張明娟，劉明明，余秋地，袁磊，王娟，秦愛，李根容

(重慶市計量質量檢測研究院，重慶，400020)

食源性疾病是指通過攝食而進入人體的有毒有害物質等致病因子所造成的疾病，是食品安全的主要問題之一，世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，全球平均每年有上億腹瀉病例，食源性疾病患者數(shù)以億計，其中超70%食源性疾病由致病微生物引起[1-2]。因此，食源性致病菌仍是目前引起食源性疾病的主要原因，如何準確、快速、靈敏地檢測食源性致病菌已成為控制食品安全問題的關鍵[3]。

目前，我國開展食品中食源性致病菌監(jiān)測工作主要涉及的檢測指標有沙門氏菌屬、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌屬、單核細胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、大腸埃希氏菌O157∶H7、克羅諾桿菌屬、銅綠假單胞菌、糞鏈球菌、產氣莢膜梭菌等，依據(jù)GB 4789系列和GB 8538標準，檢測方法主要是傳統(tǒng)培養(yǎng)法，包括細菌培養(yǎng)、生理生化鑒定等過程，其檢測周期較長，操作較繁瑣復雜，且檢測時易受微生物生長情況影響，上述方法已不能滿足我國公共衛(wèi)生突發(fā)事件應急檢測的需要[2,4]，因此，建立一種高通量、準確、快速的致病菌檢測方法顯得十分重要。

多重PCR是在常規(guī)PCR基礎上發(fā)展起來的，其反應原理、反應試劑和操作過程與常規(guī)PCR相同，區(qū)別在于多重PCR技術在同一個反應體系中加入兩對或以上引物，分別擴增不同的模板，得到不同的目的片段，實現(xiàn)了一次性檢測多個基因的目的[5-7]，可以節(jié)省檢測時間和費用成本，因此具有很好的發(fā)展前景。本研究旨在建立一種高通量、快速、準確、靈敏的十重PCR檢測方法，在同一反應體系中同時檢出沙門氏菌屬、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌屬、單核細胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、大腸埃希氏菌O157：H7、克羅諾桿菌屬、銅綠假單胞菌、糞鏈球菌和產氣莢膜梭菌，以應用于實際檢測工作，解決現(xiàn)有技術操作較為繁瑣且耗時長的問題，為監(jiān)管部門開展食源性致病菌監(jiān)測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗樣品與菌株

預包裝的牛肉干、海苔、巧克力、面包、椰汁、雞精、奶粉、礦泉水樣品，市售。實驗用菌株見表1。

1.1.2 試劑

10×PCR buffer、2×Multiplex PCR Master Mix、d NTPs、TaqDNA聚合酶、HSTaqDNA酶、Mg2+(濃度25 mmol/L)、DNA Marker(100、50 bp)、ddH2O、瓊脂糖、50×TAE、核酸染料、溶菌酶、6×甘油凝膠上樣緩沖液，生工生物工程(上海)股份有限公司；細菌基因組提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；營養(yǎng)瓊脂、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂、腦心浸液肉湯、細菌瓊脂粉、胰蛋白胨大豆瓊脂、無菌脫纖維羊血、蛋白胨、緩沖蛋白胨水、7.5% NaCl肉湯、LB肉湯、改良EC肉湯、3% NaCl堿性蛋白胨水、營養(yǎng)肉湯、志賀氏菌增菌液、腸道增菌液、平板計數(shù)瓊脂，北京陸橋技術股份有限公司；牛肉浸粉，青島海博生物技術有限公司；NaCl，重慶川東化工(集團)有限公司。

表1 實驗菌株名稱、編號及來源Table 1 Name, number and source of experimental strains

1.2 儀器與設備

TCEN-24R臺式高速冷凍離心機、MiniT-H3金屬浴，杭州奧盛儀器有限公司；BJC2-60L-D超純水儀，重慶華創(chuàng)水處理工程有限公司；Gel DocTMEZ凝膠成像系統(tǒng)、DowerDacTMBasic電泳儀及水平電泳槽、T100型PCR儀，美國Bio-Rad公司；NanoDrop ONEc超微量分光光度計，美國Thermo公司；DW-86L388A超低溫冰箱，北京海爾公司；DRP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；MIX-3000旋渦混合器，上海Gallop Instruments公司；ME403電子天平，瑞士Mettler-Toledo公司；AC2-6S1生物安全柜，新加坡ESCO公司；SQ810C高壓滅菌鍋，重慶雅馬拓科技有限公司；7 L MGC厭氧培養(yǎng)盒，日本三菱公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組DNA提取

采用細菌基因組提取試劑盒提取細菌基因組DNA。

1.3.2 引物設計及合成

分析細菌種屬間的差異，選擇特異的保守基因做為檢測目的基因[8-21]；在美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)中GenBank數(shù)據(jù)庫上下載目的基因的核酸序列，將目標基因的核酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，驗證其特異性；通過引物設計軟件Premier 6.0針對其目的基因的序列差異處設計引物；選擇特異性較高、長度在18～30 bp、退火溫度Tm值接近、引物間二級結構較少且十對引物所擴增的產物長度差異不低于50 bp的引物組，引物組信息見表2。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司代為合成，引物純化方式為iPAGE，引物合成之后用ddH2O稀釋到濃度10 μmol/L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 十對引物組、目的基因和擴增產物長度Table 2 Ten pairs of primer sets, target genes and amplification product length

1.3.3 引物特異性驗證

以表1中標準菌株的基因組DNA為模板，分別對上述10對引物進行單重PCR特異性驗證。PCR反應體系：10×PCR buffer 2.5 μL，正反引物(10 μmol/L)各0.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL，Taq酶(5 U/μL)0.5 μL，DNA模板1.0 μL，Mg2+(25 mmol/L)1.5 μL，ddH2O補充至50 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物取8 μL用于瓊脂糖凝膠電泳分析(質量分數(shù)為1.5%)，并將PCR產物進行測序以驗證擴增的準確性。

1.3.4 引物靈敏性驗證

以標準菌株銅綠假單胞菌ATCC 27853、單核細胞增生李斯特氏菌ATCC 19115、糞鏈球菌ATCC 29212、產氣莢膜梭菌ATCC 13124、腸炎沙門氏菌CICC 21482、阪崎克羅諾桿菌CICC 21544、福氏志賀氏菌CICC 21534、金黃色葡萄球菌CICC 21600、副溶血性弧菌CICC 21617、大腸埃希氏菌O157∶H7 CICC 21530的基因組DNA為模板，用ddH2O進行10倍梯度稀釋，并進行相應的單重PCR體系擴增，驗證引物的靈敏度。

1.3.5 多重PCR條件優(yōu)化

以標準菌株銅綠假單胞菌ATCC 27853、單核細胞增生李斯特氏菌ATCC 19115、糞鏈球菌ATCC 29212、產氣莢膜梭菌ATCC 13124、腸炎沙門氏菌CICC 21482、阪崎克羅諾桿菌CICC 21544、福氏志賀氏菌CICC 21534、金黃色葡萄球菌CICC 21600、副溶血性弧菌CICC 21617、大腸埃希氏菌O157∶H7 CICC 21530的基因組DNA為模板構建多重PCR反應體系。多重PCR反應基本體系：2×Multiplex PCR Master Mix 25 μL，正反引物(10 μmol/L)各0.5 μL，HSTaqDNA酶(5 U/μL)1 μL，DNA模板均1.0 μL，補充ddH2O至50 μL；多重PCR反應基本條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳分析條件：核酸染料10 μL/100 mL，電泳液1×TAE，PCR擴增產物上樣量25 μL，電壓220 V，電泳時間約40 min。

1.3.5.1 退火溫度優(yōu)化

在多重PCR反應體系中同時加入10對引物組和10種標準菌株基因組模板DNA，分別設置退火溫度為55.0、55.7、56.9、58.8、61.1、63.0、64.3、65.0 ℃進行多重PCR反應。

在多重PCR反應體系中同時加入10對引物組，分別加入1種標準菌株基因組模板DNA，進行多重PCR反應。

1.3.5.2 引物濃度優(yōu)化

采用優(yōu)化的退火溫度及固定的模板量(50 ng)，分別設置引物濃度為20、40、60、80、100 nmol/L進行多重PCR反應。

1.3.5.3 模板量優(yōu)化

采用優(yōu)化的退火溫度及引物濃度，分別設置模板量為10、25、50 ng進行多重PCR反應。

1.3.6 多重PCR體系特異性驗證

以標準菌株的基因組DNA為模板，依據(jù)現(xiàn)行標準中各類樣品需檢測的致病菌類型組合，分組加入10對特異性引物進行以優(yōu)化后的多重PCR反應體系及條件多重PCR擴增，分組信息見如表3。

表3 致病菌類型組合分組Table 3 Grouping of pathogen type combinations

1.3.7 多重PCR體系靈敏度驗證

分別以標準菌株銅綠假單胞菌ATCC 27853、單核細胞增生李斯特氏菌ATCC 19115、糞鏈球菌ATCC 29212、產氣莢膜梭菌ATCC 13124、腸炎沙門氏菌CICC 21482、阪崎克羅諾桿菌CICC 21544、福氏志賀氏菌CICC 21534、金黃色葡萄球菌CICC 21600、副溶血性弧菌CICC 21617、大腸埃希氏菌O157∶H7 CICC 21530的基因組DNA為模板，用ddH2O進行10倍梯度稀釋，以優(yōu)化后的多重PCR反應體系及條件進行多重PCR，驗證體系的靈敏度。

1.3.8 多重PCR檢測方法初步應用

不同基質對于細菌的培養(yǎng)以及基因組DNA提取均會產生不同影響，選取不同基質、不同污染菌株的人工污染的樣品進行實驗，進一步驗證該多重PCR方法檢測的靈敏度。

1.3.8.1 人工污染菌株培養(yǎng)及計數(shù)

將標準菌株銅綠假單胞菌ATCC 27853、單核細胞增生李斯特氏菌ATCC 19115、糞鏈球菌ATCC 29212、產氣莢膜梭菌ATCC 13124、腸炎沙門氏菌CICC 21482、阪崎克羅諾桿菌CICC 21544、福氏志賀氏菌CICC 21534、金黃色葡萄球菌CICC 21600、副溶血性弧菌CICC 21617、大腸埃希氏菌O157：H7 CICC 21530分別培養(yǎng)24 h，挑取菌落于無菌水中制成菌懸液，在相應的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48 h，對菌懸液進行平板計數(shù)。

1.3.8.2 人工污染方法

用無菌水分別將10株菌稀釋至106、105、104、103CFU/mL 4個濃度，每個稀釋度分別加入1 mL到10 g基質中，補充增菌液體積至90 mL，具體分組及培養(yǎng)信息見表4。增菌后(36 ℃，24 h)分別吸取1 mL提取基因組DNA，以優(yōu)化后的多重PCR反應體系及條件進行多重PCR，驗證靈敏度。

表4 人工污染實驗分組Table 4 Grouping of industrial pollution experiments

2 結果與分析

2.1 引物特異性

通過設計的10對特異性引物對表1中菌株進行PCR檢測，結果表明1株單核細胞增生李斯特氏菌菌株、7株沙門氏菌屬菌株、7株克羅諾桿菌屬菌株、4株志賀氏菌屬菌株、1株金黃色葡萄球菌菌株、1株副溶血性弧菌菌株、1株大腸埃希氏菌O157∶H7菌株、1株銅綠假單胞菌菌株、1株糞鏈球菌菌株、5株產氣莢膜梭菌種均擴增出目的條帶，而其他陰性對照菌株均未擴增出明顯的目的條帶，詳見電子增強出版附件(http://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031352)。

PCR產物進行凝膠電泳驗證后，將其送到生工生物工程(上海)股份有限公司代為測序，測序結果通過與目的基因進行序列對比，相似率均達到98%以上，擴增產物均與目標基因序列高度一致。結果表明本研究所設計的10對引物具有高度特異性。

2.2 引物靈敏度

通過PCR檢測，單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌屬、副溶血性弧菌、銅綠假單胞菌、糞鏈球菌、產氣莢膜梭菌、沙門氏菌屬、克羅諾桿菌屬、大腸埃希氏菌O157∶H7菌株的靈敏度分別為5.37×10-6、5.37×10-4、6.04×10-6、8.85×10-3、9.52×10-6、8.91×10-7、7.33×10-6、7.10×10-3、7.49×10-7、7.20×10-3ng/μL，引物均具有較高靈敏度。

2.3 多重PCR條件優(yōu)化

2.3.1 退火溫度優(yōu)化

當退火溫度設置為55～65 ℃時，多重PCR均能擴增出10條特異性目標條帶，見圖1-a。

選擇55～65 ℃的平均值60 ℃作為退火溫度，在多重PCR反應體系中同時加入10對引物組，分別加入1種標準菌株基因組DNA，進行多重PCR反應，在僅加入糞鏈球菌、沙門氏菌、志賀氏菌基因組DNA時出現(xiàn)非特異擴增，結果見圖1-b，因此，60 ℃作為退火溫度時，多重PCR體系特異性較差；將退火溫度增加至62 ℃，在多重PCR反應體系中同時加入10對引物組，分別加入1種標準菌株基因組DNA，進行多重PCR反應，結果見圖1-c，10對特異性引物均只針對加入的模板擴增出特異性條帶，無非特異擴增，多重PCR體系特異性較好。因此，綜合選擇62 ℃作為本研究多重PCR體系的退火溫度。

a-溫度梯度PCR結果(M-100 bp Marker;1～8分別為55.0、55.7、 56.9、58.8、61.1、63.0、64.3、65.0 ℃)；b-退火溫度60 ℃; c-退火溫度62 ℃(M-100 bp Marker;1～11依次為大腸埃希氏菌 O157∶H7、糞鏈球菌、克羅諾桿菌屬、銅綠假單胞菌、 副溶血性弧菌、產氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生 李斯特氏菌、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、CK)圖1 退火溫度優(yōu)化結果Fig.1 Results of annealing temperature optimization

2.3.2 引物濃度優(yōu)化

在退火溫度為62 ℃和模板量為50 ng時，不同引物濃度進行多重PCR檢測，結果見圖2，當引物濃度為20 nmol/L時，無法完全擴增出10個目的條帶，引物濃度為40 nmol/L時，可擴增出10個條帶，但條帶較模糊，引物濃度在60～100 nmol/L時，均可擴增出10條特異性目標條帶，引物濃度在100 nmol/L時，10個目標條帶均最清晰，因此，綜合選擇100 nmol/L作為本研究多重PCR體系的最佳引物濃度。

a-引物濃度20 nmol/L；b-引物濃度40 nmol/L；c-引物濃度60 nmol/L；d-引物濃度80 nmol/L；e-引物濃度100 nmol/L圖2 不同引物終濃度的多重PCR擴增結果Fig.2 Multiplex PCR amplification results of different primer final concentrations注：M-100 bp Marker；泳道1、2為2個平行；泳道3為空白(下同)

2.3.3 模板量優(yōu)化

在退火溫度為62 ℃引物濃度為100 nmol/L時，用不同模板量進行多重PCR檢測，當模板量加入10 ng時，可擴增出10個條帶，但分子量較低的條帶較模糊，當模板量為25、50 ng均可擴增出清晰的產物條帶，模板量為50 ng時，10個目標條帶均最清晰，結果見圖3。因此，綜合選擇50 ng作為本研究多重PCR體系的最佳模板量。

2.4 多重PCR體系特異性驗證

1～8組分組實驗結果中，均只擴增了目標菌特異性條帶，無非特異擴增，結果見圖4。因此，本研究建立的多重PCR檢測體系具有較好的特異性。

a-模板量10 ng；b-模板量25 ng；c-模板量50 ng圖3 不同模板量的多重PCR擴增結果Fig.3 Multiplex PCR amplification results with different template amounts

a～h分別為致病菌分組1～8圖4 多重PCR體系特異性驗證結果Fig.4 Verification results of specificity of multiplex PCR systems注：M-100 bp Marker；泳道1～3為3個平行

2.5 多重PCR體系靈敏度驗證

單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、糞鏈球菌、產氣莢膜梭菌、沙門氏菌屬、克羅諾桿菌屬、志賀氏菌屬、大腸埃希氏菌O157∶H7、銅綠假單胞菌菌株的靈敏度分別為5.37×10-2、5.37×10-2、8.85×10-1、8.91×10-1、7.33×10-1、7.10×10-1、7.49×10-2、6.04×10-2、7.20×10-2、9.52×10-2ng/μL，所有菌株的靈敏度均達到10-1ng/μL，該多重PCR體系具有較高的靈敏度。

2.6 多重PCR檢測方法初步應用

通過人工污染樣品評價實驗發(fā)現(xiàn)，本研究涉及的10種致病菌在增菌后檢測靈敏度均能達到10 CFU/mL以上，且擴增條帶清晰明顯，擴增效果好，結果見圖5。本研究建立的十重PCR檢測方法對食品樣品進行前增菌處理后，可滿足檢驗需要。

a～i分別為人工污染樣品組1～9圖5 人工污染樣品靈敏度評價結果Fig.5 Evaluation results of sensitivity of artificially contaminated samples注：M-100 bp Marker；泳道5～8-菌液濃度為101、 102、103、104 CFU/mL

3 結論與討論

本研究建立了一種能夠在同一PCR反應體系中同時檢測單增細胞增生李斯特菌、沙門氏菌屬、克羅諾桿菌屬、志賀氏菌屬、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大腸埃希氏菌O157∶H7、銅綠假單胞菌、糞鏈球菌、產氣莢膜梭菌的多重PCR檢測方法，該方法具有快速、準確、實用性強的優(yōu)點。優(yōu)化后多重PCR檢測體系的退火溫度為62 ℃，最佳模板量為50 ng，最佳引物濃度為100 nmol/L，在此優(yōu)化條件下，多重PCR反應體系對10種致病菌的檢出限均可達10-1ng/μL，此外，應用于人工污染樣品檢測，該方法經過簡單增菌后，10種致病菌的檢出限均可達10 CFU/mL，而一般食品受微生物污染后，大多會呈對數(shù)生長，繁殖較快，受污染的食品中微生物量極易達到或超過10 CFU/mL，且多數(shù)致病菌需要達到一定的數(shù)量才能致病，如GB 29921—2021《食品安全國家標準 預包裝食品中致病菌限量》中金黃色葡萄球菌的最大可允許超出值多為100 CFU/g，因此，該方法可滿足目前食品中食源性致病菌快速檢測需要。

相比于普通PCR方法，本研究建立的多重PCR檢測方法可以一次反應檢測10種致病菌，極大地提高了檢測效率，降低了大量的人力、時間、試劑成本。相比于熒光定量PCR方法，本研究建立的方法所需儀器及試劑費用上具有較大優(yōu)勢，不需要合成價格較貴的探針，檢驗成本可減少2倍左右，且熒光定量PCR方法由于受熒光檢測通道的影響，一般只能同時擴增至四重或者五重，使其在致病菌篩選中的應用受到局限，無法滿足高通量檢測的需求，本研究建立的多重PCR檢測方法可避免此局限性。

本研究建立的多重PCR檢測方法只需要1次人工操作和1次PCR反應，可將傳統(tǒng)微生物檢測中所需時間從2～7 d縮短至48 h內，對于應對食品安全突發(fā)事件，具有十分突出的意義，且本方法可同時快速檢測目前食品安全抽檢工作中涉及的10種食源性致病菌，與實際檢測工作聯(lián)系十分緊密，實用性較高，儀器、試劑成本較低，操作較簡便，本方法在國內實驗室較易普及推廣，具有較高的應用價值。

本研究建立的多重PCR檢測方法仍需要通過增菌后才能實現(xiàn)檢測，這一步嚴重影響了多重PCR檢測效率，因此后期研究中需結合目標菌的富集技術，以進一步提高檢測效率，如磁珠富集和雙抗體富集技術等。此外，隨著多重PCR體系中引物對的增加，PCR產物條帶的不斷增加，為后續(xù)產物分離帶來了難點，因此多重PCR技術也可以結合除電泳技術以外的產物分離檢測技術，如發(fā)展比較成熟的液相、液質技術等，以擴大多重PCR檢測方法的應用范圍。