前面解剖的2 mL Eppendorf管中近暗散白蟻工蟻腸道樣品，4℃ 12 000 g離心15 min，上清置于另一2 mL Eppendorf管中。沉淀中加入200 μL蛋白提取液及研磨粉(美國(guó)Invent Biotechnologies公司)，研磨3 min，冰浴5 min，加入第一步上清液定量到2 mL，渦旋混勻。冰浴5 min后4℃ 12 000 g離心15 min，取上清(避開漂浮在上邊脂肪層)。加50% TCA-冰丙酮(TCA-丙酮∶樣品=1∶2, v/v)搖勻，-20℃放置10 min。之后轉(zhuǎn)到4℃靜置1 h左右，4℃ 13 000 g離心10 min。倒掉上清，扣至吸水紙上，控干液體。加冰丙酮沖洗3次，每一次需要渦旋儀震蕩，使蛋白沉淀充分分散。3次沖洗間隔6 h，最后一次過(guò)夜，每次可見白色粉末狀沉淀。沖洗完畢后，放干蛋白(一定要保證干燥，但不能放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使其結(jié)塊，影響蛋白水化)。之后加300 μL水化液，手動(dòng)渦旋轉(zhuǎn)速。水化時(shí)間定在8 h左右，放置在30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，每隔1 h渦旋1 min。之后20℃ 22 527 g離心15 min，取上清。離心后根據(jù)Bradford法(1976)計(jì)算蛋白濃度。上樣量在2 000 μg，溶液在100～200 μL之間。

1.3 雙向電泳

蛋白樣品置室溫溶解，加入水化液(6 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，65 mmol/L DTT，4% CHAPS， 0.2% Bio-Lyte)充分混勻。用冷凍保存的線性IPG預(yù)制膠條(11 cm，pH 4-7)，室溫放置10 min，沿著聚焦盤的邊緣從左到右線性加入等量(體積和質(zhì)量)的蛋白樣品，蛋白樣品加入時(shí)需要連貫，保證沒(méi)有氣泡，膠條放置時(shí)來(lái)回拉動(dòng)使樣品和膠條充分結(jié)合。膠條上方覆蓋礦物油，加滿聚焦盤，防止膠條水化過(guò)程中液體的蒸發(fā)。分清正負(fù)極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極(標(biāo)有+)對(duì)應(yīng)于聚焦盤的正極，對(duì)好正負(fù)極，設(shè)置等電聚焦程序。

等電聚焦程序?yàn)椋弘娏鞅ＷC不超過(guò)50 μA，S1 50 V主動(dòng)水化12 h→S2 200 V線性1 h→S3 1 000 V快速1 h→S4 9 000 V線性2 h升壓→S5 9 000 V聚焦8 h→S6 500 V快速，保持12 h，聚焦結(jié)束的膠條用超純水潤(rùn)洗，輕輕沖去膠條表面礦物油，轉(zhuǎn)移至平衡管中，加入5 mL平衡緩沖液A[50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)，6 mol/L尿素，30%甘油，2% SDS，1% DTT(現(xiàn)加現(xiàn)用)，0.2%溴酚藍(lán)溶液]，放上水平搖床上搖晃15 min。取出膠條后轉(zhuǎn)移到平衡緩沖液B中[50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)，6 mol/L尿素，30%甘油，2% SDS，1.5%碘乙酰胺(現(xiàn)加現(xiàn)用)，0.2%溴酚藍(lán)溶液]，放上水平搖床上搖晃15 min。平衡完畢進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳，配制12%分離膠和4%濃縮膠進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳。恒溫15℃，先用低電壓100 V/3 W/10 min、后用180 V/12 W/3 h 40 min電泳，考馬斯亮藍(lán)R250溶液染色膠，冰乙酸脫色后凝膠成像。

1.4 生物信息學(xué)分析和MALDI-TOF/MS測(cè)序

染色后的凝膠用PD Quest軟件分析圖譜，比較不同飼料白蟻前中腸和后腸中差異蛋白的灰度值，確認(rèn)其顯著差異的蛋白(灰度比值大于1.5倍)。用雙向電泳的至少2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)計(jì)算樣品膠中蛋白質(zhì)點(diǎn)分子量和等電點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)值。選取差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，用滅菌和去頭的黃色槍頭沿著染色邊緣切下差異蛋白點(diǎn)放入Eppendorf管中，進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解，即測(cè)序級(jí)胰蛋白酶Trypsin 溶液酶解，用串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(5800 MALDI-TOF/TOF, AB SCIEX)進(jìn)行測(cè)試分析。

用MALDI-TOF/MS的數(shù)據(jù)采集軟件Flexcontro 1 3.0對(duì)樣品孔的數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，每孔取10個(gè)進(jìn)行激光點(diǎn)擊其不同位置。運(yùn)用數(shù)據(jù)庫(kù)World-2D PAGE, UniProt, ExPASy, NCBI和GenBank等對(duì)生物信息進(jìn)行收集、加工、存儲(chǔ)、分析與解析的方法來(lái)詮釋實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 腸道及其內(nèi)容物蛋白點(diǎn)的豐度

2.1.1同種飼料飼養(yǎng)時(shí)前中腸和后腸中蛋白豐度比較: 近暗散白蟻工蟻用松木、秸稈和濾紙飼養(yǎng)的前中腸及其內(nèi)容物蛋白的雙向電泳圖譜如圖2(A, B, C)，后腸及其內(nèi)容物蛋白的見圖2(D, E, F)。用PD Quest軟件分析發(fā)現(xiàn)，松木飼養(yǎng)時(shí)前中腸共有412個(gè)可辨蛋白點(diǎn)(圖2: A),后腸共有301個(gè)可辨蛋白點(diǎn)(圖2: D)，豐度值差異在1.5倍以上的有251個(gè);秸稈飼養(yǎng)時(shí)前中腸共有351個(gè)可辨蛋白點(diǎn)(圖2: B),后腸共268個(gè)可辨蛋白點(diǎn)(圖2: E)，豐度值差異在1.5倍以上的有194個(gè);濾紙飼養(yǎng)時(shí)前中腸共有395個(gè)可辨蛋白點(diǎn)(圖2: C),后腸共296個(gè)可辨蛋白點(diǎn)(圖2: F),豐度值差異在1.5倍以上的有201個(gè)。

2.1.2不同飼料飼養(yǎng)時(shí)腸道相同部位中蛋白豐度的比較：不同飼料飼養(yǎng)時(shí)近暗散白蟻前中腸對(duì)比(圖2: A, B, C)發(fā)現(xiàn)，松木飼養(yǎng)與秸稈飼養(yǎng)相比差異蛋白點(diǎn)(差異點(diǎn)均為1.5倍以上的蛋白點(diǎn))123個(gè),松木飼養(yǎng)與濾紙飼養(yǎng)相比差異蛋白點(diǎn)106個(gè),濾紙飼養(yǎng)與秸稈飼養(yǎng)相比差異蛋白點(diǎn)75個(gè)。對(duì)不同飼料飼養(yǎng)時(shí)近暗散白蟻后腸中差異蛋白對(duì)比(圖2: D, E, F)發(fā)現(xiàn)，松木飼養(yǎng)與秸稈飼養(yǎng)相比差異蛋白點(diǎn)112個(gè)，松木飼養(yǎng)與濾紙飼養(yǎng)相比差異蛋白點(diǎn)93個(gè)，秸稈飼養(yǎng)與濾紙飼養(yǎng)相比差異蛋白點(diǎn)63個(gè)。

近暗散白蟻工蟻腸道雙向電泳圖譜結(jié)果顯示相同飼喂條件時(shí)前中腸可辯蛋白點(diǎn)明顯多于后腸；3種飼料飼喂時(shí)前中腸和后腸雙向電泳圖譜可辨蛋白點(diǎn)多少均依次是松木飼養(yǎng)>濾紙飼養(yǎng)>秸稈飼養(yǎng)；其中有21個(gè)相同蛋白點(diǎn)共同存在于6張膠圖上，表達(dá)量雖有所變化，但均是豐度值高的蛋白。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，飼料從用野外的松木變?yōu)闉V紙時(shí)，工蟻前中腸和后腸的可辨蛋白點(diǎn)分別減少17和5個(gè)，而飼料從野外的松木變?yōu)榻斩挄r(shí)，工蟻前中腸和后腸的可辨蛋白點(diǎn)分別減少61和36個(gè)。

2.2 腸道及其內(nèi)容物蛋白的鑒定和差異

根據(jù)飼養(yǎng)條件的不同、前中腸和后腸的差異，選取蛋白點(diǎn)豐度比值在1.5倍以上的膠點(diǎn)，同時(shí)避免選取存在有條紋和豐度很高的蛋白點(diǎn)進(jìn)行扣點(diǎn)和MALDI-TOF/TOF鑒定分析，之后對(duì)蛋白質(zhì)用UniProt和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。扣點(diǎn)部位如圖2中紅色數(shù)字所示，測(cè)序結(jié)果見表1。蛋白點(diǎn)測(cè)序結(jié)果按功能分別進(jìn)行歸類，主要為具有催化活性的蛋白、細(xì)胞組成蛋白和信號(hào)傳導(dǎo)蛋白(圖3)，其中前中腸和后腸均是具有催化活性的蛋白最多，分別占45.65%和48.28%，包括碳代謝、糖酵解、纖維素降解和丙酮酸代謝相關(guān)酶等；細(xì)胞組成蛋白次之，分別是34.78%和37.93%。

圖2 木質(zhì)纖維素含量不同的3種飼料飼養(yǎng)的近暗散白蟻工蟻前中腸和后腸內(nèi)容物的雙向電泳圖譜

通過(guò)對(duì)差異蛋白的分析發(fā)現(xiàn)，不同飼料飼喂的近暗散白蟻前中腸和后腸的主要差異蛋白質(zhì)為具有催化活性的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)包括與氨基酸代謝、丙酮酸代謝、碳代謝、TCA循環(huán)、糖酵解、糖異生、氮代謝、纖維素降解相關(guān)的酶及一些具有其他催化活性的蛋白質(zhì)(圖3)。松木飼養(yǎng)時(shí)前中腸上調(diào)的蛋白質(zhì)有38個(gè)，后腸上調(diào)12個(gè)；秸稈飼養(yǎng)時(shí)前中腸和后腸上調(diào)的各有7個(gè)；濾紙飼養(yǎng)的前中腸上調(diào)的有2個(gè)，后腸上調(diào)的有10個(gè)(表1)。

表1 近暗散白蟻工蟻用不同飼料飼養(yǎng)時(shí)腸道及其內(nèi)容物差異蛋白的MALDI-TOF/TOF鑒定結(jié)果

圖3 雙向電泳鑒定的木質(zhì)纖維素含量不同的3種飼料飼養(yǎng)的近暗散白蟻工蟻腸道蛋白質(zhì)分類

其中,松木飼養(yǎng)時(shí)前中腸上調(diào)的蛋白有腺苷酸琥珀酸裂解酶(圖2中A1)、蘋果酸脫氫酶(A6)、二氫硫辛酸脫氫酶(A7)、烯醇化酶(A8)、丙酮酸脫氫酶E1(A11)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(A15)、唾液纖維素酶(A28)和磷酸甘油酸變位酶2(A44)等;濾紙與秸稈飼養(yǎng)前中腸均上調(diào)的有熱激蛋白70(A5)、伴侶蛋白DnaK(A5)、DNA聚合酶delta催化亞基(A22)、過(guò)氧化氫酶(A25)和碳酸酐酶(B7)等。

松木飼養(yǎng)時(shí)后腸上調(diào)的蛋白有熱激蛋白70(D1)、伴侶蛋白Dnak(F9)、碳酸酐酶(A13)和異檸檬酸脫氫酶(D6)等；秸稈飼養(yǎng)時(shí)后腸上調(diào)的蛋白有碳酸酐酶(B7)、蛋白酶α亞基(E4)和內(nèi)切葡聚糖酶(E9)等； 濾紙飼養(yǎng)時(shí)后腸上調(diào)的蛋白有醛酮還原酶(F2)、蛋白酶β亞基(F3)、過(guò)氧化物酶1(F7)、伴侶蛋白Dnak(F9)、蘋果酸酶(F11)和羧酸酯水解酶(F12)等。

3 討論

白蟻可以將難以降解的木質(zhì)纖維素作為其食物來(lái)源，其腸道內(nèi)的內(nèi)源性酶或共生菌分泌的酶協(xié)同將食物的纖維素和半纖維素成分分解轉(zhuǎn)化為葡萄糖和戊糖，這些單糖再由白蟻或共生菌吸收進(jìn)行身體必需的代謝(Brune and Ohkuma, 2011)。但是由于木材中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)和含量不同，導(dǎo)致白蟻飼用不同的食物時(shí)，腸道內(nèi)微生物的組成發(fā)生變化(Bouciasetal., 2013; Huangetal., 2013; Raychoudhuryetal., 2013)。本研究發(fā)現(xiàn)，近暗散白蟻用不同營(yíng)養(yǎng)成分的飼料飼養(yǎng)時(shí)，其腸道內(nèi)的蛋白可辨膠點(diǎn)數(shù)量也發(fā)生變化，依次是松木飼養(yǎng)的工蟻>濾紙飼養(yǎng)的工蟻>秸稈飼養(yǎng)的工蟻，3種條件下前中腸蛋白質(zhì)可辨膠點(diǎn)明顯多于后腸；在從野外的松木變?yōu)闉V紙時(shí)，其前中腸和后腸的可辨膠點(diǎn)的減少數(shù)明顯低于從松木變?yōu)榻斩?圖2)。另外飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)用濾紙和秸稈飼養(yǎng)時(shí)，白蟻體型變小。綜合分析白蟻的飼養(yǎng)、腸道微生物和蛋白的結(jié)果，推測(cè)由于秸稈和松木的結(jié)構(gòu)成分不同，用秸稈飼養(yǎng)時(shí)，其腸道內(nèi)的蛋白成分、微生物組成改變，導(dǎo)致其生長(zhǎng)明顯受阻。而濾紙由于缺少木質(zhì)素，結(jié)構(gòu)松散，纖維素酶容易結(jié)合，白蟻對(duì)它的適應(yīng)相對(duì)較好，但是和秸稈相比，由于成分單一，導(dǎo)致白蟻的腸道微生物、蛋白結(jié)構(gòu)及生長(zhǎng)均介于松木和秸稈中間。

一直以來(lái)，大家認(rèn)為白蟻降解木質(zhì)纖維素主要是依賴其后腸內(nèi)共生的細(xì)菌和原生動(dòng)物，由共生物分泌的酶參與木質(zhì)纖維素的降解和其他代謝過(guò)程(Bignell, 2011; Hongoh, 2011; Ni and Tokuda, 2013)。但越來(lái)越多的轉(zhuǎn)錄組、基因組和重組酶的證據(jù)詮釋了白蟻?zhàn)陨矸置诘拿傅膮f(xié)同消化能力(Scharf and Tartar, 2008; Scharf, 2015a)，根據(jù)這些不斷深入的研究，我們理解白蟻通過(guò)腸道內(nèi)數(shù)十種酶的共進(jìn)化進(jìn)行協(xié)同消化，這些酶包括纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、磷酸酶和輔助酶(漆酶、醛酮還原酶等)(Scharf, 2015b)。因此本實(shí)驗(yàn)得到了115個(gè)蛋白點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果，這里面具有催化活性的蛋白占比將近一半，包括與氨基酸代謝、丙酮酸代謝、碳代謝、糖代謝和氮代謝等相關(guān)的酶。

通過(guò)對(duì)松木、濾紙和秸稈對(duì)近暗散白蟻前中腸和后腸的蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)松木飼養(yǎng)前中腸上調(diào)的蛋白質(zhì)有參與氨基酸代謝、碳代謝及三羧酸循環(huán)的酶(表1)，這些酶都是白蟻及其腸道共生物生存必需的酶。比如腺苷酸琥珀酸裂合酶主要參與嘌呤代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，這些氨基酸都是一些常見的生糖氨基酸(Zurloetal., 2019)。蘋果酸脫氫酶和二氫硫辛酸脫氫酶主要進(jìn)行丙酮酸代謝和碳代謝，丙酮酸在三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝聯(lián)系中起著重要的樞紐作用(Moonetal., 2015)。線粒體丙酮酸脫氫酶E1進(jìn)行TCA循環(huán)，此循環(huán)為白蟻機(jī)體提供能量的同時(shí)，也為其他代謝提供中間產(chǎn)物(Vastanoetal., 2014)。磷酸丙糖異構(gòu)酶是一種能夠催化丙糖磷酸異構(gòu)體在二羥丙酮磷酸和D型甘油醛-3-磷酸之間轉(zhuǎn)換的酶，主要進(jìn)行糖酵解和糖異生代謝，此代謝通路不但能釋放能量，也能讓機(jī)體在逆境條件下應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫(Rodríguez-Bolaos and Perez-Montfort, 2019)。唾液纖維素酶主要在木質(zhì)纖維素酶降解初級(jí)階段隨機(jī)水解非結(jié)晶區(qū)的纖維素，且只在松木飼養(yǎng)前中腸發(fā)現(xiàn)，這可能與底物特異性有關(guān)，證明此酶可以很好地和松木結(jié)合。另外還有一些參與醛類、芳香類等木質(zhì)素降解中產(chǎn)生的有毒成分的解毒蛋白，比如線粒體醛脫氫酶(ALDH2)具有脫氫酶和酯酶等多種酶功能，ALDH2在輔助因子NADP+的參與下將醛類物質(zhì)脫氫成為相應(yīng)的羧酸，對(duì)減輕醛類物質(zhì)對(duì)機(jī)體的毒性作用具有重要意義(Dingetal., 2019)。

熱激蛋白70參與應(yīng)激反應(yīng)，超氧化物歧化酶可以減少木質(zhì)素消化時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞色素的自由基，可以清除白蟻體內(nèi)由木質(zhì)素降解產(chǎn)生的有害代謝物(Fetherolfetal., 2017)。在濾紙與秸稈飼養(yǎng)的近暗散白蟻工蟻前中腸中熱激蛋白70、伴侶蛋白DnaK、過(guò)氧化氫酶均上調(diào)(表1)，表明白蟻的飼料有野外的松木變?yōu)榻斩捇蛘邽V紙后，白蟻都需要?jiǎng)訂T體內(nèi)的應(yīng)激蛋白來(lái)響應(yīng)飼料的變化。秸稈飼養(yǎng)時(shí)前中腸上調(diào)的蛋白質(zhì)碳酸酐酶具有調(diào)節(jié)體液pH的作用，同時(shí)參與氮代謝通路(Lindskog, 1997)，可能是白蟻需要合成更多的氮素以應(yīng)對(duì)飼料的變化。

內(nèi)切葡聚糖酶只在秸稈后腸飼養(yǎng)中表達(dá)，可能是改變白蟻飼料來(lái)源后，針對(duì)秸稈，白蟻?zhàn)陨硗ㄟ^(guò)合成之前未表達(dá)過(guò)的內(nèi)切葡聚糖酶降解纖維素，表明白蟻面對(duì)不同飼料可以改變木質(zhì)纖維素酶系組成。濾紙飼養(yǎng)后腸上調(diào)的蛋白有醛-酮還原酶、蘋果酸酶和羧酸酯水解酶等，其中醛-酮還原酶具有多種功能，參與包括戊糖和葡萄糖醛酸酯互變、果糖和甘露糖代謝、半乳糖代謝，同時(shí)也是白蟻體內(nèi)的解毒酶，這可能在濾紙消化過(guò)程中后腸主要對(duì)半纖維素起降解作用(Penning, 2015)。蘋果酸酶進(jìn)行丙酮酸代謝和碳代謝，羧酸酯水解酶主要是催化酯、硫酸酯和酰胺的水解(Chenetal., 2016)，這些蛋白的上調(diào)可以推測(cè)，由于濾紙中只有纖維素沒(méi)有木質(zhì)素，相對(duì)于難于降解的木質(zhì)素，白蟻的后腸根據(jù)飼料成分調(diào)整消化酶的組成，主要進(jìn)行半纖維素代謝和纖維素代謝。

為了研究白蟻對(duì)木質(zhì)纖維素的降解，我們分別比較了近暗散白蟻用不同飼料飼喂時(shí)腸道不同部位內(nèi)容物的蛋白組成和含量的變化，發(fā)現(xiàn)相同飼料飼喂時(shí)，前中腸和后腸蛋白的組成有較大差異；不同飼料也影響白蟻腸道內(nèi)的蛋白組成，秸稈和濾紙飼喂相對(duì)于野外的松木食物，腸道蛋白組成差異較大，尤其是秸稈飼喂影響更大，其中差異的蛋白最多的是具有催化活性的蛋白，因此飼料成分是其腸道蛋白變化的主要原因。這些結(jié)果為揭示白蟻的營(yíng)養(yǎng)消化吸收機(jī)理，也為挖掘白蟻生物系統(tǒng)中的高效降解酶提供了參考。