李雪艷，王大維，于麗娟，林秀艷，龔 偉，潘 登，陳 璐

（海南省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像部，海南?？?570311）

近年來，惡性腫瘤的分子靶向治療和免疫治療發(fā)展迅猛，在肺癌治療中效果尤為顯著。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）業(yè)已成為EGFR 突變型非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）病人靶向治療的一線藥物，但對(duì)于EGFR 野生型的肺癌患者效果甚微。準(zhǔn)確的EGFR 的表達(dá)狀態(tài)檢測(cè)是臨床是否應(yīng)用TKI 重要的參照依據(jù)。程序性死亡受體1（programmed cell death-1，PD-1）/程 序 性 死 亡 配 體1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）信號(hào)通路目前作為癌癥免疫治療的重要研究靶點(diǎn)，在NSCLC 患者的治療中表現(xiàn)出了令人驚喜的療效及巨大的臨床潛能［1］。由于活檢技術(shù)、檢測(cè)條件等方面的限制，目前臨床亟需探索非侵入性方法來評(píng)估EGFR 突變及PDL1的表達(dá)狀態(tài)。

正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（positron emission tomography/computed tomography，PET/CT）作為分子影像及功能影像的主要代表，在腫瘤各診療環(huán)節(jié)中的作用逐漸被挖掘。大量研究表明18F-FDG PET/CT 在無創(chuàng)性地發(fā)現(xiàn)腫瘤特征及療效預(yù)測(cè)方面具有很好的價(jià)值和應(yīng)用前景［2-4］。因此，本研究試圖探索PET/CT 多模態(tài)影像特征和代謝參數(shù)與EGFR 基因突變以及PD-L1 表達(dá)間的相關(guān)性，為臨床篩選靶向和免疫治療受益人群以及準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)療效提供客觀依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

篩選本院2017 年7 月～2020 年9 月腫瘤相關(guān)治療前行18F-FDG PET/CT 檢查、獲得明確病理結(jié)果的NSCLC 患者作為研究對(duì)象。入組標(biāo)準(zhǔn)為：（1）首診/首治且病理檢查證實(shí)為NSCLC；（2）有明確EGFR 基因檢測(cè)結(jié)果和免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果；（3）無其他惡性腫瘤病史。收集患者的臨床特征資料，包括年齡、性別、吸煙情況、腫瘤體積、腫瘤分期、血清腫瘤標(biāo)志物等。

1.2 PET/CT 顯像方法及圖像分析

使用GE Discovery 710 PET/CT 掃描機(jī)，顯像劑18F-FDG 由GE Qilin 回旋加速器設(shè)備和化學(xué)合成系統(tǒng)制備，放化純度超過百分之九十五。被檢者在顯像前禁食約5 h 左右，并限制血糖濃度不超過7 mmol/L，選擇血管狀態(tài)較好的一側(cè)肘靜脈進(jìn)行顯像劑輸注，量為5.5～7.4 MBq/kg，囑被檢者休息1 h 后行全身掃描、圖像重建、衰減校正及圖像融合。

使用GE AW 4.6 工作站的PET VCAR 軟件收集肺癌形態(tài)學(xué)參數(shù)及代謝參數(shù)，包括原發(fā)灶最大徑、最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值（maximum standardized uptake value，SUVmax）、腫瘤代謝體積（metabolic tumor volume，MTV），按閾值法定義計(jì)算的腫瘤區(qū)體積）和病灶總糖酵解量［total lesion glycolysis，TLG；TLG=平均SUV（mean SUV，SUVmean）×MTV］。 在 測(cè) 定 或 計(jì) 算MTV 和TLG 時(shí) 使 用40%SUVmax 為閾值。典型肺腺癌患者PET/CT圖像（圖1）。

圖1 典型肺腺癌患者PET/CT 圖像Fig 1 PET/CT images of typical lung adenocarcinoma patient

1.3 EGFR 基因突變檢測(cè)及免疫組化染色結(jié)果判讀

基因檢測(cè)選擇手術(shù)切除、穿刺或支氣管鏡活檢標(biāo)本。采用ARMS-PCR 法對(duì)EGFR 突變狀態(tài)進(jìn)行檢 測(cè)。EGFR-TKI 敏 感 突 變：19del，21（L858R，L861），18（G719X，G719）。

免疫組化染色切片由二名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)生雙盲獨(dú)立分析，判斷并評(píng)估完全或局部膜染色的腫瘤細(xì)胞比例。判讀標(biāo)準(zhǔn)為：著色細(xì)胞≤5%定義為陰性（-），表達(dá)等級(jí)為0，著色細(xì)胞5%～25%定義為弱陽性（+），表達(dá)等級(jí)為1，著色細(xì)胞25%～50%定義為陽性（++），表達(dá)等級(jí)為2，著色細(xì)胞＞50%為強(qiáng)陽性（+++），表達(dá)等級(jí)為3。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。分別應(yīng)用Pearson 卡方檢驗(yàn)和Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行分類變量和連續(xù)變量分析。應(yīng)用受試者工作 特 性（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析連續(xù)變量預(yù)測(cè)EGFR 基因突變狀態(tài)及PD-L1 蛋白表達(dá)狀態(tài)的曲線下面積（area under curve，AUC）并尋找最佳截?cái)帱c(diǎn)。單因素及多因素Logistic 回歸分析用以檢驗(yàn)各參數(shù)在預(yù)測(cè)EGFR 突變狀態(tài)及PD-L1 蛋白表達(dá)狀態(tài)中的統(tǒng)計(jì)學(xué)價(jià)值。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理參數(shù)與NSCLC EGFR 突變狀態(tài)的相關(guān)性

PET/CT 多模態(tài)參數(shù)與EGFR 基因突變狀態(tài)相關(guān)性研究組最終納入223 例病例，其中男性119例（53.36%），女性104 例（46.64%），EGFR 突變型 126 例（56.50%），EGFR 野 生 型 97 例（43.50%）。入組病例的臨床病理特征見表1。通過Logistic 單因素研究評(píng)估臨床參數(shù)與EGFR 突變狀態(tài)之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明，年齡＞55 歲者的EGFR 突變率顯著小于年齡≤55 歲者（P=0.01），吸煙者小于非吸煙者（P=0.00），男性小于女性（P=0.00）。而臨床分期（P=0.34）、腫瘤直徑（P=0.16）、腫瘤位置（P=0.08）均與EGFR 突變狀態(tài)無明顯關(guān)系（P＞0.05）。

表1 臨床病理參數(shù)與EGFR 突變狀態(tài)的關(guān)系Tab 1 Relationship between clinicopathological parameters and EGFR mutation status

2.2 PET/CT 代謝參數(shù)與NSCLC EGFR 突變狀態(tài)的相關(guān)性

Mann-WhitneyU檢驗(yàn)結(jié)果顯示EGFR 野生型患者M(jìn)TV 和TLG 均高于突變型患者［（32.46±43.56） cm3vs.（17.28±13.86） cm3，P=0.01］ 、［（56.23±33.47）gvs.（25.38±18.76）g，P=0.00］。而SUVmax 在野生組與突變組患者間的差異無統(tǒng)計(jì) 學(xué) 意 義（13.13±5.02vs.10.87±4.98，P=0.13）（圖2）。ROC 曲線分析結(jié)果顯示SUVmax、MTV和TLG 預(yù)測(cè)EGFR 突變狀態(tài)的cut-off 值分別為9.05（AUC =0.54，95%CI：0.46～0.61，P=0.37）、27.54 cm3（AUC=0.60，95%CI：0.52～0.68，P=0.01）、66.90 g（AUC=0.60，95%CI：0.52～0.67，P=0.01）（圖3）。

圖2 EGFR 突變組和野生組的SUVmax、MTV 和TLG 箱圖Fig 2 SUVmax，MTV，and TLG boxes in patients with EGFR mutant and wild-type NSCLC

圖3 SUVmax、MTV 及TLG 預(yù)測(cè)NSCLC EGFR 突變狀態(tài)的ROC 曲線Fig 3 ROC curves of SUVmax，MTV and TLG to predict NSCLC EGFR mutation status

2.3 NSCLC EGFR突變狀態(tài)的Logistic多因素分析

將入組病例的臨床病理因素和PET/CT 代謝參數(shù)均納入Logistic 單因素分析，結(jié)果表明：年齡、性別、吸煙史以和MTV 都與EGFR 基因突變狀態(tài)具有相關(guān)性（P值分別為0.01、0.00、0.00 和0.01），見表1。將這些變量作為協(xié)變量進(jìn)一步納入Logistic 多因素分析，結(jié)果表明MTV、年齡和吸煙史是預(yù)測(cè)EGFR 基因突變的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素（P值分別為0.03、0.00 和0.00），見表2。

表2 223 例NSCLC 患者EGFR 突變狀態(tài)的多因素分析結(jié)果Tab 2 Multifactorial analysis of EGFR mutation in 223 NSCLC patients

2.4 臨床病理特征、PET/CT 代謝參數(shù)與PD-L1蛋白表達(dá)狀態(tài)的關(guān)系

PET/CT 與PD-L1 蛋白表達(dá)狀態(tài)相關(guān)性研究組最終入組123 例患者，其中男性79 例（64.23%），女性44（35.77%）。PD-L1 陽性者占65.85%，表達(dá)等級(jí)為0、1、2 和3 的比例分別為37.82%、27.91%、26.25%和8.02%。

ROC 曲 線 分 析 結(jié) 果 顯 示SUVmax、MTV 和TLG 預(yù)測(cè)PD-L1 蛋白表達(dá)狀態(tài)的cut-off 值分別為 9.65（AUC=0.47，95%CI：0.36～0.58，P=0.57）、24.15 cm3（AUC=0.56，95%CI：0.45～0.66，P=0.03）、71.25 g（AUC=0.52，95%CI：0.41～0.63，P=0.72）（圖4）。Mann-WhitneyU檢驗(yàn)結(jié)果顯示不同PD-L1 蛋白表達(dá)狀態(tài)組間SUVmax、MTV 和TLG 值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖5）。

圖4 SUVmax、MTV 及TLG 預(yù)測(cè)PD-L1 蛋白表達(dá)狀態(tài)的ROC 曲線Fig 4 ROC curves of SUVmax，MTV and TLG to predict PD-L1 protein expression status

圖5 PD-L1 表達(dá)陽性組和陰性組NSCLC 患者的SUVmax、MTV 和TLG 箱圖Fig 5 SUVmax，MTV and TLG boxes of NSCLC patients in the positive and negative groups with PD-L1 expression

采用Logistic 單因素分析評(píng)價(jià)臨床因素與PDL1 蛋白表達(dá)狀態(tài)之間的關(guān)系，見表3。研究發(fā)現(xiàn)，Ⅲ/Ⅳ期組PD-L1 陽性表達(dá)率高于Ⅰ/Ⅱ期 組（P=0.01），而 年 齡（P=0.33）、性 別（P=0.12）、吸 煙 史（P=0.65）、SUVmax（P=0.47）、MTV（P=0.37）、TLG（P=0.12）、LDH（P=0.27）及CEA（P=0.98）均與PD-L1 蛋白狀態(tài)無明顯關(guān)系（P＞0.05）（表3）。

表3 123 例患者臨床病理參數(shù)與PD-L1 表達(dá)狀態(tài)的關(guān)系Tab 3 Relationship between clinicopathological parameters and PD-L1 expression in 123 patients

3 討論

目前，基于PET/CT 代謝參數(shù)預(yù)測(cè)EGFR 基因突變狀態(tài)的有關(guān)研究重點(diǎn)主要圍繞于傳統(tǒng)代謝參數(shù)，如SUVmax，且研究結(jié)論不盡相同。Takamochi等［5］研究表明EGFR 突變型病人的糖代謝相關(guān)基因表達(dá)水平明顯降低，且與SUVmax 存在著明顯的正相關(guān)性。有研究結(jié)果表明，原發(fā)腫瘤較低的SUVmax 更可能預(yù)測(cè)EGFR 突變［5-7］，也有研究結(jié)果表明較高的SUVmax 更有可能預(yù)測(cè)EGFR 突變陽性［8］。同時(shí)，還有研究表明，SUVmax 與EGFR 突變狀態(tài)之間無明顯關(guān)聯(lián)［7，9］，這一結(jié)果與本研究結(jié)論一致。產(chǎn)生此結(jié)論的原因，可能是由于SUVmax 只反映了病灶內(nèi)FDG 的最高攝取狀態(tài)，而無法全面反映整個(gè)腫瘤的代謝活動(dòng)，且易受到患者體質(zhì)及圖像采集條件等多種因素的影響。因此本研究補(bǔ)充測(cè)量了MTV 和TLG 進(jìn)行分析，這兩項(xiàng)參數(shù)融合了腫瘤糖代謝特點(diǎn)及容積參數(shù)，可以更好地反映腫瘤負(fù)荷，對(duì)這兩項(xiàng)代謝體積指標(biāo)的研究也是近期熱點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)MTV 較低的NSCLC 患者的預(yù)后通常優(yōu) 于MTV 較 高 者［10-12］。本 研 究 亦 發(fā) 現(xiàn) 低MTV 與NSCLC EGFR 基因突變存在正相關(guān)，且MTV 是預(yù)測(cè)EGFR 基因突變的獨(dú)立因素。雖然本研究結(jié)果提示TLG 與EGFR 突變狀態(tài)無關(guān)，但由于TLG 和MTV 存在多重共線性關(guān)系，不能完全否定TLG 對(duì)EGFR 突變狀態(tài)的預(yù)測(cè)價(jià)值，仍然需要通過多中心、大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析和驗(yàn)證。

PD-1/PD-L1 抑制劑作為免疫治療的新星，可阻斷腫瘤逃脫自身免疫系統(tǒng)的攻擊。其主要作用機(jī)理是阻止PD-1 和PD-L1 的結(jié)合，上調(diào)機(jī)體免疫系統(tǒng)T 細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)水平，維持T 細(xì)胞的激活狀態(tài)，從而提高其對(duì)惡行腫瘤細(xì)胞的識(shí)別，并激發(fā)其攻擊和殺傷活性，進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤效果［13，14］。目前臨床試驗(yàn)（CheckMate-057）的結(jié)果已表明抗PD-1/PD-L1 單克隆抗體是進(jìn)展期NSCLC 免疫靶向治療的巨大潛力藥物［15］，然而并非所有患者都有效，所以，無創(chuàng)地篩選可能從這種治療中獲益的靶向人群有重要的意義。FDG 作為葡萄糖類似物，可被轉(zhuǎn)運(yùn)入腫瘤組織以及腫瘤相關(guān)的活性免疫細(xì)胞，因此PET 可提供腫瘤免疫微環(huán)境代謝狀態(tài)相關(guān)信息?；诖死碚摶A(chǔ)，我們假設(shè)PET/CT 代謝參數(shù)與PD-L1 表達(dá)間可能存在某種相關(guān)性。 通過Mann-WhitneyU檢驗(yàn)及Logistic 單因素分析，發(fā)現(xiàn)PD-L1 蛋白表達(dá)僅與腫瘤分期（P=0.01）相關(guān)，而與其他臨床病理因素?zé)o關(guān)。PET/CT 代謝參數(shù)與PD-L1 蛋白表達(dá)間亦未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性。分析其原因，可能是PD-L1 不僅在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，也存在于腫瘤微環(huán)境中，且在腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞中的表達(dá)占更大比例［16］。該結(jié)果還可能與免疫組化染色陽性閾值的定義有關(guān)，目前關(guān)于該閾值的定義尚未達(dá)成共識(shí)［17］，判讀標(biāo)準(zhǔn)各異，且檢測(cè)方法不一，使得研究結(jié)果存在著較大差異。此外，F(xiàn)DG 并非腫瘤特異性顯像劑，炎性細(xì)胞、功能異常增強(qiáng)的組織細(xì)胞等均會(huì)出現(xiàn)FDG 高攝取，這些混雜攝取可能是出現(xiàn)PET/CT 代謝參數(shù)與PD-L1 表達(dá)無相關(guān)性的另一原因。

本研究的主要不足之一為回顧性研究，因?yàn)闃颖玖肯鄬?duì)較小，所以患者的入組篩選和分析過程中可能存在一定程度的偏倚；其次，本研究未分析其他種類的基因突變，如K-ras等。另外，影像組學(xué)和深度學(xué)習(xí)技術(shù)發(fā)展迅猛［18，19］，其優(yōu)勢(shì)之處在于通過計(jì)算機(jī)技術(shù)可深度挖掘到影像的高維信息，在各腫瘤研究領(lǐng)域均表現(xiàn)優(yōu)異，這也將是筆者今后的重點(diǎn)研究方向。

作者貢獻(xiàn)度說明：

李雪艷：試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)、論文撰寫與修改；王大維：負(fù)責(zé)論文審閱及圖片處理；于麗娟：負(fù)責(zé)論文選題及審閱；林秀艷、龔偉：負(fù)責(zé)入組患者臨床數(shù)據(jù)收集；潘登、陳璐：負(fù)責(zé)入組患者圖像分析。

所有作者聲明不存在任何利益沖突。