秦修遠(yuǎn)，魏穎*，林毅，朱艷，谷瑞增，潘興昌

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100027)2(北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京，100027) 3(廣東健力寶股份有限公司，廣東 佛山，528100)4(合肥工業(yè)大學(xué)，安徽 合肥，230000)

海洋魚皮中蛋白質(zhì)含量豐富，且以膠原蛋白為主。以海洋魚皮為原料經(jīng)過現(xiàn)代生物酶解工藝加工制備的膠原蛋白肽不僅有蛋白質(zhì)的營養(yǎng)特性，而且也具有一定的生理活性，特別是在美容護(hù)膚方面具有抗氧化、促進(jìn)傷口愈合、免疫調(diào)節(jié)等功能[1-4]。大米肽(rice peptides, RP)是以大米蛋白為原料，經(jīng)過酶解技術(shù)獲得的小分子低聚肽類原料。課題組前期已經(jīng)針對RP的美白作用進(jìn)行了考察，RP中含有能夠在mRNA和蛋白水平上調(diào)控基因信號(hào)通路以抑制酪氨酸酶蛋白表達(dá)的特征結(jié)構(gòu)，能夠?qū)ζつw美白起促進(jìn)作用[5-6]。

大量的研究證明了具有生理活性的低聚肽復(fù)合能夠協(xié)同增效[7-9]。然而，膠原蛋白肽(collagen peptides, CP)與RP復(fù)合后對皮膚健康的作用影響尚無研究。因此，本文選取CP與RP，以不同比例復(fù)合，對其在體外保濕、體外抗氧化、體外抑制酪氨酸酶的能力進(jìn)行了研究，并基于小鼠黑素瘤細(xì)胞B16，對2種肽及其復(fù)合物對細(xì)胞內(nèi)氧化平衡及酪氨酸酶的影響進(jìn)行了評(píng)價(jià)，旨在確定CP及RP在影響皮膚保濕、皮膚美白和抗衰老方面等的作用比例，為其作用機(jī)制研究及在美容方面的潛在應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 主要材料

CP、RP，北京中食海氏生物技術(shù)有限公司；酪氨酸酶(T3824-25KU)、熒光素鈉(sodium fluorescein, FL)、(S)-6-甲氧基-2,5,7,8-四甲基色滿-2-羧酸[(S)-6-methoxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid，Trolox]，Sigma；2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(2,2′-azobis 2-methylpropionamidine dihydrochloride，AAPH)、左旋多巴(levodopa,L-DOPA)，Aldrich；PBS緩沖液、DMEM培養(yǎng)基，Thermo Fisher公司；胎牛血清、青鏈霉素溶液，Gibco；氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity, ORAC)Assay試劑盒，Abcam；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒、聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid, BCA)試劑盒，碧云天；CCK-8試劑盒，日本同仁化學(xué)研究所；硫酸銨、甘油，北京化工廠。

1.1.2 主要儀器

Spectra MR多功能酶標(biāo)儀，Dynex；AC2-6S1 ESCO生物安全柜，新加坡藝思高科技有限公司；240i直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo Fisher；SpectraMax i3x熒光酶標(biāo)儀,美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑配制

Trolox儲(chǔ)備液：Trolox配制成10 mmol/L的水溶液，使用時(shí)梯度稀釋。L-DOPA母液：將0.02 gL-DOPA溶于10 mL的PBS溶液中，分裝并儲(chǔ)存于-20 ℃。使用時(shí)按照設(shè)定的濃度梯度稀釋。酪氨酸酶母液：將1 mL PBS溶液加入至酪氨酸酶試劑瓶中，充分振蕩溶解，分裝并儲(chǔ)存于-20 ℃。使用時(shí)按照設(shè)定的濃度梯度稀釋，并置于冰上操作。

1.2.2 體外評(píng)價(jià)

1.2.2.1 保濕功能評(píng)價(jià)

參考王昌濤等[10]保濕劑性能體外評(píng)價(jià)法，并略有改動(dòng)。利用硫酸銨飽和溶液來控制干燥器內(nèi)相對濕度(relative humidity, RH)保持在81%。以2 cm×2 cm的3M膠帶粘貼在表面皿上模擬皮膚。將配制好的CP及RP溶液分別取200 μL滴加至貼有3 M膠帶的表面皿上，置于干燥器內(nèi)，分別于0和4 h稱取質(zhì)量，保濕率的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中：m0，貼有3 M膠帶的表面皿質(zhì)量，m1，放置樣品初始表面皿質(zhì)量(0 h)，m2，放置4、8 h后表面皿質(zhì)量。

1.2.2.2 體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

采用ORAC法評(píng)價(jià)樣本的總抗氧化活性，具體方法參考文獻(xiàn)，并有改動(dòng)[11-12]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：Trolox配制成250、100、50、25、12.5、6.25、0 μmol/L水溶液。于96孔板中設(shè)置空白對照組、AAPH對照組，Trolox組，各組均加入30 μL FL溶液；取PBS 270 μL于空白對照組中，60 μL于模型對照組中，30 μL于Trolox組中，之后取梯度Trolox溶液30 μL加入Trolox組；分別取AAPH溶液210 μL加入模型對照組及Trolox組。振蕩使混合均勻，設(shè)置酶標(biāo)儀激發(fā)波長為491 nm，掃描波長為512 nm，采集時(shí)間間隔3.5 ms，采集次數(shù)40次。以Trolox濃度為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)繪制曲線，計(jì)算熒光半數(shù)衰減時(shí)間。再以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，各組Trolox濃度梯度對應(yīng)的熒光半數(shù)衰減時(shí)間為縱坐標(biāo)，繪制基于Trolox的ORAC標(biāo)準(zhǔn)曲線。

CP及RP的ORAC值測定：CP及RP以PBS為溶劑，分別配制成溶液，如表1所示。根據(jù)上述方法，設(shè)置空白對照組、模型對照組及實(shí)驗(yàn)組，計(jì)算各樣本的ORAC值。

表1 待測樣品體外實(shí)驗(yàn)配制方法Table 1 Preparation method of samples to be tested in vitro

1.2.2.3 體外抑制酪氨酸酶活性評(píng)價(jià)

參考文獻(xiàn)[13-14]所述實(shí)驗(yàn)方法并有所改動(dòng)。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定L-DOPA溶液、酪氨酸酶溶液的工作體系的終濃度及孵育時(shí)間。以配制好的CP、RP及CP和RP一定比例復(fù)配的混合液與酪氨酸酶溶液配制成酶系混合物，共同孵育30 min，孵育溫度為37 ℃。同時(shí)以配制好的CP、RP及CP和RP一定比例復(fù)配的混合液與L-DOPA配制成底物混合物，共同孵育30 min，孵育溫度為37 ℃。取950 μL底物混合物加入6孔板，取50 μL酶系混合物加入到底物混合物中，振蕩3 s后立即檢測混合體系在波長490 nm下的1 min內(nèi)吸光值變化。每組數(shù)據(jù)設(shè)置3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞水平評(píng)價(jià)

1.2.3.1 B16細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠黑素瘤細(xì)胞B16，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。利用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1%青鏈霉素溶液)在37 ℃、5% CO2及充分飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合至培養(yǎng)瓶80%時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞傳代，一般培養(yǎng)3 d后可傳代。傳代方法為：棄去舊培養(yǎng)液，用PBS清洗1次，利用適量質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化(通常75 mL培養(yǎng)瓶加入1 mL胰蛋白酶消化)，制備成細(xì)胞懸液，按照1∶3傳代。當(dāng)細(xì)胞到達(dá)對數(shù)生長期時(shí)，可利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。用不含胎牛血清的空白DMEM高糖培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)整至適當(dāng)濃度，接種于細(xì)胞板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每一次實(shí)驗(yàn)應(yīng)采用同一傳代細(xì)胞。

1.2.3.2 CCK-8法檢測CP和RP的B16細(xì)胞毒性

在96孔板中加入濃度為2×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，每孔100 μL，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，在每孔中加入10 μL待測樣品或空白DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，常規(guī)培養(yǎng)2 h后，檢測波長450 nm處的吸光值。CCK-8法檢測細(xì)胞活性的計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

1.2.3.3 抗氧化活性評(píng)價(jià)

SOD活性檢測：使用25 mL培養(yǎng)瓶培養(yǎng)B16細(xì)胞，設(shè)置對照組(DMEM高糖培養(yǎng)基+B16細(xì)胞)、實(shí)驗(yàn)組(含有樣品的DMEM高糖培養(yǎng)基+B16細(xì)胞)，培養(yǎng)24 h。采用SOD試劑盒，按照上述方法將25 mL培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞制備成細(xì)胞裂解液加入到96孔板中，每孔100 μL。按照試劑盒說明書檢測B16細(xì)胞中的SOD酶活性。每組數(shù)據(jù)設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。

DCFH-DA法測定活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)：將細(xì)胞按照2×104個(gè)/mL的密度接種于不透明的96孔黑板中，設(shè)置對照組(DMEM高糖培養(yǎng)基+B16細(xì)胞)、實(shí)驗(yàn)組(含有樣品的DMEM高糖培養(yǎng)基+B16細(xì)胞)，培養(yǎng)24 h。之后向每孔中加入10 μmol/L DCFH-DA探針，常規(guī)培養(yǎng)20 min，用PBS漂洗2次，熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在激發(fā)/發(fā)射波長為485 nm/530 nm下的熒光強(qiáng)度。

1.2.3.4 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性評(píng)價(jià)

采用前述方法制備經(jīng)待測樣品培養(yǎng)的細(xì)胞裂解液，取上清液加入到96孔板中，每孔100 μL，再加入80 μLL-DOPA，常規(guī)孵育30 min，在490 nm下檢測各孔吸光值。

1.2.3.5 細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的測定

使用25 mL培養(yǎng)瓶培養(yǎng)B16細(xì)胞，設(shè)置對照組(DMEM高糖培養(yǎng)基+B16細(xì)胞+0.3 μmol/L α-MSH)、實(shí)驗(yàn)組(含有樣品的DMEM高糖培養(yǎng)基+B16細(xì)胞+0.3 μmol/L α-MSH)，培養(yǎng)24 h。去除培養(yǎng)瓶中的液體，使用胰蛋白酶消化后，收集細(xì)胞于離心管中，加入100 μL 1 mol/L NaOH溶液混勻，于80 ℃水浴30 min后，在405 nm下檢測各管中樣品的吸光值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS v20軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用單因素方差分析，若t檢驗(yàn)，P<0.05，則證明有顯著性差異，P<0.01，則證明有極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 體外保濕功能評(píng)價(jià)

皮膚的柔軟和光滑是由水分決定的，僅1%的含水量變化就能顯著改變皮膚的彈性和滲透性[15]，因此保濕功能是評(píng)價(jià)美容功能的重要指標(biāo)。以護(hù)膚品體外保濕評(píng)價(jià)常用的5%甘油為陽性對照[16]，由圖1可知，與純水組相比，5%甘油處理后的保濕率顯著提升。在設(shè)定的實(shí)驗(yàn)條件下，CP單獨(dú)使用的保濕效果與5%甘油無顯著性差異，且要好于RP單獨(dú)使用；而CP與RP復(fù)配組的結(jié)果顯示，CP與RP的比例設(shè)置為2∶1、3∶1、4∶1和5∶1時(shí)，與RP單獨(dú)使用組有顯著性差異，與5%甘油無顯著性差異。

圖1 CP與RP體外保濕結(jié)果Fig.1 Results of moisturizing for CP and RP in vivo注：*表示與RP組有顯著性差異(P<0.05)

2.2 體外抗氧化結(jié)果

氧化致皮膚衰老是指活性氧簇隨著年齡增長或應(yīng)激反應(yīng)無法及時(shí)清除而大量累積，與細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)結(jié)合造成不可修復(fù)損傷的過程[17-18]。因此，抗氧化能力是考察美容功能的重要指標(biāo)。經(jīng)Excel軟件處理得到Trolox相對熒光強(qiáng)度隨時(shí)間衰減的凈面積作為縱坐標(biāo)，以Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度作為橫坐標(biāo)，繪制Trolox系列標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.133 4x+0.085 2，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 7，如圖2所示。

圖2 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Trolox standard curve

不同濃度的CP、RP及CP和RP一定比例復(fù)配的混合液對氧自由基的吸收能力(ORAC)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。體外過氧自由基吸收能力(ORAC)測定的結(jié)果以Trolox當(dāng)量表示，與RP相比，CP對于過氧自由基的吸收能力更強(qiáng)，具有更好的抗氧化性。當(dāng)CP與RP以一定比例復(fù)合后，抗氧化能力隨CP含量的增強(qiáng)呈梯度劑量效應(yīng)。當(dāng)CP與RP的混合比例在4∶1和5∶1時(shí)，ORAC值與比例為3∶1的結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)，但與比例為2∶1組的結(jié)果有顯著性差異(P<0.05)。

圖3 CP、RP及其復(fù)合物體外抗氧化(ORAC)結(jié)果Fig.3 Antioxidant (ORAC) results of CP, RP and their complexes in vitro注：#表示與CP∶RP=2∶1組有顯著性差異(P<0.05)

2.3 體外抑制酪氨酸酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

酪氨酸酶活性測定法具有測定時(shí)間短、操作簡便、所需費(fèi)用低的特點(diǎn)，適用于對美白劑進(jìn)行快速篩選[19]。CP、RP及2種原料復(fù)配對酪氨酸酶的抑制活性結(jié)果如圖4所示。

圖4 CP、RP及其復(fù)合物體外抑制酪氨酸酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Results of inhibition of tyrosinase by CP, RP and their complexes in vitro注：#，與CP組相比，差異顯著(P<0.05)，##差異 極顯著(P<0.01)；*，與RP組相比差異顯著(P<0.05)， **，差異極顯著(P<0.01)(下同)

在單獨(dú)使用時(shí)，RP比CP的酪氨酸酶抑制活性更強(qiáng)且差異極顯著，但當(dāng)二者復(fù)配時(shí)呈現(xiàn)出了不同的結(jié)果。CP與RP以1∶1的比例復(fù)配時(shí)，酪氨酸酶抑制活性與RP單獨(dú)使用無顯著差異(P>0.05)，但與CP單獨(dú)使用差異顯著(P<0.05)，此外，隨著CP與RP比例的升高至1∶4和1∶5時(shí)，酪氨酸酶活性抑制率與CP呈極顯著差異(P<0.01)。當(dāng)CP與RP以2∶1比例復(fù)配時(shí)，對酪氨酸酶的抑制率效果最好，且高于其他復(fù)配比例組合的結(jié)果，與RP、CP單獨(dú)使用組的結(jié)果差異極顯著(P<0.01)。說明RP與CP的復(fù)配對酪氨酸酶的抑制活性并非簡單疊加，而是協(xié)同增效。因此，結(jié)合體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇CP∶RP=1∶1、2∶1和3∶1進(jìn)行下一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的探討。

2.4 CCK-8法確定待測樣品的B16細(xì)胞毒性

采用CCK-8法對不同濃度的RP、CP及CP與RP的復(fù)配溶液進(jìn)行了B16細(xì)胞毒性考察，結(jié)果如表2所示。綜合各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率，樣品質(zhì)量濃度為200 μg/mL組與空白組無顯著性差異，因此選擇樣品質(zhì)量濃度為200 μg/mL作為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的樣品添加濃度。

表2 CCK-8法測定細(xì)胞毒性結(jié)果Table 2 Cytotoxicity determination (CCK-8)

2.5 RP、CP及其復(fù)合物對B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的影響

皮膚中黑色素的生成過程的關(guān)鍵限速酶是酪氨酸酶[20]，酪氨酸酶將酪氨酸催化生成多巴、多巴醌，再通過進(jìn)一步的生化反應(yīng)生成黑色素。為研究RP和CP及其復(fù)合物對B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的影響檢測了B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性。如圖5所示，與空白組相比，經(jīng)過RP、CP及其復(fù)合物處理的B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性均有降低。CP與RP以2∶1的比例復(fù)合對細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性抑制效果最佳，且與RP組、CP組差異極顯著(P<0.01)，當(dāng)比例為3∶1時(shí)，與RP組差異顯著(P<0.05)。由此可知，對于抑制B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的最佳復(fù)配比例為CP∶RP=2∶1。

2.6 RP、CP及其復(fù)合物對B16細(xì)胞內(nèi)抗氧化水平的影響

細(xì)胞內(nèi)過量的的ROS能夠引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，消耗抗氧化物質(zhì)或?qū)е驴寡趸甘Щ?，誘導(dǎo)黑色素細(xì)胞增殖和激活黑色素生成的關(guān)鍵酶，刺激黑色素生成[21]。SOD是廣泛存在于生物體內(nèi)的抗氧化酶，在維持機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用[22]。因此，細(xì)胞內(nèi)ROS和SOD水平能夠反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化的水平。圖6和圖7的結(jié)果顯示，隨著RP、CP及其復(fù)合物的加入，細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低，SOD活力升高。且當(dāng)二者復(fù)合時(shí)，抗氧化效果更好。同時(shí)，CP與RP以2∶1的比例復(fù)合時(shí)，ROS相對含量與RP組、CP組差異極顯著(P<0.01)，SOD活力與RP組、CP組差異極顯著(P<0.01)，抗氧化水平最強(qiáng)。

圖6 CP、RP及其復(fù)合物對B16細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.6 Effects of CP, RP and their complexes on ROS level in B16

圖7 CP、RP及其復(fù)合物對B16細(xì)胞內(nèi)SOD活力的影響Fig.7 Effects of CP, RP and their complexes on SOD activity in B16

3 結(jié)論

體外抗氧化實(shí)驗(yàn)(ORAC)法檢測得到的最佳抗氧化復(fù)配肽的比例為CP∶RP=3∶1，這與B16細(xì)胞內(nèi)SOD酶活性和ROS含量檢測對應(yīng)的復(fù)配肽比例CP∶RP=2∶1不一致，這可能與抗氧化物質(zhì)、自由基以及二者之間的作用機(jī)制的復(fù)雜性相關(guān)。事實(shí)上，沒有任何1種單一反應(yīng)可以精確地反映所有自由基混合物中所有的抗氧化劑的抗氧化能力?？寡趸瘎┫到y(tǒng)包括酶，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等，還包括一些大分子，如白蛋白、銅藍(lán)蛋白、鐵蛋白等，也包括一些小分子，如抗壞血酸、生育酚、泛素-10、還原型谷胱甘肽等。因此，難以單獨(dú)測量組織中每種抗氧化成分以及不同抗氧化成分之間的相互作用。因此，以O(shè)RAC等為代表的總抗氧化能力測定方法，由于其高特異性而被廣泛使用。然而，ORAC也具有一定缺陷，例如，CAO等[23]認(rèn)為，ORAC法與TEAC法對抗氧化水平的檢測結(jié)果可能不具有相關(guān)性。

盡管CP與RP均具有一定的抗氧化性和保濕性能，且對于酪氨酸酶活性具有一定的抑制作用，但是CP在抗氧化和保濕方面具有更好的效果，而RP在抑制酪氨酸酶活性方面效果更佳。因此，為了尋求1款在促進(jìn)皮膚健康方面功效更全面的原料，將CP和RP進(jìn)行了復(fù)配，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)配原料能夠在促進(jìn)保濕、抗氧化和抑制酪氨酸酶活性方面能夠比單一原料使用協(xié)同增效。

CP與RP以2∶1的比例復(fù)配，能夠表現(xiàn)出比5%甘油更強(qiáng)的體外保濕效果；體外生化實(shí)驗(yàn)中，具有比2種肽原料單獨(dú)使用或以其他比例復(fù)配更強(qiáng)的酪氨酸酶抑制活性；并在小鼠黑素瘤細(xì)胞B16的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，能夠清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基，提高細(xì)胞內(nèi)SOD酶的活力，顯著降低酪氨酸酶的活性。