戴悅，吳丹，鄭璞，陳鵬程

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

交替糖蔗糖酶(alternansucrase，ASR,EC 2.4.1.140)是GH70家族的4大經(jīng)典葡聚糖蔗糖酶之一，它可以進(jìn)行葡萄糖基轉(zhuǎn)移，催化形成具有α-1,3糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵交替連接的葡聚糖，即交替糖[1]。交替糖只能被異麥芽糖糊精酶和互變酶切割[2]，而對其他微生物和哺乳動物的水解酶具有抗降解性，應(yīng)用范圍主要涉及納米科技、醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域[3-4]，尤其作為一種具有良好益生功能的新資源食品極具市場開發(fā)潛力[5]。

雖然以ASR制備交替糖的研究熱度一直不減，但如今交替糖仍然沒有進(jìn)入市場得到大規(guī)模的應(yīng)用。此前所報(bào)道的野生型菌株生產(chǎn)ASR的最高酶活力為1.5 U/mL[6]，表達(dá)水平較低。此外，野生型菌株還存在被其他酶和共合成的聚合物污染、提取純化過程復(fù)雜等問題，所以生產(chǎn)過程很不經(jīng)濟(jì)，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要[7]。VAN LEEUWEN等[8]在EscherichiacoliTOP10中成功表達(dá)ASR，但酶活力幾乎沒有提高。在大腸桿菌中表達(dá)的重組菌雖然避免了野生型菌株提取和純化的復(fù)雜步驟，但不僅需要進(jìn)行細(xì)胞破碎，且極易形成包涵體[9]，同時由于含有內(nèi)毒素導(dǎo)致其表達(dá)的酶無法用于食品行業(yè)。朱潔[10]嘗試了在枯草芽孢桿菌中表達(dá)ASR，3 L罐發(fā)酵酶活力水平依然較低，僅為3.9 U/mL，所以依靠枯草芽孢桿菌異源表達(dá)大規(guī)模生產(chǎn)ASR也難以實(shí)現(xiàn)。

畢赤酵母(Pichiapastoris)作為表達(dá)宿主有眾多優(yōu)勢[11]，可以克服其他宿主的缺點(diǎn)。本研究選擇P.pastoris作為ASR的異源表達(dá)的宿主，將來源于LeuconostocmesenteroidesNRRL B-1355的ASR基因在P.pastoris中實(shí)現(xiàn)高水平分泌表達(dá)，并進(jìn)行了重組酶的酶學(xué)性質(zhì)的研究。另外，本文將該酶應(yīng)用于催化合成交替糖，研究了該酶催化不同受體反應(yīng)對產(chǎn)物組成的影響，以期為ASR工業(yè)化生產(chǎn)以及交替糖大規(guī)模的市場應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

菌株E.coliJM109、P.pastorisX33，以及載體pPIC9K均由本實(shí)驗(yàn)保存。E.coliJM109用于ASR基因的克隆和測序?qū)嶒?yàn)。P.pastorisGS115用作異源表達(dá)宿主，pPIC9K作為重組ASR的表達(dá)載體。ASR基因來源于LeuconostocmesenteroidesNRRL B-1355(GenBank編號為AJ250173.2)。交替糖蔗糖酶基因、實(shí)驗(yàn)所用引物均由天霖生物科技有限公司合成。

1.1.2 主要試劑

抗生素zeocin，北京索萊寶科技有限公司；PrimeSTAR?Max DNA Polymerase，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；蛋白質(zhì)Marker，賽默飛世爾科技；T4 DNA連接酶、一步克隆試劑盒、核酸分子量Marker，諾維贊有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB、YPD、MD、BMGY與BMMY配方參照Invitro-gen公司的《畢赤酵母表達(dá)操作手冊》。

PTM1(g/L):CuSO4·5H2O 6，MnSO4·H2O 3，F(xiàn)eSO4·7 H2O 65，NaI 0.08，Na2MoO4·2H2O 0.2，CoCl20.5，H3BO30.02，生物素0.2，濃H2SO45 mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 表達(dá)載體pPIC9K-asr的構(gòu)建

根據(jù)GenBank上發(fā)表的ASR基因序列，按照P.pastoris密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，由天霖生物技術(shù)公司合成。以pUC57-ASR為模板，用引物F1、R1擴(kuò)增ASR基因片段；以pPIC9K質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物F2、R2擴(kuò)增P.pastoris表達(dá)載體片段。通過膠回收驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，并使用膠回收試劑盒分別回收ASR基因片段和pPIC9K載體片段。通過一步克隆試劑盒將回收的片段和載體按照2∶1的物質(zhì)的量比，在37 ℃下反應(yīng)30 min連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布卡那霉素抗性平板。使用引物F1和F2進(jìn)行菌落PCR，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，擴(kuò)增提取質(zhì)粒，測序正確后用于轉(zhuǎn)化P.pastoris。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2 重組ASR在P.pastoris中的表達(dá)與搖瓶篩選

本研究采用P.pastorisGS115作為表達(dá)宿主。P.pastorisGS115感受態(tài)細(xì)胞根據(jù)Invitrogen標(biāo)準(zhǔn)操作流程制備。使用Sac I線性化pPIC9K-asr質(zhì)粒，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化回收線性化片段。吸取1 μg線性化片段加入感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min后轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中，在1 500 V下點(diǎn)擊5 ms，迅速加入1 mL 1 mol/L的冰預(yù)冷山梨醇，30 ℃孵育2 h后涂布MD平板。在MD平板培養(yǎng)2～3 d后，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行G418抗性篩選，G418質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、4 mg/mL。將正確的轉(zhuǎn)化子接種至BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)24 h，然后4 ℃，5 000 r/min離心10 min去除上清液得到菌體。用30 mL BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)72 h，每12 h添加終體積分?jǐn)?shù)為1%的甲醇。誘導(dǎo)結(jié)束后，4 ℃，7 000 r/min離心5 min收集粗酶液，選擇酶活力最高的菌株用于3 L罐高密度發(fā)酵。

1.2.3 重組P.pastoris3 L罐高密度發(fā)酵

將搖瓶篩選出的菌株在YPD平板上30 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種至100 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600=10～12后，接種至900 mL BSM培養(yǎng)基中。設(shè)定初始發(fā)酵溫度為30 ℃，pH 5.5，溶氧關(guān)聯(lián)攪拌控制為20%。出現(xiàn)溶氧反彈之后開始流加500 g/L甘油(含有12% PTM1)，當(dāng)OD600達(dá)到100，停止流加甘油并饑餓培養(yǎng)1 h。誘導(dǎo)階段，將溫度調(diào)整至25 ℃，用甲醇控制儀流加開始流加甲醇(含有12% PTM1)，控制溶氧20%～30%誘導(dǎo)產(chǎn)酶。每隔一段時間取樣測定OD600、酶活力，直至OD600和酶活力不再顯著增加，終止發(fā)酵。

1.2.4 酶活力的測定

用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)法進(jìn)行ASR的酶活力測定[12]。以1 mL 200 g/L蔗糖溶液為底物，加入0.9 mL酸緩沖液(50 mmol/L，pH 5.5)，在40 ℃水浴鍋中保溫10 min，加入0.1 mL的酶液，40 ℃、pH 5.5反應(yīng)30 min。吸取0.5 mL反應(yīng)液，加入1 mL DNS溶液，沸水浴7 min，冰水冷卻，加水定容至5 mL，在540 nm下測定吸光值。根據(jù)吸光值計(jì)算出果糖濃度。ASR酶活力定義：每分鐘產(chǎn)生1 μmol果糖所需的酶量為1 U的酶活力。

1.2.5 ASR的酶學(xué)性質(zhì)

將高密度發(fā)酵所得酶液經(jīng)過陰離子交換柱純化后，考察溫度和pH對ASR的影響。

最適pH和pH穩(wěn)定性：在40 ℃條件下，50 mmol/L，pH為3.0～9.0緩沖液內(nèi)，間隔0.5個pH測定酶活力，按酶活力最高的為100%，計(jì)算其他pH下的相對酶活力以確定最適pH；將酶置于50 mmol/L，pH為3.0～9.0緩沖液內(nèi)，于4 ℃冰箱放置7 d，測定殘留酶活力以確定pH穩(wěn)定性。

最適溫度和溫度穩(wěn)定性：采用50 mmol/L，pH 5.5的醋酸緩沖液，在30～60 ℃間隔5 ℃測定酶活力，按酶活力最高的為100%，計(jì)算各溫度下的相對酶活力以確定最適溫度；采用50 mmol/L，pH 5.5的醋酸緩沖液，將酶液分別放置在30、35、40、45、50 ℃保溫，每隔一段時間取樣測定殘留酶活力以確定溫度穩(wěn)定性。

以5、10、20、40、80 g/L的蔗糖為底物，在40 ℃，50 mmol/L，pH 5.5的醋酸鈉緩沖液下測定反應(yīng)過程中果糖的生成量。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，以1/V對1/S作圖，繪制ASR作用于不同濃度底物的動力學(xué)曲線。

1.2.6 交替糖的制備

用pH 5.5的50 mmol/L醋酸緩沖液配制總質(zhì)量濃度為300 g/L的蔗糖和麥芽糖(或其他小分子糖)溶液，使其物質(zhì)的量比為2∶1，總反應(yīng)體系為10 mL，加入0.6 U/mL ASR酶液，置于40 ℃，150 r/min的水浴搖床中反應(yīng)48 h后，將反應(yīng)液沸水煮10 min終止反應(yīng)用于后續(xù)分析。或者以300 g/L蔗糖為唯一底物，其他條件同上。

1.2.7 薄層色譜(thin-layer chromatography，TLC)分析

采用TLC來確定最終催化反應(yīng)體系中生成的單糖和寡糖。以1 mg/mL果糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六塘、麥芽七糖作為marker，點(diǎn)樣量10 μL。將獲得的反應(yīng)液離心，稀釋10倍，在薄層層析硅膠板上點(diǎn)樣1 μL，展開劑為V(正丁醇)∶V(乙醇)∶V(水)=5∶5∶3[13]。在室溫下將50 mL展開劑在200 mm×100 mm的展開缸中預(yù)飽和60 min，放入樣品展開4 h。用12%硫酸甲醇溶液在110 ℃烘箱中顯色30 min，根據(jù)TLC顏色變化來定性分析產(chǎn)物的組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組ASR的異源表達(dá)

通過PCR擴(kuò)增的pPIC9K載體以及ASR基因，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大小分別為7 443和6 150 bp(圖1-a)，使用無縫克隆試劑盒將片段連接后轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布卡那霉素抗性平板。將轉(zhuǎn)化子菌落PCR得到6 150 bp單一條帶(圖1-b)，則為陽性轉(zhuǎn)化子，測序正確，重組質(zhì)粒pPIC9K-asr構(gòu)建成功。

a-PCR擴(kuò)增電泳圖；b-轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果 M-DNA marker；a1-載體pPIC9K的PCR產(chǎn)物； a2-目的基因asr的PCR產(chǎn)物； b1～10-陽性轉(zhuǎn)化子中asr的PCR產(chǎn)物；b11-對照(pPIC9K)圖1 PCR擴(kuò)增和轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification and identification of transformant

使用SacI線性化pPIC9K-asr質(zhì)粒，經(jīng)過PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收后，取1 μg電轉(zhuǎn)化P.pastorisGS115感受態(tài)細(xì)胞，涂布MD平板生長后，進(jìn)行抗生素篩選。挑取正確轉(zhuǎn)化子搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收集上清液粗酶液，測定酶活力(表2)。選定搖瓶酶活力最高的2號菌株，作為3 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵的菌株。

表2 重組ASR搖瓶水平酶活力Table 2 Recombinant ASR expression activities in shake flask level

2.2 ASR的3 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵

挑取2號菌株的單菌落接種至100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600達(dá)到10～12。按體積分?jǐn)?shù)為10%接種量接種至裝有BSM培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐中，分批培養(yǎng)一定時間后，當(dāng)觀察到溶氧突然上升，即表示發(fā)酵罐內(nèi)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中所含的碳源已被菌體耗盡，不能滿足菌體的生長代謝，補(bǔ)加甘油作為碳源來供給菌體正常的生長代謝直至OD600達(dá)到100，停止流加甘油。等到溶氧再次反彈后，饑餓培養(yǎng)1 h，開始流加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。將發(fā)酵過程中所取的樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2所示，GS115/pPIC9K-asr約在200 kDa處有一條明顯的條帶，與理論蛋白分子質(zhì)量一致，隨著誘導(dǎo)時間的延長，GS115/pPIC9K-asr目的蛋白條帶逐步加深。發(fā)酵過程中，OD600在達(dá)到530后(圖2-b)，不再增加，整個誘導(dǎo)過程持續(xù)了72 h。ASR的酶活力隨著誘導(dǎo)時間的延長逐步增大，最終達(dá)到34.5 U/mL，約是搖瓶水平的12倍。

a-不同時間發(fā)酵液上清液SDS-PAGE圖; b-發(fā)酵過程中酶活力和細(xì)胞OD600曲線圖圖2 3 L發(fā)酵罐重組菌發(fā)酵過程圖Fig.2 Fermentation of recombinant P.pastoris in 3 L fermenter

2.3 ASR酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.3.1 pH對ASR活性的影響

為了探究重組ASR的最適pH，將酶的反應(yīng)溫度控制為40 ℃，50 mmol/L不同pH緩沖液范圍內(nèi)探究重組ASR的酶活性。如圖3-a所示，隨著pH的增加，ASR的酶活力先增加后減少，當(dāng)pH值為6.0時酶活力最大，即重組ASR的最適pH為6.0。

將酶置于50 mmol/L不同pH緩沖液范圍內(nèi)于4 ℃放置7 d，探究重組ASR的pH穩(wěn)定性。pH為4.0～9.0時，重組ASR的相對酶活力均在90%以上(圖3-b)，表明重組ASR具有廣泛的pH穩(wěn)定性。

a-最適pH；b-pH穩(wěn)定性圖3 pH對重組ASR活性和穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of pH on the activity and stability of recombinant ASR

2.3.2 溫度對ASR活性的影響

為了探究重組ASR的最適溫度，在30～60 ℃下分別考察ASR活性(圖4-a)。在30～55 ℃，ASR均保持50%以上的相對酶活力。當(dāng)溫度>55 ℃時，重組ASR的酶活力急劇下降，其相對酶活力降至25%以下。ASR酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在50 ℃時具有最大值，為最適溫度。

酶的熱穩(wěn)定性也是酶的一種重要的性質(zhì)，是實(shí)際生產(chǎn)過程中選擇酶反應(yīng)溫度的重要指標(biāo)之一，在30～60 ℃下考察酶的熱穩(wěn)定性，間隔0.5 h取樣測定重組ASR的殘余酶活力(圖4-b)。ASR在不高于40 ℃時具有較好的熱穩(wěn)定性，在30、35 ℃下保溫24 h仍可維持75%以上的活性；在40 ℃下，ASR的酶活力下降比較緩慢，孵育10 h仍然可以維持50%以上的活力；當(dāng)溫度>40 ℃時，ASR熱穩(wěn)定性較差，在50、60 ℃下酶活力幾乎在前1 h就完全喪失。

a-最適溫度；b-溫度穩(wěn)定性圖4 溫度對重組ASR活性和穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity and stability of recombinant ASR

2.3.3 ASR動力學(xué)參數(shù)測定

以不同濃度的蔗糖為底物，在40 ℃，pH 5.5下測定反應(yīng)過程中果糖的生成量，即為底物蔗糖的消耗量，以1/V對1/S作圖，繪制ASR的動力學(xué)曲線(圖5)。在該動力學(xué)曲線中，橫軸的截距即為1/Km,縱軸的截距即為Vmax。根據(jù)回歸方程求得，ASR動力學(xué)參數(shù)Km、Vmax、kcat分別是31.97 mmol/L，0.22 mmol/(min·L)，0.36 s-1。

S-蔗糖的量;V-果糖生成速度圖5 ASR對蔗糖的雙倒數(shù)曲線Fig.5 Lineweaver-Burk plot of ASR using sucrose as substrates

2.4 交替糖的制備及分析

2.4.1 以蔗糖為唯一底物制備交替糖

本研究中采用pH 5.5的50 mmol/L醋酸緩沖液配制總質(zhì)量濃度為300 g/L的蔗糖加入0.6 U/mL的ASR酶液催化48 h后，稀釋10倍后進(jìn)行TLC分析，由TLC結(jié)果(圖6)可知，當(dāng)以蔗糖為唯一底物反應(yīng)時，只有多糖和少量三糖產(chǎn)生，沒有產(chǎn)生更高聚合度的寡糖。

M-標(biāo)準(zhǔn)品marker；G1-葡萄糖；G2-蔗糖；G3～G7麥芽三糖～ 麥芽七糖；S-蔗糖；g-葡萄糖；F-果糖；m-麥芽糖；L-乳糖； T-半乳糖；0-反應(yīng)0 h樣品；1-反應(yīng)48 h樣品； 紅色方框表示聚合度超過5的交替寡糖圖6 不同小分子糖受體的催化產(chǎn)物TLC圖Fig.6 Products of ASR reaction with different saccharide receptors

2.4.2 以蔗糖為受體，其他小分子糖為供體制備交替糖

選擇了容易獲取且價格較為低廉的葡萄糖、乳糖、海藻糖、麥芽糖作為制備交替糖的受體?？刂普崽呛推渌》肿犹堑奈镔|(zhì)的量比為3∶1，用pH 5.5的50 mmol/L醋酸緩沖液配制總質(zhì)量濃度為300 g/L的總底物量，加入0.6 U/mL的酶催化48 h后，稀釋10倍后進(jìn)行TLC分析(圖6)。當(dāng)蔗糖為供體，受體是海藻糖時，沒有觀察到任何寡糖的產(chǎn)生，產(chǎn)物中只有多糖；乳糖、果糖為受體時，產(chǎn)物是三糖和多糖；葡萄糖、麥芽糖為受體時，產(chǎn)物是多糖和多種寡糖的混合物，并且由葡萄糖生成的產(chǎn)物聚合度比麥芽糖的低、顏色比麥芽糖的淺。進(jìn)一步考察了麥芽糖為受體時的催化反應(yīng)過程，通過每隔8 h取樣，使用TLC分析詳細(xì)記錄反應(yīng)過程中底物的消耗、產(chǎn)物的生成情況，如圖7所示，隨著時間的延長，產(chǎn)物中有聚合度為3～7甚至更高的寡糖產(chǎn)生。

M-標(biāo)準(zhǔn)品marker；G1-葡萄糖；G2-蔗糖； G3～G7-麥芽三糖～麥芽七糖圖7 麥芽糖為受體的催化產(chǎn)物TLC圖Fig.7 Products of ASR reaction with maltose receptors

3 結(jié)論與討論

本研究將來源于ASR的基因首次在P.pastoris中成功實(shí)現(xiàn)高水平分泌表達(dá)，酶活力達(dá)到34.5 U/mL。這是ASR首次在真核宿主中異源表達(dá)，同時也是目前所報(bào)道的ASR最高酶活力水平，解決了ASR酶活力較低的問題，有助于對ASR開展進(jìn)一步深入的研究。重組ASR廣泛的pH穩(wěn)定性和較好的溫度穩(wěn)定性表明了其具有應(yīng)用于工業(yè)食品生產(chǎn)的巨大潛力。在以不同底物生產(chǎn)交替糖時，以蔗糖為唯一底物幾乎可以專一性生產(chǎn)交替糖多糖，這一特性可應(yīng)用于交替糖多糖的生產(chǎn)。當(dāng)蔗糖為供體，其他小分子糖為受體時，只有麥芽糖可以生產(chǎn)較高聚合度的寡糖產(chǎn)物，其他小分子糖只能生成多糖和聚合度較低寡糖的混合物。研究結(jié)果一方面擴(kuò)大了交替糖多糖生產(chǎn)的底物范圍，另一方面說明麥芽糖是生產(chǎn)交替糖寡糖的良好受體。由此可見，本研究重組表達(dá)的ASR具有良好的生產(chǎn)交替糖功能，為后續(xù)規(guī)?；苽浣惶嫣翘峁┲匾夹g(shù)支撐。