凌與聽，陳雙,2,3，徐巖,2,3，范文來,2,3*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(釀造微生物與應用酶學實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 3(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

中國白酒以高粱等谷物為原料，由多種微生物培養(yǎng)、開放式固態(tài)發(fā)酵、陳釀貯存等工藝生產(chǎn)而成，組分復雜且風味獨特[1]。濃香型白酒作為我國三大香型白酒之一，以“窖香濃郁、綿甜甘?！泵麚P海內外，已成為白酒市場占有率最大的主體酒種[2]。陳釀是濃香型白酒生產(chǎn)過程中不可或缺的工序，白酒在貯存過程除了發(fā)生酯的水解、酸醇的酯化及氧化還原等化學反應，還有氫鍵締合等物理變化，使風味和口感趨于協(xié)調[3]。

陳釀對提高基酒的品質非常重要，相關研究也受到極大關注。早期對濃香型白酒陳釀風味的相關研究停留在對貯存過程中總酸、總酯、還原糖等[4-6]指標變化的探索。隨后，氣相色譜等風味化學手段被投入到濃香型白酒陳釀研究中[7-10]，探究了陳釀過程中揮發(fā)性化合物的變化。已有學者對洋河大曲白酒[11-12]、劍南春酒[13]、五糧液酒[14]及沂蒙老區(qū)白酒[15]等濃香型白酒進行了不同年份酒樣的香氣組分分析，實現(xiàn)了化合物從定性到定量逐步升華的過程，研究表明貯存過程中整體呈現(xiàn)“酸增酯減”的變化規(guī)律。曹玉發(fā)等[10]從3個不同年份濃香型白酒樣品中檢出57種共有的揮發(fā)性化合物，其中己酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、正己醇、乙醛被認為是濃香型白酒中重要的香氣化合物，其含量均隨陳釀時間的增加而增加。濃香型白酒風味組成體系極具豐富性，文獻已鑒定出濃香型白酒中有超過1 000種揮發(fā)性化合物，其中超過200種具有風味貢獻[16]。相比于骨架成分，對陳釀過程中微量風味組分變化的研究相對較少。全二維氣相色譜-飛行時間質譜技術通過2種極性不同的氣相色譜柱實行正交分離，相比一維氣相色譜具備高峰容量、高靈敏度和有序色譜的優(yōu)點，能夠為解析白酒中的海量揮發(fā)性組分提供有效分離能力，特別是對于微量組分的檢測[17]。

基于對陳釀濃香型白酒“量微香大”化合物的進一步認識，本研究采用頂空固相微萃取結合全二維氣相色譜-飛行時間質譜(headspace solid phase microextraction comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry, HS-SPME-GC×GC-TOFMS)技術，以不同等級不同陳釀時間的古井貢酒為研究對象，進行了香氣組分差異特征解析，系統(tǒng)地分析了等級差異和陳釀時間差異對揮發(fā)性組分的影響，以剖析古井貢酒陳釀風味物質變化規(guī)律，為風味導向的不同陳釀時間濃香型白酒品質控制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料

原酒樣品由安徽古井貢酒股份有限公司提供，共計42個樣品，酒精度為60%(乙醇體積分數(shù))，具體信息如表1所示。由6位具備國家二級品酒師以上資格的專業(yè)評酒員進行了原酒樣品香氣品質的分級，按照香氣的優(yōu)劣將各個樣品分為了A、B、C 三類。每個評酒員在相對獨立的條件下，對酒樣進行等級評定。

表1 三個等級不同年份古井貢酒樣品信息Table 1 Information of Gujinggong Baijiu samples with three grades and different aging times

1.1.2 主要試劑

NaCl(分析純)，中國國藥上?；瘜W試劑公司；無水乙醇、C5～C30直鏈正構烷烴及試驗時所用標準品(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 主要儀器

Pegasus?4D全二維氣相色譜-飛行時間質譜儀，美國LECO公司；Rx-17 Si毛細管柱(0.8 m×0.25 mm×0.36 μm)，美國Restek公司；7890B氣相色譜儀、DB-FFAP毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Agilent公司；MPS-2型多功能自動進樣器，德國Gerstel公司；SPME三相萃取頭(2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS)，美國Supelco公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；SB-25-12D超聲波清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 HS-SPME前處理

樣品參照本團隊前期建立并優(yōu)化的方法進行處理[18]。將經(jīng)超純水系統(tǒng)處理過的水煮沸后冷卻至室溫，作為試驗用水。稀釋白酒樣品至乙醇體積分數(shù)為5%，在20 mL頂空瓶中加入5 mL稀釋后的酒樣和1.5 g NaCl至飽和，加入20 μL混合內標(正己醇d-13，色譜純，終質量濃度50 μg/L；愈創(chuàng)木酚d-3，色譜純，終質量濃度20 μg/L；叔戊酸，色譜純，終質量濃度1 197 μg/L)后迅速用帶有PTFE硅膠隔墊的空心磁性金屬蓋密封。由MPS-2型多功能進樣器進樣，相同條件下進行3次。

樣品在45 ℃條件下平衡5 min，進行攪拌萃取45 min，轉速設置為400 r/min。提取完成，以不分流模式在250 ℃的GC進樣口解吸附5 min，進行GC×GC-TOFMS檢測分析。

1.2.2 GC×GC-TOFMS 儀器條件設置

GC×GC條件：載氣He(>99.999 5%)，恒流模式，流速1 mL/min，進樣口溫度250 ℃。采用分流比為1∶1的分流模式進樣。一維色譜柱升溫程序[19]：起始溫度45 ℃，保持3 min后，以4 ℃/min升溫至150 ℃，保持2 min后，以6 ℃/min升溫至200 ℃，隨后以10 ℃/min升溫至230 ℃并保持10 min。二維柱溫保持比一維高5 ℃。調制補償溫度20 ℃。調制周期4 s(熱脈沖時間0.8 s)。

TOF/MS條件：無溶劑延遲。EI電離源的電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度240 ℃。采集質量數(shù)范圍35～400 u，采集頻率100 spectrum/s。

1.2.3 GC×GC-TOFMS 數(shù)據(jù)處理方法

定性方法：二維實驗數(shù)據(jù)由LECO公司Chroma TOF?工作站采集并進行處理，最大一維保留時間偏差為12 s，二維保留時間偏差為0.2 s，設定信噪比(S/N)>100的色譜峰被自動識別[20]。與本團隊前期建立的白酒揮發(fā)性風味數(shù)據(jù)庫(包含近3 000種揮發(fā)性組分)進行質譜比對[21]，解卷積后生成包含化合物名稱、保留指數(shù)(retention index，RI)、定量離子、一維保留時間、二維保留時間、可能性、相似度、反相似度和峰面積等信息的“峰表”。然后去除含鹵素及硅元素的化合物，在此基礎上篩選質譜正相似度和反相似度均大于700，且可能性>4 000的化合物；其次，利用相同色譜條件下C5～C30正構烷烴分析結果建立RI值計算方法，將鑒定化合物的RI值與NIST網(wǎng)站中報道的相同色譜柱下的RI值進行數(shù)據(jù)比對，篩選RI<50的物質作為具有可信度的鑒定結果[22]。

半定量方法：原始數(shù)據(jù)經(jīng)Chroma TOF?工作站中的statistical compare功能對齊色譜峰后，自動確定定量離子并得到同一化合物在不同酒樣中的峰面積。通過多級篩選策略確認進行半定量的組分后，計算待測化合物與內標峰面積的比與內標質量濃度乘積，將數(shù)值根據(jù)稀釋倍數(shù)擴大得到化合物的相對含量。其中，正己醇d-13作為沸點較低組分的內標，愈創(chuàng)木酚d-3作為高沸點化合物內標，叔戊酸作為酸類化合物內標。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SIMCA 14.0進行偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)，采用XLSTAT進行主成分分析(principal component analysis，PCA)。

2 結果與討論

2.1 采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS鑒定不同陳釀時間古井貢酒揮發(fā)性風味組分

為了更全面地解析古井貢酒中的揮發(fā)性組分特征，選擇了不同陳釀時間的酒樣進行分析，包括2004年A類酒、2012年A類酒、2018年A類酒。采用HS-SPME前處理與GC×GC-TOFMS相結合的分析方法，得到了其中揮發(fā)性組分的分析圖譜。根據(jù)多級鑒定策略，對不同陳釀時間白酒中的揮發(fā)性組分進行解析，并對其中鑒定出的組分取并集，最終得到855種揮發(fā)性化合物。然后進行化合物香氣描述的檢索，發(fā)現(xiàn)262種具有典型香氣特征的化合物，為古井貢酒中潛在的香氣活性組分。

如圖1所示，鑒定出酯類、醇類、酸類、醛酮類、呋喃類、含氮類、含硫類、酚類、萜烯類、內酯類、芳香族等11類化合物，主要提供果香、窖香、花香、烘烤香、酸味、焦糊味等香氣。除文獻中報道的60種古井貢酒主要風味組分[23]，還有一些微量的香氣化合物。

圖1 HS-SPME-GC×GC-TOFMS定性古井貢酒 揮發(fā)性香氣組分Fig.1 Qualitative volatile compounds of Gujinggong Baijiu by HS-SPME-GC×GC-TOFMS

呋喃類物質,如2-乙酰呋喃、2-乙酰基-5-甲基呋喃等，在酒體中呈現(xiàn)明顯的烘烤香。含硫化合物,如3-甲硫基丙醛,給古井貢酒帶來煮土豆香氣。含氮化合物，如2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪等閾值不高，可提供烤杏仁味[24]。還包括芳樟醇、橙花醇等萜烯類物質，呈現(xiàn)植物芳香氣息。芳樟醇在體積分數(shù)46%酒精水溶液中的閾值為13.1 μg/L，對風味有重要貢獻[25]。

為比較不同年份古井貢原酒之間成分種類上的異同點，采用直觀的維恩圖分析，結果如圖2所示。2004年的老酒中特征組分有65種，中等年份2012年的酒樣中特征組分有57種，2018年的新酒中特征組分有46種。其中，老酒特征組分呋喃類化合物有4種，中等年份酒樣特征組分中呋喃類化合物有5種，包括2-丁酰呋喃、2,3-二氫呋喃等，而新酒特征組分中沒有呋喃類化合物。特征的萜烯類化合物在老酒中有4種，中等年份酒樣中有2種，新酒中僅1種。隨著陳釀時間增加，萜烯類化合物數(shù)量增多，為酒體增添了花香、草木香。陳釀時間較短的酒樣中未檢出特有內酯類化合物，老酒中檢出特有的內酯類化合物2種。其中γ-壬內酯呈現(xiàn)椰香、甜香，可為老酒帶來重要風味貢獻。研究結果從化合物數(shù)量的角度說明了呋喃類化合物、萜烯類化合物、內酯類化合物在時間維度上具有一定規(guī)律性，這與曹玉發(fā)等[10]的結論一致。有香氣貢獻的特征化合物數(shù)量較多可以解釋老酒香氣的豐富性，表明微量風味組分種類的增加可能是年份原漿風味品質提升的重要因素。

圖2 不同年份古井貢酒中揮發(fā)性化合物韋恩圖Fig.2 Venn diagram of volatile compounds in Gujinggong Baijiu with different aging times

2.2 采用 HS-SPME-GC×GC-TOFMS 半定量不同陳釀時間古井貢酒揮發(fā)性風味組分

根據(jù)多級鑒定策略，首先對A級酒，7個年份，共37個樣品完成定性，再遵循同一年份不同平行之間物質80%出現(xiàn)原則處理數(shù)據(jù)。對在不同年份酒中檢測到的473種揮發(fā)性化合物進行半定量分析。各類物質在不同年份古井貢原酒中的含量差異非常明顯，在陳釀過程中整體呈現(xiàn)酸增酯減的趨勢。微量揮發(fā)性風味組分是隨陳釀時間變化最顯著的組分；呋喃類、芳香族、酚類、有機酸類以及萜烯類風味化合物隨陳釀時間逐漸增加對于增加年份原漿香氣的豐富性具有重要貢獻。

由于化合物本身呈香性質及其香氣閾值的限制，并非所有揮發(fā)性化合物均對白酒的香氣具有貢獻，因此有必要采用化學計量學的手段篩選出具有香氣貢獻的陳釀規(guī)律性物質。對在不同年份酒中多次出現(xiàn)的新酒特征化合物和陳酒特征化合物，利用PLS-DA模型對上述7個年份樣品進行了分離，結果如圖3-a所示，R2Y=0.973，Q2=0.852，該模型擬合準確性好。此外進行了200次的置換檢驗，通過檢驗圖(圖3-b)可以看出直線斜率大，且Q2回歸線的截距為負值，表明該模型未過擬合。

a-PLS-DA得分圖；b-200次置換檢驗圖圖3 不同年份古井貢酒揮發(fā)性組分含量PLS-DA圖Fig.3 PLS-DA plots of volatile compounds in Gujinggong Baijiu with different aging times

PLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計方法。變量投影重要度(variable importance for the projection，VIP)表征了每個變量對每組樣本分類判別的貢獻程度，通常以VIP>1作為標準來幫助篩選有意義的化合物。分析結果表明，有50個化合物的VIP>1，被認為是造成不同陳釀時間酒樣差異的重要指標。

圖4展現(xiàn)了50個化合物在不同陳釀時間酒樣中的含量變化，根據(jù)在新陳酒中的含量差異將化合物分為2組。A組是新酒酒樣中含量較高的化合物，包括2-糠呋喃、苯甲酸戊酯、(E,E)-2,4-壬二烯醛、2-甲基-1-丁醇、β-環(huán)檸檬醛、乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯等。這些化合物大多具有風味貢獻，可能造成不同陳釀時間古井貢酒風味差異。B組化合物是陳酒酒樣中含量較高的化合物，種類更為豐富，其中丙酸丙酯、3-甲硫基丙酸乙酯、2-戊酰呋喃等呈現(xiàn)果香、花香、焙烤香等令人愉悅的香氣特征，可能是構成陳酒香氣的重要風味物質。

其中酯類化合物作為濃香型白酒主體香氣物質，主要呈現(xiàn)果香、窖香的感官特征[2]。在貯存過程中，大部分酯類化合物含量隨時間增加而降低，包括乙酸異戊酯、乙酰丙酸乙酯等，而丙酸丙酯等在陳酒中含量更高(圖5-a)。

醇類化合物作為酯類物質的重要前體之一，對白酒的香氣也具有一定貢獻。如圖5-b，2-癸醇等高級醇的含量呈現(xiàn)上升趨勢。高級醇在發(fā)酵過程中主要由微生物通過分解代謝和合成代謝途徑生成，能使白酒的口感更協(xié)調和飽滿，賦予白酒特殊的香氣。

芳香族化合物為白酒提供花香、果香，是白酒中重要的香氣化合物。如圖5-c，乙酸苯乙酯、苯甲酸戊酯等芳香族化合物隨著陳釀過程含量降低。而苯乙酸丙酯的含量在陳釀過程中呈現(xiàn)上升趨勢。

如圖5-d所示，酸類化合物如苯甲酸、2-甲基乙酸等在陳釀過程中含量逐漸上升。這可能是由于酯類物質水解或醛酮類物質氧化，進而產(chǎn)生相應的酸。

呋喃類化合物是糖降解和美拉德反應的典型產(chǎn)物[27]。如圖5-e所示，順-A,A-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇和2-戊酰呋喃含量在陳釀過程中是逐漸增加的，變化非常明顯。

醛酮類化合物主要由發(fā)酵過程中的微生物代謝產(chǎn)生, 也可能由陳釀過程中醇類化合物的光氧化降解、熱氧化降解或空氣氧化產(chǎn)生[26]。大部分醛酮類物質在陳釀過程中含量逐漸升高，但如圖5-f所示，(E,E)-2,4-壬二烯醛的含量隨著陳釀時間增加呈現(xiàn)下降趨勢。

圖4 不同年份古井貢酒間具有重要差異的化合物熱圖分析Fig.4 Heat map of the volatile compounds in Gujinggong Baijiu with different aging times

萜烯及其衍生物廣泛存在于天然產(chǎn)物之中，具有獨特的植物香氣。如圖5-g，土味素和喇叭茶醇隨著陳釀時間增加其含量逐漸增加。β-環(huán)檸檬醛在新酒中含量卻普遍高于陳酒。

在含氮含硫化合物中，吡嗪類物質主要為酒體帶來焙烤香氣。如圖5-h，2,3-二甲基-5-乙基吡嗪在陳釀過程中含量逐漸降低，這與曹玉發(fā)等[10]的結論一致。而3-甲硫基丙酸乙酯等含硫化合物隨著陳釀時間增加，含量呈上升趨勢。

2.3 不同等級不同陳釀時間古井貢酒揮發(fā)性風味組分差異分析

陳釀對提高白酒風味品質的意義不言而喻，而什么樣的酒更適合陳釀目前還缺乏依據(jù)。釀造原酒風味質量的波動使企業(yè)對白酒實行了分級管理，本研究對不同等級白酒經(jīng)過貯存后組分產(chǎn)生的變化進行了探究。根據(jù)揮發(fā)性組分GC×GC-TOF/MS定性方法，對不同陳釀時間白酒中的揮發(fā)性組分進行解析，將同一等級不同年份樣品的定性結果匯總。其中A類酒中的化合物種類最多，在2004年、2012年、2018年樣品中分別鑒定出464、420和383種揮發(fā)性組分；其次是B類酒，在2004年、2012年、2018年樣品中分別含有364、410和405種揮發(fā)性組分；C類酒中的化合物種類最少，在2004年、2012年、2018年樣品中分別含有409、366和353種揮發(fā)性組分。A類酒在貯存前感官品質最優(yōu)，陳釀后化合物種類也最為豐富。

通過化學計量學，進一步分析不同等級酒陳釀后產(chǎn)生的風味差異。根據(jù)揮發(fā)性組分GC×GC-TOF/MS半定量方法，對A、B、C 三個等級不同年份酒中揮發(fā)性化合物含量進行了解析，并將數(shù)據(jù)進行了無監(jiān)督的PCA。如圖6所示,2個主成分因子累計可解釋數(shù)據(jù)的51.24%。通過PCA可以很好地分離這9個不同等級不同陳釀時間的樣品，樣品按照等級形成明顯聚集，說明陳釀時間不同帶來的影響并不明顯，等級差異成為了聚類的主要因素。結果表明，不同等級間酒樣的差異大于不同年份的差異。故優(yōu)質基酒的選擇才是成就高品質年份原漿的重要保障。

3 結論

本研究以42個不同等級不同陳釀時間的古井貢酒樣為研究對象，采用HS-SPME的前處理方法結合GC×GC-TOFMS對揮發(fā)性組分差異特征進行了全面解析。共鑒定出潛在香氣活性組分262種，通過對不同陳釀時間古井貢酒香氣組分含量的多元統(tǒng)計分析篩選出50種與年份相關的標記物，其中大部分物質屬于白酒中“量微香大”的揮發(fā)性化合物，包括呋喃類、含氮、含硫、內酯類和萜烯類香氣化合物，可能是造成新陳酒香氣差異的原因之一。探究等級和年份差異對揮發(fā)性組分的影響，結果表明陳釀時間不同帶來的影響并不明顯，不同等級間酒樣的差異大于不同年份的差異。本研究更深入地認識了陳釀古井貢酒的微量香氣化合物，豐富了濃香型白酒陳釀風味化學理論體系，對不同陳釀時間濃香型白酒品質研究具有重要意義。