李曉維, 馬 琳, 呂要斌

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所, 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 310021)

番茄潛葉蛾Tutaabsoluta是一種世界性入侵昆蟲，其起源于南美洲，2006年傳入歐洲，目前已在南美洲、歐洲、非洲和亞洲的90多個(gè)國(guó)家和地區(qū)有報(bào)道，是番茄等茄科作物上毀滅性的害蟲(Desneuxetal., 2010; Biondietal., 2018)。中國(guó)西北和西南接壤的多個(gè)國(guó)家，如俄羅斯、哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦、塔吉克斯坦、印度和尼泊爾已被該蟲成功入侵(Izhevskyetal., 2011; Camposetal., 2017; Esenali Uuluetal., 2017; Sankarganeshetal., 2017; Zharmukhamedova and Shlyakhtich, 2017; Saidovetal., 2018)。番茄潛葉蛾可為害番茄、馬鈴薯、茄子、甜椒和煙草等茄科的經(jīng)濟(jì)作物，但最嗜好番茄(Desneuxetal., 2010)。其幼蟲是主要為害蟲態(tài)，潛入葉片、嫩芽、莖干、果實(shí)為害，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)可造成80%～100%的損失(Desneuxetal., 2010)。2017年，番茄潛葉蛾在新疆伊犁地區(qū)發(fā)生為害(李棟等, 2019; 李曉維等, 2019; 張桂芬等, 2019)，其后在云南地區(qū)亦發(fā)現(xiàn)該蟲(張桂芬等, 2020)，目前在貴州、四川、重慶、廣西、湖南、江西等地相繼發(fā)現(xiàn)(陸永躍, 2021)，對(duì)我國(guó)的番茄產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生重大威脅。

化學(xué)農(nóng)藥是防治番茄潛葉蛾的最重要工具之一。然而，番茄潛葉蛾潛入植物組織為害的習(xí)性致使噴施化學(xué)農(nóng)藥的防效很低(Guedes and Siqueira, 2012; Biondietal., 2018)。另外，由于化學(xué)農(nóng)藥的大量不合理使用，番茄潛葉蛾已對(duì)多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗性(Guedesetal., 2019)，例如對(duì)有機(jī)磷類(Siqueiraetal., 2000a; Liettietal., 2005; Haddietal., 2017; Baratietal., 2018), 擬除蟲菊酯類(Haddietal., 2012; Biondietal., 2015)， 多殺菌素(Camposetal., 2014; Camposetal., 2015b)， 阿維菌素 (Siqueiraetal., 2001; Silvaetal., 2016b)，巴丹(Siqueiraetal., 2000b)，茚蟲威(Roditakisetal., 2018)和雙酰胺類(Silvaetal., 2019; Boaventuraetal., 2020)等。由于各國(guó)用藥情況及用藥歷史并不相同，各地種群對(duì)不同殺蟲劑的抗性水平差異較大。番茄潛葉蛾作為新入侵我國(guó)的外來(lái)入侵害蟲，其對(duì)藥劑敏感性尚未知，因此應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)番茄潛葉蛾的抗藥性監(jiān)測(cè)，并根據(jù)不同地區(qū)的抗藥性現(xiàn)狀制定合理的用藥方案，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)該蟲的有效防治。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

番茄潛葉蛾室內(nèi)敏感種群：番茄潛葉蛾初始種群于2018年7月采自新疆維吾爾族自治區(qū)伊犁哈薩克自治州察布查爾錫伯自治縣安班巴格村的番茄田(43°49′40.00″N, 81°12′11.01″E)，在人工氣候室內(nèi)(溫度25±1℃，相對(duì)濕度60%±5%，光周期16L∶8D)，以未接觸過(guò)殺蟲劑的番茄為寄主植物進(jìn)行繼代飼養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)使用時(shí)。

番茄潛葉蛾田間種群：新疆種群幼蟲于2019年5月采自新疆維吾爾族自治區(qū)伊犁哈薩克自治州察布查爾錫伯自治縣安班巴格村的番茄田(43°49′40.00″N, 81°12′11.01″E)；云南種群幼蟲于2019年6月采自云南省玉溪市的番茄田(24°34′16″N, 102°57′78″E)。田間種群幼蟲(F1代)以未接觸過(guò)殺蟲劑的番茄為寄主植物在人工氣候室(溫度25±1℃，相對(duì)濕度60%±5%，光周期16L∶8D)飼養(yǎng)，選取F2代2齡幼蟲用于藥劑敏感性測(cè)定和解毒酶活性測(cè)定。

1.2 藥劑和試劑

97%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(emamectin benzoate)原藥、95%氯蟲苯甲酰胺(chlorantraniliprole)原藥、96%茚蟲威(indoxacarb)原藥、95%高效氯氰菊酯(beta-cypermethrin)原藥、96%多殺菌素(spinosad)原藥、95%溴蟲腈(chlorfenapyr)原藥均購(gòu)于江西正邦作物保護(hù)有限公司。

細(xì)胞色素P450酶(CYP450)抑制劑95%胡椒基丁醚(PBO)、酯酶抑制劑98%磷酸三苯酯(TPP)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)抑制劑96%丁烯二酸二乙酯(DEM)購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。

昆蟲細(xì)胞色素P450(CYP450)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒、昆蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒、昆蟲羧酸酯酶(CarE)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)于上海江萊生物科技有限公司。

1.3 室內(nèi)毒力測(cè)定

本研究基于殺蟲劑抗性行動(dòng)委員會(huì)(Insecticide Resistance Action Committee, IRAC)第22 號(hào)方法進(jìn)行改進(jìn)，采用全葉浸葉法測(cè)定番茄潛葉蛾室內(nèi)敏感種群、新疆和云南種群對(duì)6種藥劑的敏感性(Roditakisetal., 2013)。6種藥劑原藥先用丙酮配制成高濃度母液，再用含0.1%曲拉通的水溶液將母液稀釋配成5～7個(gè)濃度(含對(duì)照)。將番茄葉片(最長(zhǎng)處7～9 cm長(zhǎng)，最寬處3～5 cm)在藥液中浸15 s，迅速取出并晾干，之后接入濾紙保濕的培養(yǎng)皿(直徑10 cm)中，每個(gè)培養(yǎng)皿接入2齡幼蟲5頭，用封口膜密封培養(yǎng)皿邊緣，隨后放入恒溫養(yǎng)蟲室(溫度25±1℃，相對(duì)濕度60%±5%，光周期16L∶8D)，48 h后檢查幼蟲存活狀況。用毛筆尖輕觸蟲體，若蟲體無(wú)反應(yīng)或蟲體嚴(yán)重變形則視為死亡。每個(gè)濃度處理重復(fù)6次?？剐员稊?shù)=田間種群LC50/室內(nèi)種群LC50。

1.4 增效劑對(duì)殺蟲劑的增效作用測(cè)定

選取抗性最高的氯蟲苯甲酰胺作為供試藥劑，對(duì)室內(nèi)敏感種群和新疆的田間抗性種群進(jìn)行增效劑試驗(yàn)。將酶抑制劑PBO, TPP和DEM用丙酮稀釋100 mg/L，分別加入到系列濃度的氯蟲苯甲酰胺溶液中，用浸液法處理試蟲，方法參照1.3節(jié)。統(tǒng)計(jì)殺蟲劑單用、藥劑+增效劑的LC50值，計(jì)算增效比(SR)、抗敏增效比(R/S)和相對(duì)增效系數(shù)r0。SR=LC50(殺蟲劑單用)/LC50(殺蟲劑+增效劑)；R/S=抗性種群的增效比/敏感種群的增效比；r0%=(A-B)/C×100，其中A=殺蟲劑單用對(duì)抗性種群的LC50-殺蟲劑和增效劑聯(lián)用對(duì)抗性種群的LC50，B=殺蟲劑單用對(duì)敏感種群的LC50-殺蟲劑和增效劑聯(lián)用對(duì)敏感種群的LC50，C=殺蟲劑單用對(duì)抗性種群的LC50(何林, 2003; 段辛樂(lè)等, 2011)。

1.5 酶活力測(cè)定

室內(nèi)敏感種群和新疆抗性種群各取10頭2齡幼蟲，稱重后加入玻璃勻漿器，加入預(yù)冷的PBS(0.01 mo/L, pH 7.4)(1∶20, m/v)，于冰上充分研磨，最后將勻漿液離心，取上清監(jiān)測(cè)。每個(gè)種群3個(gè)重復(fù)。

昆蟲CYP450，GSTs和CarE活性測(cè)定分別參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。從室溫平衡60 min后的鋁箔袋中取出所需板條，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL。在樣本孔加待測(cè)樣本50 μL，空白孔加樣本稀釋液50 μL。空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液350 μL，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次。每孔加入底物A和B各50 μL，15 min內(nèi)，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方差計(jì)算各樣本酶活性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用SPSS軟件計(jì)算LC50、95%置信區(qū)間、斜率、標(biāo)準(zhǔn)誤。利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析比較抗性和敏感種群之間3種解毒酶比活力之間的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 不同番茄潛葉蛾種群對(duì)6種殺蟲劑的敏感性

采用番茄潛葉蛾室內(nèi)種群建立了其對(duì)6種殺蟲劑的相對(duì)敏感性基線。結(jié)果表明，甲維鹽、氯蟲苯甲酰胺和溴蟲腈對(duì)番茄潛葉蛾室內(nèi)敏感種群的毒力較高, LC50值分別為0.033, 0.167和0.599 mg/L，小于1 mg/L；其次是多殺菌素和茚蟲威，LC50值分別為1.121和1.582 mg/L，在1～2 mg/L之間；高效氯氰菊酯的毒力最小，LC50值為13.533 mg/L(表1)。

云南種群對(duì)6種殺蟲劑的敏感性由高到低依次為甲維鹽、溴蟲腈、多殺菌素、茚蟲威和氯蟲苯甲酰胺和高效氯氰菊酯。與室內(nèi)敏感種群相比，云南種群對(duì)6種殺蟲劑產(chǎn)生了不同水平的抗性?？剐员稊?shù)由高到低分別是氯蟲苯甲酰胺、甲維鹽、溴蟲腈、多殺菌素、茚蟲威和高效氯氰菊酯。氯蟲苯甲酰胺對(duì)云南種群的LC50為35.513 mg/L，云南種群對(duì)氯蟲苯甲酰胺產(chǎn)生了高水平抗性，抗性倍數(shù)為212.7；甲維鹽對(duì)云南種群的LC50為1.982 mg/L，云南種群對(duì)甲維鹽抗性水平中等，抗性倍數(shù)為61.0；溴蟲腈、多殺菌素和茚蟲威對(duì)云南種群的LC50分別為14.323, 22.337 和28.987 mg/L，云南種群對(duì)溴蟲腈、多殺菌素和茚蟲威的抗性水平較低，抗性倍數(shù)分別為23.9, 19.9和18.3；高效氯氰菊酯對(duì)云南種群的LC50值為53.211 mg/L，云南種群對(duì)高效氯氰菊酯的抗性水平最低，抗性倍數(shù)為3.9(表1)。

新疆種群對(duì)6種殺蟲劑的敏感性由高到低依次為甲維鹽、溴蟲腈、氯蟲苯甲酰胺、多殺菌素、茚蟲威和高效氯氰菊酯。與室內(nèi)敏感種群相比，新疆種群對(duì)6種殺蟲劑產(chǎn)生了不同水平的抗性?？剐员稊?shù)由高到低分別是氯蟲苯甲酰胺、甲維鹽、多殺菌素、溴蟲腈、茚蟲威和高效氯氰菊酯。氯蟲苯甲酰胺對(duì)新疆種群的LC50為28.271 mg/L，新疆種群對(duì)氯蟲苯甲酰胺產(chǎn)生了高水平抗性，抗性倍數(shù)為169.3；甲維鹽對(duì)新疆種群的LC50為2.186 mg/L，新疆種群對(duì)甲維鹽抗性水平中等，抗性倍數(shù)為67.3；多殺菌素和溴蟲腈對(duì)新疆種群的LC50分別為28.933和13.322 mg/L，新疆種群對(duì)多殺菌素和茚蟲威的抗性水平較低，抗性倍數(shù)為25.8和20.0；高效氯氰菊酯對(duì)新疆種群的LC50值為58.044 mg/L，新疆種群對(duì)高效氯氰菊酯的抗性水平低，抗性倍數(shù)為4.3(表1)。

表1 不同番茄潛葉蛾種群對(duì)6種殺蟲劑的敏感性

2.2 增效劑對(duì)氯蟲苯甲酰胺的增效作用

表2結(jié)果表明，PBO在敏感種群中對(duì)氯蟲苯甲酰胺的增效比為2.04倍，在新疆抗性種群中對(duì)氯蟲苯甲酰胺的增效比為3.39倍，抗敏增效比為1.66，相對(duì)增效系數(shù)為70.23；TPP在敏感種群中對(duì)氯蟲苯甲酰胺的增效比為1.25倍，在新疆抗性種群中對(duì)氯蟲苯甲酰胺的增效比為1.36倍，抗敏增效比為1.09，相對(duì)增效系數(shù)為26.62；DEM在敏感種群中對(duì)氯蟲苯甲酰胺的增效比為1.64，在新疆抗性種群中對(duì)氯蟲苯甲酰胺的增效比為1.97，抗敏增效比為1.20，相對(duì)增效系數(shù)為49.10。增效劑PBO, TPP和DEM均對(duì)氯蟲苯甲酰胺無(wú)明顯增效作用。在番茄潛葉蛾幼蟲體內(nèi)的3種代謝酶活性受抑制時(shí)，氯蟲苯甲酰胺對(duì)番茄潛葉蛾毒力沒有顯著變化，其結(jié)果表明番茄潛葉蛾體內(nèi)代謝解毒酶不是番茄潛葉蛾對(duì)氯蟲苯甲酰胺產(chǎn)生抗性的主導(dǎo)因素。

表2 3種增效劑在氯蟲苯甲酰胺對(duì)番茄潛葉蛾室內(nèi)敏感種群和田間抗性種群2齡幼蟲毒力中的增效作用

2.3 番茄潛葉蛾敏感種群和抗性種群體內(nèi)解毒酶活力比較

酶活性分析結(jié)果(表3)表明，番茄潛葉蛾敏感種群和抗性種群的CYP450活性分別為3.54和3.71 ng/mL，抗敏活性比為1.05，兩者差異不顯著(t=-1.670,df=4,P=0.170)；敏感種群和抗性種群的GST活性分別為138.08和151.09 mIU/L，抗敏活性比為1.09，兩者差異不顯著(t=-1.257，df=4,P=0.277)；敏感種群和抗性種群的CarE活性分別為33.27和35.01 mIU/L，抗敏活性比為1.05，兩者差異不顯著(t=-0.394,df=4,P=0.714)。以上結(jié)果表明3種解毒代謝酶在番茄潛葉蛾對(duì)氯蟲苯甲酰胺抗性中均沒有發(fā)揮作用。

3 討論

藥劑敏感性測(cè)定結(jié)果顯示，新疆和云南兩個(gè)番茄潛葉蛾田間種群對(duì)6種藥劑的敏感性相似，均為對(duì)甲維鹽的敏感性最高，對(duì)溴蟲腈的次之，對(duì)高效氯氰菊酯的敏感性最低(表1)。因此，甲維鹽和溴蟲腈可作為推薦藥劑用于番茄潛葉蛾的田間防治，而高效氯氰菊酯不推薦用于該蟲的防治。多殺菌素、氯蟲苯甲酰胺和茚蟲威對(duì)兩個(gè)田間種群的LC50多在20～30 mg/L之間，與室內(nèi)敏感種群相比，新疆和云南種群氯蟲苯甲酰胺抗性倍數(shù)已達(dá)169和213倍，達(dá)到了高水平抗性(>100倍)，新疆和云南種群多殺菌素和茚蟲威抗性倍數(shù)均達(dá)到了中等抗性水平(20倍左右)(表1)，因此，田間防治過(guò)程中也應(yīng)限制使用。另外，不同作用機(jī)理的藥劑間交替輪換使用也是抗性治理的重要方法。

擬除蟲菊酯類藥劑早在20世紀(jì)70年代開始用于南美洲的番茄潛葉蛾(Liettietal., 2005)，番茄潛葉蛾隨后逐漸對(duì)擬菊蟲酯類藥劑產(chǎn)生了抗性(Guedesetal., 1994; Salazar and Araya, 2001)。目前，番茄潛葉蛾對(duì)擬除蟲菊酯類藥劑的抗性已在南美洲的阿根廷(Liettietal., 2005)、智利(Salazar and Araya, 2001)和巴西(Siqueiraetal., 2000a; Silvaetal., 2015)，歐洲的西班牙、意大利和葡萄牙(Haddietal., 2012)，中東的伊朗(Zibaeeetal., 2018)以及非洲的尼日利亞(Balaetal., 2019)等國(guó)家出現(xiàn)。我國(guó)兩地番茄潛葉蛾擬除蟲菊酯類藥劑抗性種群的普遍存在可能是由于入侵地大量使用該藥劑有關(guān)，更有可能是入侵種群本身就是抗性種群(Guedes and Siqueira, 2012)。本研究結(jié)果顯示，高效氯氰菊酯對(duì)新入侵我國(guó)的番茄潛葉蛾兩個(gè)種群的LC50均非常高(>50 mg/L)，對(duì)室內(nèi)飼養(yǎng)的相對(duì)敏感種群的LC50也較高，為13.533 mg/L(表1)，證明入侵我國(guó)的番茄潛葉蛾種群本身對(duì)擬除蟲菊酯類藥劑具有較高的抗性。

本研究中的室內(nèi)種群僅在室內(nèi)飼養(yǎng)1年，為相對(duì)敏感種群，對(duì)不同藥劑的敏感性分布會(huì)存在差異。例如，其對(duì)溴蟲腈的毒力方程斜率b值較低，對(duì)溴蟲腈敏感性分布不均勻，但對(duì)其他5種藥劑的敏感性分布相對(duì)較均勻。因此，進(jìn)一步篩選對(duì)溴蟲腈敏感性分布均勻的室內(nèi)敏感種群，用于制定番茄潛葉蛾對(duì)溴蟲腈的敏感基線，將有助于番茄潛葉蛾溴蟲腈抗性研究。與室內(nèi)敏感種群相比，新疆和云南兩個(gè)田間種群的氯蟲苯甲酰胺抗性倍數(shù)最高，分別為169和213倍，達(dá)到了高水平抗性。一方面，該結(jié)果可能與室內(nèi)種群對(duì)氯蟲苯甲酰胺抗性水平迅速衰退有關(guān)，另一方面可能與田間雙酰胺類藥劑的不合理應(yīng)用有關(guān)。由于雙酰胺類殺蟲劑對(duì)鱗翅目害蟲的防效極佳，被廣泛用于小菜蛾、甜菜夜蛾和番茄潛葉蛾等鱗翅目害蟲的防治(劉宴弟等, 2020; Richardsonetal., 2020)。在南美洲、歐洲以及新入侵的國(guó)家，番茄潛葉蛾的化學(xué)防治過(guò)度依賴于雙酰胺類殺蟲劑(Desneuxetal., 2010; Roditakisetal., 2018)，導(dǎo)致該類藥劑雖是最近才開始用于番茄潛葉蛾防治的一類新型藥劑，但在巴西、歐洲各國(guó)和以色列已有番茄潛葉蛾對(duì)雙酰胺類藥劑抗性的報(bào)道 (Camposetal., 2015a; Roditakisetal., 2015, 2017, 2018; Silvaetal., 2016a, 2019; Grantetal., 2019)。

雙酰胺類殺蟲劑的抗性機(jī)理主要包括代謝抗性和靶標(biāo)抗性(Richardsonetal., 2020)。本研究增效劑對(duì)殺蟲劑毒力的增效試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，增效劑PBO, TPP和DEM均對(duì)氯蟲苯甲酰胺無(wú)明顯增效作用。同時(shí)，室內(nèi)敏感種群和田間抗性種群之間細(xì)胞色素P450酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和羧酸酯酶3種解毒酶活力沒有顯著差異(表3)。以上結(jié)果表明，番茄潛葉蛾氯蟲苯甲酰胺抗性與解毒酶的代謝無(wú)關(guān)。該結(jié)果與前期研究結(jié)果一致，巴西學(xué)者通過(guò)增效劑試驗(yàn)證明番茄潛葉蛾氯蟲苯甲酰胺抗性與酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞色素P450酶無(wú)關(guān)(Silvaetal., 2019)。已有研究證明，番茄潛葉蛾對(duì)氯蟲苯甲酰胺的抗性與小菜蛾相似，是由魚尼丁受體(ryanodine receptor)點(diǎn)突變引起的，突變位點(diǎn)G4946E/V和I4790 M/T與意大利種群的抗性有關(guān)，突變位點(diǎn)G4946E/V與希臘種群的抗性有關(guān)(Roditakisetal., 2017)。進(jìn)一步研究中國(guó)新入侵種群的魚尼丁受體突變情況及突變頻率將有利于明確中國(guó)種群對(duì)氯蟲苯甲酰胺的抗性機(jī)理。

綜上所述，本研究結(jié)果對(duì)番茄潛葉蛾的田間防治和抗性治理具有指導(dǎo)意義。同時(shí)，進(jìn)一步明確入侵我國(guó)番茄潛葉蛾種群的抗性機(jī)理、綜合應(yīng)用多種防治方法仍是該害蟲綜合治理的關(guān)鍵。