李昊穎，徐巖，王棟*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

中國(guó)傳統(tǒng)米酒，是以優(yōu)質(zhì)稻米作為原料，添加自然培養(yǎng)的糖化發(fā)酵劑酒藥后發(fā)酵釀制而成的傳統(tǒng)酒精飲料[1]。其歷史悠久，風(fēng)味獨(dú)特，長(zhǎng)久以來深受國(guó)人青睞。一般釀造米酒經(jīng)常被認(rèn)為是屬于黃酒的范疇，但由于釀造工藝的差異，如不以麥曲作為糖化劑等，米酒的品質(zhì)及風(fēng)味特性與中國(guó)傳統(tǒng)典型黃酒有明顯差異[2]。中國(guó)米酒類型眾多，具有較明顯的地域特征，不同地區(qū)的米酒可以呈現(xiàn)截然不同的釀造特點(diǎn)和品質(zhì)差異[3-4]。近年來米酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，但與黃酒相比，米酒研究相對(duì)較少，對(duì)于造成米酒品質(zhì)差異的原因仍缺乏清晰的認(rèn)識(shí)，對(duì)不同類型米酒的可控生產(chǎn)以及米酒品質(zhì)的改善，仍有較大的困難。

雖然米酒釀造較為廣泛，但傳統(tǒng)米酒的釀造方式一般都為典型的邊糖化邊發(fā)酵、高濃度、多菌種混合發(fā)酵方式，其中釀造微生物主要來源于酒藥[5]。酒藥中的霉菌等糖化微生物分泌水解酶進(jìn)行原料的糖化，同時(shí)酵母進(jìn)行酒精的發(fā)酵[6]。由于不同來源的酒藥具有不同的發(fā)酵特性，因此對(duì)米酒的釀造和品質(zhì)有著顯著的影響[7]，甚至決定了米酒的類型。鄒凌波等[8]研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)釀造米酒可分為高酒精度低糖型和低酒精度高糖型2種主要類型。釀造這2類米酒的酒藥分別為糖化發(fā)酵型酒藥(saccharification and fermentation-type Jiuyao，SFJ)和糖化型酒藥(saccharification-type Jiuyao，SJ)。但是關(guān)于這2類酒藥的內(nèi)在差異并不明晰，同時(shí)由于缺少明確的指標(biāo)參數(shù)，對(duì)酒藥進(jìn)行快速分類或評(píng)價(jià)也比較困難，通常需要經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)才能確定[1]。

酒藥中存在含有包括霉菌、酵母和細(xì)菌等數(shù)十個(gè)種屬的微生物。其中優(yōu)勢(shì)霉菌主要是根霉(Rhizopus)、曲霉(Aspergillus)和毛霉(Mucor)屬微生物[9]，根霉屬微生物是酒藥中糖化相關(guān)酶類的最主要貢獻(xiàn)者[1]。優(yōu)勢(shì)酵母在絕大部分酒藥中主要是非酒精發(fā)酵的扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)[10]，而且許多酒藥中的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)含量很低，卻有較好的酒精發(fā)酵能力[9]。一般認(rèn)為，釀酒酵母的數(shù)量及其發(fā)酵特性是影響酒藥發(fā)酵性能的主要因素，同時(shí)米酒發(fā)酵過程中還原糖、α-氨基氮等營(yíng)養(yǎng)成分和環(huán)境因素也會(huì)對(duì)酵母的生長(zhǎng)代謝有顯著影響。有研究表明，高濃度葡萄糖對(duì)于釀酒酵母的生長(zhǎng)代謝有抑制作用[11]。在葡萄酒釀造中，不同的釀酒酵母發(fā)酵對(duì)于氮源的需要也存在較明顯的差異[12]。當(dāng)發(fā)酵液的可溶性固形物濃度大于21 °Bx時(shí)，需要酵母可同化氮含量至少達(dá)到200 mg/L，才能使釀酒酵母正常生長(zhǎng)。啤酒釀造中，啤酒酵母的增殖對(duì)α-氨基氮含量及組成也有要求，其中α-氨基氮主要由蛋白酶催化谷物蛋白分解產(chǎn)生[5]。由于米酒高濃度、多菌種以及雙邊發(fā)酵的特殊性，高濃度還原糖的抑制、氨態(tài)氮的相對(duì)不足等現(xiàn)象可能更容易發(fā)生，進(jìn)而影響米酒的發(fā)酵。相關(guān)研究目前很少見， 而明確影響傳統(tǒng)酒藥發(fā)酵特性的關(guān)鍵因素，對(duì)于更好地理解米酒發(fā)酵過程及品質(zhì)控制十分重要。

本研究主要針對(duì)米酒中最主要的大米釀造米酒(不含其他輔料或添加劑以及不添加酒精的發(fā)酵米酒)所用的2種不同類型的典型酒藥(即SJ和SFJ)，基于米酒發(fā)酵過程中的多個(gè)發(fā)酵參數(shù)考察其發(fā)酵特性差異，分析探討造成這2種酒藥發(fā)酵特性差異的主要原因， 為更好地理解米酒的發(fā)酵機(jī)制，科學(xué)地評(píng)價(jià)酒藥類型及質(zhì)量提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料

大米，市售；糖化型酒藥SJ，江蘇某米酒生產(chǎn)企業(yè)；糖化發(fā)酵型酒藥SFJ，湖北某米酒生產(chǎn)企業(yè)；釀酒酵母分離自SFJ的酵母，并于實(shí)驗(yàn)室保存；酸性蛋白酶(食品級(jí))，市售。

1.1.2 主要試劑

NaOH、H2SO4、Na2CO3、三氯乙酸、無(wú)水葡萄糖、可溶性淀粉、KIO3、HCl,分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)；無(wú)水茚三酮、3,5 - 二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)、無(wú)水乙醇，色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司。

1.1.3 主要儀器

SYNERGY純水儀，美國(guó) Millipore 公司；PL2002電子天平，瑞士 Mettler Toledo 公司；5810R臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó) Eppendorf 公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器公司；CYTATION3酶標(biāo)儀，美國(guó) Bio-Tek 公司；1260 Infinity II高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酒藥提取液的制備

參照文獻(xiàn)[14]，利用白酒酒曲浸提法，將0.5 g酒藥粉碎后溶于20 mL緩沖液中，于30 ℃搖床200 r/min振蕩浸提40 min后，8 000 r/min離心，上清液作為酒藥提取液備用(1 mL酒藥提取液含酶量=0.025 g酒藥含酶量)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)室條件米酒的發(fā)酵及米酒酒液的準(zhǔn)備

參照文獻(xiàn)[15]的方法，選定米酒酒藥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室條件下的米酒釀造。取原料大米100 g，室溫(25 ℃)浸泡24 h后蒸飯，迅速冷卻至室溫，以料水比1∶2.5(g∶mL),加酒藥0.5 g加水拌勻搭窩，于30 ℃靜置發(fā)酵。每日定時(shí)從米酒酒醪中取樣，經(jīng)10 000 r/min離心5 min后得到米酒酒液備用。

1.2.3 主要理化指標(biāo)分析

酒藥的發(fā)酵力按照失重法進(jìn)行測(cè)定[1]。酒藥的發(fā)酵力(g/0.5 g酒藥)定義為在本實(shí)驗(yàn)條件下，添加 0.5 g 酒藥，在 30 ℃米酒發(fā)酵過程中，72 h內(nèi)由于發(fā)酵產(chǎn)生CO2導(dǎo)致發(fā)酵醪液質(zhì)量的損失。米酒的發(fā)酵質(zhì)量損失(g)定義為本實(shí)驗(yàn)條件下，添加 0.5 g 酒藥，在 30 ℃米酒發(fā)酵過程中，每24 h 由于發(fā)酵產(chǎn)生CO2導(dǎo)致發(fā)酵醪液質(zhì)量的損失。

米酒及酒藥還原糖含量測(cè)定采用DNS法[16]。酒藥還原糖含量通過測(cè)定酒藥提取液中還原糖含量換算得到。米酒乙醇含量采用HPLC測(cè)定[17]。米酒及酒藥α-氨基氮含量采用茚三酮比色法測(cè)定[18]。酒藥α-氨基氮含量通過測(cè)定酒藥提取液中α-氨基氮含量換算得到。

米酒及酒藥糖化酶活力測(cè)定按照文獻(xiàn)[19]的方法。1個(gè)酶活力單位(U/g)定義為1 g酒藥或1 mL米酒酒液在40 ℃、pH 4.6下，1 h水解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖所需要的酶量。米酒及酒藥淀粉酶活力測(cè)定參照文獻(xiàn)[20]的碘比色法。1個(gè)酶活力單位(U/g)定義為1 g酒藥或1 mL米酒酒液在60 ℃、pH 6.0下，5 min內(nèi)水解1 mg淀粉所需要的酶量。米酒及酒藥酸性蛋白酶活力測(cè)定按照GB 1886.174—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 食品工業(yè)用酶制劑》進(jìn)行測(cè)定，1個(gè)酶活力單位(U/g)定義為，1 g酒藥或1 mL米酒酒液在40 ℃、pH 3.0 條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg 酪氨酸所需要的酶量。

米酒發(fā)酵過程中發(fā)酵液酵母的計(jì)數(shù)采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法[21]。酒藥中釀酒酵母數(shù)量的測(cè)定方法采用熒光定量PCR法[22]。

1.2.4 不同因素對(duì)米酒發(fā)酵的影響

本研究主要考察酒藥中酵母數(shù)、蛋白酶及發(fā)酵過程中還原糖對(duì)米酒發(fā)酵的影響。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)詳見表1。其中在SJ進(jìn)行米酒發(fā)酵時(shí)，于發(fā)酵起始0 h時(shí)分別添加活化后的釀酒酵母和蛋白酶，分別得到發(fā)酵初始酵母濃度與SFJ類似的模擬酒藥樣品(SJ-酵母)，發(fā)酵初始蛋白酶活力略高于SFJ的模擬酒藥樣品(SJ-蛋白酶)；于SJ發(fā)酵進(jìn)行到48 h時(shí)添加蛋白酶，得到蛋白酶活力接近此時(shí)SFJ蛋白酶活力的發(fā)酵樣品(SJ-補(bǔ)加蛋白酶)，以未添加的樣品SJ和SFJ作為對(duì)照。

表1 不同因素對(duì)米酒發(fā)酵影響的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 The experimental design about the influence of different factors on the fermentation of Mijiu

考察還原糖的影響時(shí)，對(duì)于SFJ和SJ-蛋白酶樣品，于發(fā)酵進(jìn)行到48 h時(shí)添加葡萄糖溶液，分別得到還原糖含量達(dá)到200 g/L以上(略高于此時(shí)SJ發(fā)酵液還原糖含量)的發(fā)酵樣品(SFJ-還原糖和SJ-蛋白酶+還原糖)，并以未添加葡萄糖的樣品SFJ和SJ-蛋白酶為對(duì)照。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS進(jìn)行方差分析(ANOVA)及相關(guān)性分析并進(jìn)行t檢驗(yàn)。使用Origin進(jìn)行相關(guān)性系數(shù)熱圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型酒藥釀造米酒發(fā)酵過程差異分析

利用2種不同類型的典型酒藥進(jìn)行米酒發(fā)酵，發(fā)酵過程各參數(shù)變化如圖1所示。SFJ在發(fā)酵48 h后發(fā)酵質(zhì)量損失就顯著增加，96 h時(shí)達(dá)到質(zhì)量損失高峰(圖1-a)，發(fā)酵168 h時(shí)酒精積累可達(dá)15%左右(圖1-c)。而SJ發(fā)酵質(zhì)量損失變化遲緩，還原糖和α-氨基氮含量變化在24 h內(nèi)與SFJ發(fā)酵過程類似，而后基本沒有顯著消耗(圖1-a、圖1-b、圖1-d)，酒精積累量很低(圖1-c)。兩者的發(fā)酵過程基本符合高度低糖型和低度高糖型米酒的發(fā)酵特點(diǎn)[8]。

a-發(fā)酵質(zhì)量損失；b-還原糖含量；c-酒精含量；d-α-氨基氮含量；e-酵母濃度；f-糖化酶活力；g-α-淀粉酶活力；h-酸性蛋白酶活力圖1 兩種典型酒藥米酒釀造過程中發(fā)酵參數(shù)的變化Fig.1 Changes of fermentation parameters during the brewing process of Mijiu with two typical Jiuyao

從發(fā)酵過程的酵母數(shù)和相關(guān)酶活性分析(圖1-e～圖1-h)可以看出， 相較于SJ樣品，SFJ發(fā)酵至48 h后，其發(fā)酵表現(xiàn)旺盛主要是由于酵母迅速增殖。同時(shí)SFJ發(fā)酵過程中糖化酶、α-淀粉酶活力明顯下降，但2個(gè)樣品的蛋白酶活性變化趨勢(shì)基本類似。此外，在SFJ發(fā)酵過程中，α-氨基氮的含量相對(duì)較低，可能與其酵母的快速生長(zhǎng)消耗較多的α-氨基氮有關(guān)。造成上述發(fā)酵差異的主要原因可能與2種酒藥的釀酒酵母以及發(fā)酵開始后淀粉水解酶類活性不同造成的還原糖含量差異有關(guān)。

對(duì)這2種米酒酒藥主要發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示。整體而言，這2種酒藥的發(fā)酵參數(shù)存在顯著差異。除還原糖外，SFJ各項(xiàng)參數(shù)均顯著高于SJ。由于米酒發(fā)酵中酒藥用量較小，不同酒藥中還原糖和α-氨基氮含量的差異實(shí)際上對(duì)發(fā)酵過程相關(guān)參數(shù)的影響很小。

表2 兩種酒藥的主要發(fā)酵參數(shù)Table 2 Main fermentation parameters of two kinds of Jiuyao

除去還原糖和α-氨基氮含量，進(jìn)一步對(duì)酒藥其他發(fā)酵參數(shù)與發(fā)酵過程參數(shù)進(jìn)行了相關(guān)性分析。如圖2所示，與發(fā)酵過程參數(shù)比較相關(guān)的主要是酒藥的酸性蛋白酶活力和α-淀粉酶活力。一般認(rèn)為，酵母的生長(zhǎng)和代謝是決定酒精發(fā)酵過程的主要因素。

根據(jù)表2的數(shù)據(jù)，雖然SFJ中的釀酒酵母數(shù)量明顯較高，約為SJ的10倍， 但是相關(guān)性分析(圖2)顯示，酒藥中的酵母數(shù)量與發(fā)酵過程整體參數(shù)變化相關(guān)性不大，可能不是引起二者發(fā)酵差異的主要因素。而與發(fā)酵過程中酵母數(shù)量變化整體較為相關(guān)的是酒藥的蛋白酶活力。根據(jù)表2的結(jié)果，SFJ的酸性蛋白酶活力遠(yuǎn)高于SJ(近6倍)。由于釀酒酵母的生長(zhǎng)與α-氨基氮含量密切相關(guān)[23]，而蛋白酶直接影響α-氨基氮的含量，雖然發(fā)酵過程中兩者的蛋白酶活力變化差異不大，但發(fā)酵初期蛋白酶活力的差異可能是影響這2種酒藥發(fā)酵差異的一個(gè)重要因素，其影響著酵母能否在發(fā)酵前期快速增殖，進(jìn)而影響酒精的發(fā)酵。但酒藥的蛋白酶活力與發(fā)酵過程α-氨基氮含量的變化整體上相關(guān)性不大。雖然蛋白質(zhì)是水解產(chǎn)生α-氨基氮的主要因素，但由于酵母的消耗，使得兩者的整體相關(guān)性不強(qiáng)。關(guān)于蛋白酶在米酒發(fā)酵中的作用，相關(guān)研究目前還不多見。

α-淀粉酶和糖化酶主要用于糖化過程中淀粉的水解和還原糖的產(chǎn)生。但是相關(guān)性分析(圖2)顯示，酒藥的α-淀粉酶和糖化酶活力整體上并未表現(xiàn)出與發(fā)酵過程中還原糖含量有明確的相關(guān)性，這可能也主要與酵母對(duì)糖的消耗有關(guān)。雖然酒藥的液化酶和糖化酶活力是目前分析酒藥質(zhì)量的常用指標(biāo)，但直接用于評(píng)價(jià)酒藥類型和品質(zhì)并不恰當(dāng)[1,24-25]，他們可能主要是通過發(fā)酵過程中引起糖含量的變化而起作用。米酒發(fā)酵過程中，釀酒酵母的生長(zhǎng)有時(shí)會(huì)受到高還原糖濃度的抑制[26]，特別是甜型米酒積累的高還原糖濃度可能會(huì)影響酵母的發(fā)酵。雖然SFJ的糖化酶與淀粉酶活力均明顯高于SJ(表2)，發(fā)酵0～24 h時(shí)SFJ也具有相對(duì)較高的淀粉水解酶活性和還原糖含量(圖1-b、圖1-f、圖1-g)，但隨著酵母的迅速增加(圖1-e)，還原糖被快速消耗(圖1-b)，避免了高濃度還原糖的影響。而SJ酒藥在發(fā)酵前期(0～72 h)酵母增殖較慢(圖1-e)隨著還原糖的積累，進(jìn)而可能會(huì)抑制酵母的生長(zhǎng)和代謝，使得SJ米酒發(fā)酵質(zhì)量損失一直處于較低的水平(圖1-a)。

根據(jù)以上結(jié)果，造成SFJ發(fā)酵性能高于SJ的原因可能與酒藥中的釀酒酵母數(shù)量關(guān)系不大。2種酒藥的發(fā)酵特性差異可能主要與蛋白酶影響了發(fā)酵初期酵母增殖有關(guān)，也可能受到發(fā)酵過程中積累了高濃度的還原糖影響。為了明確影響酒藥發(fā)酵特性的關(guān)鍵因素，進(jìn)一步對(duì)酵母和還原糖濃度對(duì)米酒發(fā)酵的影響進(jìn)行考察。

2.2 發(fā)酵參數(shù)控制對(duì)酒藥米酒發(fā)酵特性的影響

2.2.1 酒藥酵母含量及蛋白酶活力對(duì)米酒發(fā)酵的影響

根據(jù)SFJ和SJ兩種酒藥中酵母數(shù)量和蛋白酶活力的差異，通過控制SJ發(fā)酵初始時(shí)的酵母含量和蛋白酶活性作為模擬酒藥，考察這2個(gè)因素對(duì)酒藥發(fā)酵性能的影響。

利用SJ在發(fā)酵0 h時(shí)分別添加釀酒酵母得到的SJ-酵母(模擬酵母含量較高的SFJ酒藥)和添加酸性蛋白酶得到的SJ-蛋白酶(模擬酸性蛋白酶活性較高的SFJ酒藥)兩個(gè)樣品，分別進(jìn)行發(fā)酵。

如圖3-a～圖3-c所示，發(fā)酵24 h和48 h后，兩者就分別開始出現(xiàn)較明顯的發(fā)酵質(zhì)量損失增加、還原糖消耗加快和酒精明顯積累的現(xiàn)象。為了進(jìn)一步驗(yàn)證酸性蛋白酶對(duì)SJ發(fā)酵米酒的影響，在SJ米酒發(fā)酵至48 h時(shí)再添加酸性蛋白酶(SJ-補(bǔ)加蛋白酶樣品)，觀察其與發(fā)酵初始添加的差異。此時(shí)添加酸性蛋白酶雖然顯著提高了之后的α-氨基氮水平(圖3-d)，但并不能促進(jìn)米酒的發(fā)酵，其他發(fā)酵參數(shù)與對(duì)照的SJ樣品比較類似，而與初始添加酸性蛋白酶的SJ-蛋白酶樣品存在顯著差異。綜上，初始添加釀酒酵母和酸性蛋白酶都可以明顯改善酒藥的發(fā)酵性能。且初始添加酸性蛋白酶可以使SJ整體發(fā)酵特點(diǎn)和酶活力變化趨勢(shì)更加接近SFJ，最終的酒精產(chǎn)率也更高，而48 h時(shí)再添加酸性蛋白酶對(duì)米酒發(fā)酵影響不大。綜上，酒藥中的釀酒酵母數(shù)量和酸性蛋白酶活力對(duì)酒藥的發(fā)酵特性都有重要影響，但兩者的作用存在差異。

a-發(fā)酵質(zhì)量損失；b-還原糖含量；c-酒精含量；d-α-氨基氮含量；e-酵母濃度；f-糖化酶活力；g-α-淀粉酶活力；h-酸性蛋白酶活力圖3 初始釀酒酵母數(shù)及蛋白酶活性對(duì)糖化型酒藥SJ米酒發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of initial yeast number and protease activity on the fermentation of Mijiu with Jiuyao SJ

造成這種現(xiàn)象的原因應(yīng)該與釀酒酵母在發(fā)酵初期的增殖密切相關(guān)，而酵母含量的變化影響了整個(gè)發(fā)酵過程。由于釀酒酵母的添加，使得SJ-酵母樣品的酵母數(shù)量在發(fā)酵24 h后就開始明顯增加(圖3-e)，從而表現(xiàn)出其發(fā)酵質(zhì)量損失顯著提升，并較早達(dá)到質(zhì)量損失的高峰。但由于酵母數(shù)激增，α-氨基氮消耗過快，影響了發(fā)酵中后期酵母的生長(zhǎng)代謝，最終影響了乙醇的產(chǎn)量。而發(fā)酵初始蛋白酶的添加，使得SJ-蛋白酶樣品在發(fā)酵初期大量產(chǎn)生α-氨基氮(圖3-d)，α-氨基氮供應(yīng)的改善，促進(jìn)了酵母的繁殖(圖3-e)，使得發(fā)酵48～72 h質(zhì)量損失顯著提升(圖3-a)。雖然SJ-蛋白酶樣品在發(fā)酵初始釀酒酵母數(shù)較低，但由于具有較高的蛋白酶活力，使得該樣品仍然得到了類似于SFJ的發(fā)酵結(jié)果，表明酒藥的酸性蛋白酶活力對(duì)于釀酒酵母的增殖以及米酒的發(fā)酵似乎比酵母數(shù)更為重要。由于釀酒酵母在自然酒藥中的廣泛存在，而酒藥的酸性蛋白酶對(duì)于酵母的增殖具有明顯的促進(jìn)作用，因此，酒藥的酸性蛋白酶活力可以認(rèn)為是調(diào)節(jié)酒藥發(fā)酵特性，甚至改變酒藥類型的一個(gè)關(guān)鍵因素。

值得注意的是，SJ在米酒發(fā)酵至24 h后，其α-氨基氮含量高于SFJ發(fā)酵樣品(圖1-d)，但其酵母仍未大量繁殖。而發(fā)酵至48 h時(shí)再添加酸性蛋白酶(圖3，SJ-補(bǔ)加蛋白酶樣品)，添加之后α-氨基氮含量得到了顯著提高，但也未能促進(jìn)其酵母增殖，增加發(fā)酵質(zhì)量損失(圖3-a、圖3-e)，可能是SJ和SFJ中釀酒酵母的發(fā)酵特性不同導(dǎo)致。SJ中的釀酒酵母可能需要更高濃度的α-氨基氮才能在發(fā)酵初期大量繁殖進(jìn)行發(fā)酵，正如發(fā)酵初始添加蛋白酶的SJ樣品(SJ-蛋白酶)所表現(xiàn)的一樣(圖3-a、圖3-d、圖3-e)。在對(duì)照樣品SJ的發(fā)酵初期，由于α-氨基氮含量難以滿足其酵母增殖的要求，導(dǎo)致酵母增殖緩慢，發(fā)酵質(zhì)量損失水平較低(圖1-a、圖1-d、圖1-e)。雖然48 h后α-氨基氮通過逐漸積累或者補(bǔ)加蛋白酶而增加到較高水平(圖3-d)，但由于其他因素的影響，如還原糖積累到較高濃度可能對(duì)釀酒酵母的增殖產(chǎn)生抑制，出現(xiàn)類似葡萄酒遲滯發(fā)酵的情況[13]，最終造成發(fā)酵質(zhì)量損失始終處于較低水平。因此，發(fā)酵初期充足的α-氨基氮供應(yīng)，對(duì)于酒藥的發(fā)酵性能是十分重要的。而發(fā)酵初期α-氨基氮的供應(yīng)主要與酒藥的酸性蛋白酶活力有關(guān)。這進(jìn)一步表明酸性蛋白酶活力對(duì)于酒藥發(fā)酵特性的重要性。

綜上所述，雖然釀酒酵母的數(shù)量及其發(fā)酵特性對(duì)于酒藥的發(fā)酵性能非常重要，但是酸性蛋白酶活力可能對(duì)其發(fā)酵性能更為關(guān)鍵，更適合于在米酒的實(shí)際生產(chǎn)中，通過調(diào)控發(fā)酵初期α-氨基氮水平促進(jìn)釀酒酵母的增殖，進(jìn)而改變酒藥的發(fā)酵特性。在本研究中，SJ-蛋白酶樣品由于在發(fā)酵初始添加了酸性蛋白酶，從而產(chǎn)生了足夠的α-氨基氮，令酵母于發(fā)酵初期大量繁殖，使得SJ中的酵母數(shù)量及其發(fā)酵特性不再是影響酒藥發(fā)酵性能的關(guān)鍵因素，基本達(dá)到了SFJ的發(fā)酵水平，實(shí)現(xiàn)了從糖化型酒藥到糖化發(fā)酵型酒藥的轉(zhuǎn)變。王斯維等[1]在模擬米酒發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)適當(dāng)提高蛋白酶活力可以增加米酒的發(fā)酵質(zhì)量損失和乙醇含量，說明酒藥的蛋白酶活力對(duì)于酒藥發(fā)酵力有重要作用。CAI等[9]也發(fā)現(xiàn)酒精產(chǎn)率較高的酒藥其蛋白酶活性也較高。因此，酒藥的酸性蛋白酶活力可作為區(qū)分糖化型酒藥和糖化發(fā)酵型酒藥的一個(gè)重要依據(jù)。當(dāng)然，這一結(jié)論還需要得到更多研究的驗(yàn)證。此外，過量的蛋白酶也會(huì)產(chǎn)生更高含量的α-氨基氮，從而可能產(chǎn)生過多的高級(jí)醇，影響米酒的風(fēng)味與品質(zhì)[1]?？刂扑嵝缘鞍酌富钚栽诤线m的水平，仍然需要進(jìn)一步研究。

2.2.2 發(fā)酵過程中還原糖含量對(duì)酒藥米酒發(fā)酵的影響

造成SFJ與SJ發(fā)酵差異的另一個(gè)可能因素是發(fā)酵過程中較高的還原糖濃度會(huì)對(duì)酵母增殖產(chǎn)生抑制。48 h是2種米酒發(fā)酵出現(xiàn)明顯差異的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，在48 h前，兩者的發(fā)酵表現(xiàn)基本類似，48 h后SJ樣品的還原糖及糖化酶和α-淀粉酶水平較明顯地高于SFJ(圖1)。

如圖4所示，添加了還原糖的SFJ米酒發(fā)酵樣品(SFJ-還原糖)，其發(fā)酵質(zhì)量損失與對(duì)照SFJ米酒發(fā)酵差別不大(圖4-a)。而對(duì)于初始添加酸性蛋白酶的SJ樣品，48 h補(bǔ)加還原糖后，SJ-蛋白酶+還原糖的發(fā)酵明顯受到抑制。該樣品的發(fā)酵特點(diǎn)整體上更接近于未添加的對(duì)照樣品SJ，而與僅初始添加蛋白酶的SJ-蛋白酶樣品產(chǎn)生明顯差異。

以上結(jié)果表明，較高濃度的還原糖對(duì)不同酒藥的發(fā)酵進(jìn)程產(chǎn)生的影響不同。由于自然酒藥中的酵母發(fā)酵特性存在差異，除了對(duì)氮源的需求不同外，對(duì)較高濃度的還原糖抗性也存在差異[13, 27-28]。SFJ中的酵母對(duì)高濃度還原糖的抗性較高，因此還原糖含量的提高并未影響SFJ的米酒發(fā)酵，這一特性有利于此類酒藥生產(chǎn)較高酒精度的米酒。而對(duì)于SJ，其中的酵母明顯對(duì)還原糖的抗性較弱，一旦還原糖濃度升高到一定程度，就會(huì)對(duì)酵母產(chǎn)生抑制，影響酒精發(fā)酵。這種特性顯然也有利于高糖度、低酒精度的甜型米酒的生產(chǎn)。同時(shí)這也解釋了之前SJ發(fā)酵24 h以后以及發(fā)酵48 h補(bǔ)加酸性蛋白酶后，在較高α-氨基氮條件下，仍然未能得到較高發(fā)酵質(zhì)量損失的原因(圖1、圖3-a)。雖然不同酵母對(duì)高濃度還原糖抗性不同，由于米酒發(fā)酵首先需要進(jìn)行糖化，發(fā)酵初始還原糖濃度通常不高，只要釀酒酵母能夠迅速增殖，及時(shí)消耗還原糖，維持還原糖濃度在較低的水平，就能夠?qū)崿F(xiàn)邊糖化邊發(fā)酵。而要使酵母迅速增殖，酸性蛋白酶提供α-氨基氮仍然是關(guān)鍵因素。

a-發(fā)酵質(zhì)量損失；b-還原糖含量；c-酒精含量；d-α-氨基氮含量；e-酵母濃度；f-糖化酶活力；g-α-淀粉酶活力；h-酸性蛋白酶活力圖4 發(fā)酵過程中還原糖濃度變化對(duì)2種不同酒藥米酒發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of reducing sugar content on fermentation of Mijiu with two different Jiuyao

3 結(jié)論

本研究針對(duì)自然培養(yǎng)的2種不同類型米酒酒藥，糖化型酒藥(SJ)和糖化發(fā)酵型酒藥(SFJ)，通過米酒發(fā)酵，對(duì)這2種酒藥的發(fā)酵特性差異及其影響因素進(jìn)行了分析?；诰扑幹饕l(fā)酵參數(shù)與米酒發(fā)酵過程參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，通過調(diào)節(jié)發(fā)酵參數(shù)、模擬不同酒藥進(jìn)行的米酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，雖然酒藥中釀酒酵母的數(shù)量及其發(fā)酵特性對(duì)于酒藥的發(fā)酵性能非常重要，但是酒藥的酸性蛋白酶活力可能是能夠調(diào)節(jié)酒藥發(fā)酵特性的一個(gè)更為關(guān)鍵的因素。通過提高酒藥的酸性蛋白酶活力，可在發(fā)酵初期提供必要的α-氨基氮，從而促使釀酒酵母增殖更快，進(jìn)而提高其發(fā)酵力，甚至可以將糖化型酒藥轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔l(fā)酵型酒藥。因此，酒藥的酸性蛋白酶活力可作為一個(gè)預(yù)測(cè)米酒發(fā)酵特性的重要指標(biāo)以及酒藥分類的重要依據(jù)。但是作為指標(biāo)的酸性蛋白酶活力水平，尚需進(jìn)一步確定。目前關(guān)于酒藥蛋白酶對(duì)米酒發(fā)酵的影響研究尚不多見，而本研究中涉及酒藥的樣本數(shù)量也有限，研究結(jié)論還需要得到更多的實(shí)踐檢驗(yàn)。本研究結(jié)果為米酒酒藥的分類以及米酒生產(chǎn)的質(zhì)量控制提供了一定的參考。