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        影響傳統(tǒng)米酒酒藥發(fā)酵特性的關(guān)鍵因素分析

        2022-09-16 13:40:04李昊穎徐巖王棟
        食品與發(fā)酵工業(yè) 2022年17期
        關(guān)鍵詞:酒藥米酒糖化

        李昊穎,徐巖,王棟*

        1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

        中國傳統(tǒng)米酒,是以優(yōu)質(zhì)稻米作為原料,添加自然培養(yǎng)的糖化發(fā)酵劑酒藥后發(fā)酵釀制而成的傳統(tǒng)酒精飲料[1]。其歷史悠久,風(fēng)味獨(dú)特,長久以來深受國人青睞。一般釀造米酒經(jīng)常被認(rèn)為是屬于黃酒的范疇,但由于釀造工藝的差異,如不以麥曲作為糖化劑等,米酒的品質(zhì)及風(fēng)味特性與中國傳統(tǒng)典型黃酒有明顯差異[2]。中國米酒類型眾多,具有較明顯的地域特征,不同地區(qū)的米酒可以呈現(xiàn)截然不同的釀造特點(diǎn)和品質(zhì)差異[3-4]。近年來米酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,但與黃酒相比,米酒研究相對較少,對于造成米酒品質(zhì)差異的原因仍缺乏清晰的認(rèn)識,對不同類型米酒的可控生產(chǎn)以及米酒品質(zhì)的改善,仍有較大的困難。

        雖然米酒釀造較為廣泛,但傳統(tǒng)米酒的釀造方式一般都為典型的邊糖化邊發(fā)酵、高濃度、多菌種混合發(fā)酵方式,其中釀造微生物主要來源于酒藥[5]。酒藥中的霉菌等糖化微生物分泌水解酶進(jìn)行原料的糖化,同時酵母進(jìn)行酒精的發(fā)酵[6]。由于不同來源的酒藥具有不同的發(fā)酵特性,因此對米酒的釀造和品質(zhì)有著顯著的影響[7],甚至決定了米酒的類型。鄒凌波等[8]研究發(fā)現(xiàn),傳統(tǒng)釀造米酒可分為高酒精度低糖型和低酒精度高糖型2種主要類型。釀造這2類米酒的酒藥分別為糖化發(fā)酵型酒藥(saccharification and fermentation-type Jiuyao,SFJ)和糖化型酒藥(saccharification-type Jiuyao,SJ)。但是關(guān)于這2類酒藥的內(nèi)在差異并不明晰,同時由于缺少明確的指標(biāo)參數(shù),對酒藥進(jìn)行快速分類或評價也比較困難,通常需要經(jīng)過較長時間的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)才能確定[1]。

        酒藥中存在含有包括霉菌、酵母和細(xì)菌等數(shù)十個種屬的微生物。其中優(yōu)勢霉菌主要是根霉(Rhizopus)、曲霉(Aspergillus)和毛霉(Mucor)屬微生物[9],根霉屬微生物是酒藥中糖化相關(guān)酶類的最主要貢獻(xiàn)者[1]。優(yōu)勢酵母在絕大部分酒藥中主要是非酒精發(fā)酵的扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)[10],而且許多酒藥中的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)含量很低,卻有較好的酒精發(fā)酵能力[9]。一般認(rèn)為,釀酒酵母的數(shù)量及其發(fā)酵特性是影響酒藥發(fā)酵性能的主要因素,同時米酒發(fā)酵過程中還原糖、α-氨基氮等營養(yǎng)成分和環(huán)境因素也會對酵母的生長代謝有顯著影響。有研究表明,高濃度葡萄糖對于釀酒酵母的生長代謝有抑制作用[11]。在葡萄酒釀造中,不同的釀酒酵母發(fā)酵對于氮源的需要也存在較明顯的差異[12]。當(dāng)發(fā)酵液的可溶性固形物濃度大于21 °Bx時,需要酵母可同化氮含量至少達(dá)到200 mg/L,才能使釀酒酵母正常生長。啤酒釀造中,啤酒酵母的增殖對α-氨基氮含量及組成也有要求,其中α-氨基氮主要由蛋白酶催化谷物蛋白分解產(chǎn)生[5]。由于米酒高濃度、多菌種以及雙邊發(fā)酵的特殊性,高濃度還原糖的抑制、氨態(tài)氮的相對不足等現(xiàn)象可能更容易發(fā)生,進(jìn)而影響米酒的發(fā)酵。相關(guān)研究目前很少見, 而明確影響傳統(tǒng)酒藥發(fā)酵特性的關(guān)鍵因素,對于更好地理解米酒發(fā)酵過程及品質(zhì)控制十分重要。

        本研究主要針對米酒中最主要的大米釀造米酒(不含其他輔料或添加劑以及不添加酒精的發(fā)酵米酒)所用的2種不同類型的典型酒藥(即SJ和SFJ),基于米酒發(fā)酵過程中的多個發(fā)酵參數(shù)考察其發(fā)酵特性差異,分析探討造成這2種酒藥發(fā)酵特性差異的主要原因, 為更好地理解米酒的發(fā)酵機(jī)制,科學(xué)地評價酒藥類型及質(zhì)量提供一定的參考。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料

        大米,市售;糖化型酒藥SJ,江蘇某米酒生產(chǎn)企業(yè);糖化發(fā)酵型酒藥SFJ,湖北某米酒生產(chǎn)企業(yè);釀酒酵母分離自SFJ的酵母,并于實(shí)驗(yàn)室保存;酸性蛋白酶(食品級),市售。

        1.1.2 主要試劑

        NaOH、H2SO4、Na2CO3、三氯乙酸、無水葡萄糖、可溶性淀粉、KIO3、HCl,分析純,上海國藥集團(tuán);無水茚三酮、3,5 - 二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)、無水乙醇,色譜純,美國Sigma-Aldrich 公司。

        1.1.3 主要儀器

        SYNERGY純水儀,美國 Millipore 公司;PL2002電子天平,瑞士 Mettler Toledo 公司;5810R臺式高速離心機(jī),德國 Eppendorf 公司;恒溫培養(yǎng)箱,上海博迅醫(yī)療生物儀器公司;CYTATION3酶標(biāo)儀,美國 Bio-Tek 公司;1260 Infinity II高效液相色譜儀,美國Agilent公司。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 酒藥提取液的制備

        參照文獻(xiàn)[14],利用白酒酒曲浸提法,將0.5 g酒藥粉碎后溶于20 mL緩沖液中,于30 ℃搖床200 r/min振蕩浸提40 min后,8 000 r/min離心,上清液作為酒藥提取液備用(1 mL酒藥提取液含酶量=0.025 g酒藥含酶量)。

        1.2.2 實(shí)驗(yàn)室條件米酒的發(fā)酵及米酒酒液的準(zhǔn)備

        參照文獻(xiàn)[15]的方法,選定米酒酒藥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室條件下的米酒釀造。取原料大米100 g,室溫(25 ℃)浸泡24 h后蒸飯,迅速冷卻至室溫,以料水比1∶2.5(g∶mL),加酒藥0.5 g加水拌勻搭窩,于30 ℃靜置發(fā)酵。每日定時從米酒酒醪中取樣,經(jīng)10 000 r/min離心5 min后得到米酒酒液備用。

        1.2.3 主要理化指標(biāo)分析

        酒藥的發(fā)酵力按照失重法進(jìn)行測定[1]。酒藥的發(fā)酵力(g/0.5 g酒藥)定義為在本實(shí)驗(yàn)條件下,添加 0.5 g 酒藥,在 30 ℃米酒發(fā)酵過程中,72 h內(nèi)由于發(fā)酵產(chǎn)生CO2導(dǎo)致發(fā)酵醪液質(zhì)量的損失。米酒的發(fā)酵質(zhì)量損失(g)定義為本實(shí)驗(yàn)條件下,添加 0.5 g 酒藥,在 30 ℃米酒發(fā)酵過程中,每24 h 由于發(fā)酵產(chǎn)生CO2導(dǎo)致發(fā)酵醪液質(zhì)量的損失。

        米酒及酒藥還原糖含量測定采用DNS法[16]。酒藥還原糖含量通過測定酒藥提取液中還原糖含量換算得到。米酒乙醇含量采用HPLC測定[17]。米酒及酒藥α-氨基氮含量采用茚三酮比色法測定[18]。酒藥α-氨基氮含量通過測定酒藥提取液中α-氨基氮含量換算得到。

        米酒及酒藥糖化酶活力測定按照文獻(xiàn)[19]的方法。1個酶活力單位(U/g)定義為1 g酒藥或1 mL米酒酒液在40 ℃、pH 4.6下,1 h水解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖所需要的酶量。米酒及酒藥淀粉酶活力測定參照文獻(xiàn)[20]的碘比色法。1個酶活力單位(U/g)定義為1 g酒藥或1 mL米酒酒液在60 ℃、pH 6.0下,5 min內(nèi)水解1 mg淀粉所需要的酶量。米酒及酒藥酸性蛋白酶活力測定按照GB 1886.174—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 食品工業(yè)用酶制劑》進(jìn)行測定,1個酶活力單位(U/g)定義為,1 g酒藥或1 mL米酒酒液在40 ℃、pH 3.0 條件下,1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg 酪氨酸所需要的酶量。

        米酒發(fā)酵過程中發(fā)酵液酵母的計數(shù)采用血細(xì)胞計數(shù)板法[21]。酒藥中釀酒酵母數(shù)量的測定方法采用熒光定量PCR法[22]。

        1.2.4 不同因素對米酒發(fā)酵的影響

        本研究主要考察酒藥中酵母數(shù)、蛋白酶及發(fā)酵過程中還原糖對米酒發(fā)酵的影響。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計詳見表1。其中在SJ進(jìn)行米酒發(fā)酵時,于發(fā)酵起始0 h時分別添加活化后的釀酒酵母和蛋白酶,分別得到發(fā)酵初始酵母濃度與SFJ類似的模擬酒藥樣品(SJ-酵母),發(fā)酵初始蛋白酶活力略高于SFJ的模擬酒藥樣品(SJ-蛋白酶);于SJ發(fā)酵進(jìn)行到48 h時添加蛋白酶,得到蛋白酶活力接近此時SFJ蛋白酶活力的發(fā)酵樣品(SJ-補(bǔ)加蛋白酶),以未添加的樣品SJ和SFJ作為對照。

        表1 不同因素對米酒發(fā)酵影響的實(shí)驗(yàn)設(shè)計Table 1 The experimental design about the influence of different factors on the fermentation of Mijiu

        考察還原糖的影響時,對于SFJ和SJ-蛋白酶樣品,于發(fā)酵進(jìn)行到48 h時添加葡萄糖溶液,分別得到還原糖含量達(dá)到200 g/L以上(略高于此時SJ發(fā)酵液還原糖含量)的發(fā)酵樣品(SFJ-還原糖和SJ-蛋白酶+還原糖),并以未添加葡萄糖的樣品SFJ和SJ-蛋白酶為對照。

        1.2.5 數(shù)據(jù)分析

        用SPSS進(jìn)行方差分析(ANOVA)及相關(guān)性分析并進(jìn)行t檢驗(yàn)。使用Origin進(jìn)行相關(guān)性系數(shù)熱圖繪制。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同類型酒藥釀造米酒發(fā)酵過程差異分析

        利用2種不同類型的典型酒藥進(jìn)行米酒發(fā)酵,發(fā)酵過程各參數(shù)變化如圖1所示。SFJ在發(fā)酵48 h后發(fā)酵質(zhì)量損失就顯著增加,96 h時達(dá)到質(zhì)量損失高峰(圖1-a),發(fā)酵168 h時酒精積累可達(dá)15%左右(圖1-c)。而SJ發(fā)酵質(zhì)量損失變化遲緩,還原糖和α-氨基氮含量變化在24 h內(nèi)與SFJ發(fā)酵過程類似,而后基本沒有顯著消耗(圖1-a、圖1-b、圖1-d),酒精積累量很低(圖1-c)。兩者的發(fā)酵過程基本符合高度低糖型和低度高糖型米酒的發(fā)酵特點(diǎn)[8]。

        a-發(fā)酵質(zhì)量損失;b-還原糖含量;c-酒精含量;d-α-氨基氮含量;e-酵母濃度;f-糖化酶活力;g-α-淀粉酶活力;h-酸性蛋白酶活力圖1 兩種典型酒藥米酒釀造過程中發(fā)酵參數(shù)的變化Fig.1 Changes of fermentation parameters during the brewing process of Mijiu with two typical Jiuyao

        從發(fā)酵過程的酵母數(shù)和相關(guān)酶活性分析(圖1-e~圖1-h)可以看出, 相較于SJ樣品,SFJ發(fā)酵至48 h后,其發(fā)酵表現(xiàn)旺盛主要是由于酵母迅速增殖。同時SFJ發(fā)酵過程中糖化酶、α-淀粉酶活力明顯下降,但2個樣品的蛋白酶活性變化趨勢基本類似。此外,在SFJ發(fā)酵過程中,α-氨基氮的含量相對較低,可能與其酵母的快速生長消耗較多的α-氨基氮有關(guān)。造成上述發(fā)酵差異的主要原因可能與2種酒藥的釀酒酵母以及發(fā)酵開始后淀粉水解酶類活性不同造成的還原糖含量差異有關(guān)。

        對這2種米酒酒藥主要發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行測定,結(jié)果如表2所示。整體而言,這2種酒藥的發(fā)酵參數(shù)存在顯著差異。除還原糖外,SFJ各項(xiàng)參數(shù)均顯著高于SJ。由于米酒發(fā)酵中酒藥用量較小,不同酒藥中還原糖和α-氨基氮含量的差異實(shí)際上對發(fā)酵過程相關(guān)參數(shù)的影響很小。

        表2 兩種酒藥的主要發(fā)酵參數(shù)Table 2 Main fermentation parameters of two kinds of Jiuyao

        除去還原糖和α-氨基氮含量,進(jìn)一步對酒藥其他發(fā)酵參數(shù)與發(fā)酵過程參數(shù)進(jìn)行了相關(guān)性分析。如圖2所示,與發(fā)酵過程參數(shù)比較相關(guān)的主要是酒藥的酸性蛋白酶活力和α-淀粉酶活力。一般認(rèn)為,酵母的生長和代謝是決定酒精發(fā)酵過程的主要因素。

        根據(jù)表2的數(shù)據(jù),雖然SFJ中的釀酒酵母數(shù)量明顯較高,約為SJ的10倍, 但是相關(guān)性分析(圖2)顯示,酒藥中的酵母數(shù)量與發(fā)酵過程整體參數(shù)變化相關(guān)性不大,可能不是引起二者發(fā)酵差異的主要因素。而與發(fā)酵過程中酵母數(shù)量變化整體較為相關(guān)的是酒藥的蛋白酶活力。根據(jù)表2的結(jié)果,SFJ的酸性蛋白酶活力遠(yuǎn)高于SJ(近6倍)。由于釀酒酵母的生長與α-氨基氮含量密切相關(guān)[23],而蛋白酶直接影響α-氨基氮的含量,雖然發(fā)酵過程中兩者的蛋白酶活力變化差異不大,但發(fā)酵初期蛋白酶活力的差異可能是影響這2種酒藥發(fā)酵差異的一個重要因素,其影響著酵母能否在發(fā)酵前期快速增殖,進(jìn)而影響酒精的發(fā)酵。但酒藥的蛋白酶活力與發(fā)酵過程α-氨基氮含量的變化整體上相關(guān)性不大。雖然蛋白質(zhì)是水解產(chǎn)生α-氨基氮的主要因素,但由于酵母的消耗,使得兩者的整體相關(guān)性不強(qiáng)。關(guān)于蛋白酶在米酒發(fā)酵中的作用,相關(guān)研究目前還不多見。

        α-淀粉酶和糖化酶主要用于糖化過程中淀粉的水解和還原糖的產(chǎn)生。但是相關(guān)性分析(圖2)顯示,酒藥的α-淀粉酶和糖化酶活力整體上并未表現(xiàn)出與發(fā)酵過程中還原糖含量有明確的相關(guān)性,這可能也主要與酵母對糖的消耗有關(guān)。雖然酒藥的液化酶和糖化酶活力是目前分析酒藥質(zhì)量的常用指標(biāo),但直接用于評價酒藥類型和品質(zhì)并不恰當(dāng)[1,24-25],他們可能主要是通過發(fā)酵過程中引起糖含量的變化而起作用。米酒發(fā)酵過程中,釀酒酵母的生長有時會受到高還原糖濃度的抑制[26],特別是甜型米酒積累的高還原糖濃度可能會影響酵母的發(fā)酵。雖然SFJ的糖化酶與淀粉酶活力均明顯高于SJ(表2),發(fā)酵0~24 h時SFJ也具有相對較高的淀粉水解酶活性和還原糖含量(圖1-b、圖1-f、圖1-g),但隨著酵母的迅速增加(圖1-e),還原糖被快速消耗(圖1-b),避免了高濃度還原糖的影響。而SJ酒藥在發(fā)酵前期(0~72 h)酵母增殖較慢(圖1-e)隨著還原糖的積累,進(jìn)而可能會抑制酵母的生長和代謝,使得SJ米酒發(fā)酵質(zhì)量損失一直處于較低的水平(圖1-a)。

        根據(jù)以上結(jié)果,造成SFJ發(fā)酵性能高于SJ的原因可能與酒藥中的釀酒酵母數(shù)量關(guān)系不大。2種酒藥的發(fā)酵特性差異可能主要與蛋白酶影響了發(fā)酵初期酵母增殖有關(guān),也可能受到發(fā)酵過程中積累了高濃度的還原糖影響。為了明確影響酒藥發(fā)酵特性的關(guān)鍵因素,進(jìn)一步對酵母和還原糖濃度對米酒發(fā)酵的影響進(jìn)行考察。

        2.2 發(fā)酵參數(shù)控制對酒藥米酒發(fā)酵特性的影響

        2.2.1 酒藥酵母含量及蛋白酶活力對米酒發(fā)酵的影響

        根據(jù)SFJ和SJ兩種酒藥中酵母數(shù)量和蛋白酶活力的差異,通過控制SJ發(fā)酵初始時的酵母含量和蛋白酶活性作為模擬酒藥,考察這2個因素對酒藥發(fā)酵性能的影響。

        利用SJ在發(fā)酵0 h時分別添加釀酒酵母得到的SJ-酵母(模擬酵母含量較高的SFJ酒藥)和添加酸性蛋白酶得到的SJ-蛋白酶(模擬酸性蛋白酶活性較高的SFJ酒藥)兩個樣品,分別進(jìn)行發(fā)酵。

        如圖3-a~圖3-c所示,發(fā)酵24 h和48 h后,兩者就分別開始出現(xiàn)較明顯的發(fā)酵質(zhì)量損失增加、還原糖消耗加快和酒精明顯積累的現(xiàn)象。為了進(jìn)一步驗(yàn)證酸性蛋白酶對SJ發(fā)酵米酒的影響,在SJ米酒發(fā)酵至48 h時再添加酸性蛋白酶(SJ-補(bǔ)加蛋白酶樣品),觀察其與發(fā)酵初始添加的差異。此時添加酸性蛋白酶雖然顯著提高了之后的α-氨基氮水平(圖3-d),但并不能促進(jìn)米酒的發(fā)酵,其他發(fā)酵參數(shù)與對照的SJ樣品比較類似,而與初始添加酸性蛋白酶的SJ-蛋白酶樣品存在顯著差異。綜上,初始添加釀酒酵母和酸性蛋白酶都可以明顯改善酒藥的發(fā)酵性能。且初始添加酸性蛋白酶可以使SJ整體發(fā)酵特點(diǎn)和酶活力變化趨勢更加接近SFJ,最終的酒精產(chǎn)率也更高,而48 h時再添加酸性蛋白酶對米酒發(fā)酵影響不大。綜上,酒藥中的釀酒酵母數(shù)量和酸性蛋白酶活力對酒藥的發(fā)酵特性都有重要影響,但兩者的作用存在差異。

        a-發(fā)酵質(zhì)量損失;b-還原糖含量;c-酒精含量;d-α-氨基氮含量;e-酵母濃度;f-糖化酶活力;g-α-淀粉酶活力;h-酸性蛋白酶活力圖3 初始釀酒酵母數(shù)及蛋白酶活性對糖化型酒藥SJ米酒發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of initial yeast number and protease activity on the fermentation of Mijiu with Jiuyao SJ

        造成這種現(xiàn)象的原因應(yīng)該與釀酒酵母在發(fā)酵初期的增殖密切相關(guān),而酵母含量的變化影響了整個發(fā)酵過程。由于釀酒酵母的添加,使得SJ-酵母樣品的酵母數(shù)量在發(fā)酵24 h后就開始明顯增加(圖3-e),從而表現(xiàn)出其發(fā)酵質(zhì)量損失顯著提升,并較早達(dá)到質(zhì)量損失的高峰。但由于酵母數(shù)激增,α-氨基氮消耗過快,影響了發(fā)酵中后期酵母的生長代謝,最終影響了乙醇的產(chǎn)量。而發(fā)酵初始蛋白酶的添加,使得SJ-蛋白酶樣品在發(fā)酵初期大量產(chǎn)生α-氨基氮(圖3-d),α-氨基氮供應(yīng)的改善,促進(jìn)了酵母的繁殖(圖3-e),使得發(fā)酵48~72 h質(zhì)量損失顯著提升(圖3-a)。雖然SJ-蛋白酶樣品在發(fā)酵初始釀酒酵母數(shù)較低,但由于具有較高的蛋白酶活力,使得該樣品仍然得到了類似于SFJ的發(fā)酵結(jié)果,表明酒藥的酸性蛋白酶活力對于釀酒酵母的增殖以及米酒的發(fā)酵似乎比酵母數(shù)更為重要。由于釀酒酵母在自然酒藥中的廣泛存在,而酒藥的酸性蛋白酶對于酵母的增殖具有明顯的促進(jìn)作用,因此,酒藥的酸性蛋白酶活力可以認(rèn)為是調(diào)節(jié)酒藥發(fā)酵特性,甚至改變酒藥類型的一個關(guān)鍵因素。

        值得注意的是,SJ在米酒發(fā)酵至24 h后,其α-氨基氮含量高于SFJ發(fā)酵樣品(圖1-d),但其酵母仍未大量繁殖。而發(fā)酵至48 h時再添加酸性蛋白酶(圖3,SJ-補(bǔ)加蛋白酶樣品),添加之后α-氨基氮含量得到了顯著提高,但也未能促進(jìn)其酵母增殖,增加發(fā)酵質(zhì)量損失(圖3-a、圖3-e),可能是SJ和SFJ中釀酒酵母的發(fā)酵特性不同導(dǎo)致。SJ中的釀酒酵母可能需要更高濃度的α-氨基氮才能在發(fā)酵初期大量繁殖進(jìn)行發(fā)酵,正如發(fā)酵初始添加蛋白酶的SJ樣品(SJ-蛋白酶)所表現(xiàn)的一樣(圖3-a、圖3-d、圖3-e)。在對照樣品SJ的發(fā)酵初期,由于α-氨基氮含量難以滿足其酵母增殖的要求,導(dǎo)致酵母增殖緩慢,發(fā)酵質(zhì)量損失水平較低(圖1-a、圖1-d、圖1-e)。雖然48 h后α-氨基氮通過逐漸積累或者補(bǔ)加蛋白酶而增加到較高水平(圖3-d),但由于其他因素的影響,如還原糖積累到較高濃度可能對釀酒酵母的增殖產(chǎn)生抑制,出現(xiàn)類似葡萄酒遲滯發(fā)酵的情況[13],最終造成發(fā)酵質(zhì)量損失始終處于較低水平。因此,發(fā)酵初期充足的α-氨基氮供應(yīng),對于酒藥的發(fā)酵性能是十分重要的。而發(fā)酵初期α-氨基氮的供應(yīng)主要與酒藥的酸性蛋白酶活力有關(guān)。這進(jìn)一步表明酸性蛋白酶活力對于酒藥發(fā)酵特性的重要性。

        綜上所述,雖然釀酒酵母的數(shù)量及其發(fā)酵特性對于酒藥的發(fā)酵性能非常重要,但是酸性蛋白酶活力可能對其發(fā)酵性能更為關(guān)鍵,更適合于在米酒的實(shí)際生產(chǎn)中,通過調(diào)控發(fā)酵初期α-氨基氮水平促進(jìn)釀酒酵母的增殖,進(jìn)而改變酒藥的發(fā)酵特性。在本研究中,SJ-蛋白酶樣品由于在發(fā)酵初始添加了酸性蛋白酶,從而產(chǎn)生了足夠的α-氨基氮,令酵母于發(fā)酵初期大量繁殖,使得SJ中的酵母數(shù)量及其發(fā)酵特性不再是影響酒藥發(fā)酵性能的關(guān)鍵因素,基本達(dá)到了SFJ的發(fā)酵水平,實(shí)現(xiàn)了從糖化型酒藥到糖化發(fā)酵型酒藥的轉(zhuǎn)變。王斯維等[1]在模擬米酒發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)適當(dāng)提高蛋白酶活力可以增加米酒的發(fā)酵質(zhì)量損失和乙醇含量,說明酒藥的蛋白酶活力對于酒藥發(fā)酵力有重要作用。CAI等[9]也發(fā)現(xiàn)酒精產(chǎn)率較高的酒藥其蛋白酶活性也較高。因此,酒藥的酸性蛋白酶活力可作為區(qū)分糖化型酒藥和糖化發(fā)酵型酒藥的一個重要依據(jù)。當(dāng)然,這一結(jié)論還需要得到更多研究的驗(yàn)證。此外,過量的蛋白酶也會產(chǎn)生更高含量的α-氨基氮,從而可能產(chǎn)生過多的高級醇,影響米酒的風(fēng)味與品質(zhì)[1]。控制酸性蛋白酶活性在合適的水平,仍然需要進(jìn)一步研究。

        2.2.2 發(fā)酵過程中還原糖含量對酒藥米酒發(fā)酵的影響

        造成SFJ與SJ發(fā)酵差異的另一個可能因素是發(fā)酵過程中較高的還原糖濃度會對酵母增殖產(chǎn)生抑制。48 h是2種米酒發(fā)酵出現(xiàn)明顯差異的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),在48 h前,兩者的發(fā)酵表現(xiàn)基本類似,48 h后SJ樣品的還原糖及糖化酶和α-淀粉酶水平較明顯地高于SFJ(圖1)。

        如圖4所示,添加了還原糖的SFJ米酒發(fā)酵樣品(SFJ-還原糖),其發(fā)酵質(zhì)量損失與對照SFJ米酒發(fā)酵差別不大(圖4-a)。而對于初始添加酸性蛋白酶的SJ樣品,48 h補(bǔ)加還原糖后,SJ-蛋白酶+還原糖的發(fā)酵明顯受到抑制。該樣品的發(fā)酵特點(diǎn)整體上更接近于未添加的對照樣品SJ,而與僅初始添加蛋白酶的SJ-蛋白酶樣品產(chǎn)生明顯差異。

        以上結(jié)果表明,較高濃度的還原糖對不同酒藥的發(fā)酵進(jìn)程產(chǎn)生的影響不同。由于自然酒藥中的酵母發(fā)酵特性存在差異,除了對氮源的需求不同外,對較高濃度的還原糖抗性也存在差異[13, 27-28]。SFJ中的酵母對高濃度還原糖的抗性較高,因此還原糖含量的提高并未影響SFJ的米酒發(fā)酵,這一特性有利于此類酒藥生產(chǎn)較高酒精度的米酒。而對于SJ,其中的酵母明顯對還原糖的抗性較弱,一旦還原糖濃度升高到一定程度,就會對酵母產(chǎn)生抑制,影響酒精發(fā)酵。這種特性顯然也有利于高糖度、低酒精度的甜型米酒的生產(chǎn)。同時這也解釋了之前SJ發(fā)酵24 h以后以及發(fā)酵48 h補(bǔ)加酸性蛋白酶后,在較高α-氨基氮條件下,仍然未能得到較高發(fā)酵質(zhì)量損失的原因(圖1、圖3-a)。雖然不同酵母對高濃度還原糖抗性不同,由于米酒發(fā)酵首先需要進(jìn)行糖化,發(fā)酵初始還原糖濃度通常不高,只要釀酒酵母能夠迅速增殖,及時消耗還原糖,維持還原糖濃度在較低的水平,就能夠?qū)崿F(xiàn)邊糖化邊發(fā)酵。而要使酵母迅速增殖,酸性蛋白酶提供α-氨基氮仍然是關(guān)鍵因素。

        a-發(fā)酵質(zhì)量損失;b-還原糖含量;c-酒精含量;d-α-氨基氮含量;e-酵母濃度;f-糖化酶活力;g-α-淀粉酶活力;h-酸性蛋白酶活力圖4 發(fā)酵過程中還原糖濃度變化對2種不同酒藥米酒發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of reducing sugar content on fermentation of Mijiu with two different Jiuyao

        3 結(jié)論

        本研究針對自然培養(yǎng)的2種不同類型米酒酒藥,糖化型酒藥(SJ)和糖化發(fā)酵型酒藥(SFJ),通過米酒發(fā)酵,對這2種酒藥的發(fā)酵特性差異及其影響因素進(jìn)行了分析?;诰扑幹饕l(fā)酵參數(shù)與米酒發(fā)酵過程參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析,通過調(diào)節(jié)發(fā)酵參數(shù)、模擬不同酒藥進(jìn)行的米酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,雖然酒藥中釀酒酵母的數(shù)量及其發(fā)酵特性對于酒藥的發(fā)酵性能非常重要,但是酒藥的酸性蛋白酶活力可能是能夠調(diào)節(jié)酒藥發(fā)酵特性的一個更為關(guān)鍵的因素。通過提高酒藥的酸性蛋白酶活力,可在發(fā)酵初期提供必要的α-氨基氮,從而促使釀酒酵母增殖更快,進(jìn)而提高其發(fā)酵力,甚至可以將糖化型酒藥轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔l(fā)酵型酒藥。因此,酒藥的酸性蛋白酶活力可作為一個預(yù)測米酒發(fā)酵特性的重要指標(biāo)以及酒藥分類的重要依據(jù)。但是作為指標(biāo)的酸性蛋白酶活力水平,尚需進(jìn)一步確定。目前關(guān)于酒藥蛋白酶對米酒發(fā)酵的影響研究尚不多見,而本研究中涉及酒藥的樣本數(shù)量也有限,研究結(jié)論還需要得到更多的實(shí)踐檢驗(yàn)。本研究結(jié)果為米酒酒藥的分類以及米酒生產(chǎn)的質(zhì)量控制提供了一定的參考。

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