劉松,韓徐悅

1(江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 未來食品科學中心，江蘇 無錫，214122)

漆酶(EC 1.10.3.2)是一種多銅氧化酶，可氧化包括酚類、非酚類物質和一些無機化合物等在內的多種底物[1]。因其催化反應過程的唯一副產(chǎn)物是水，被認為是一種環(huán)保型綠色催化劑[2]，在食品[3]、紡織[4]、環(huán)境修復[5]和造紙[6]等方面有重要應用。漆酶來源廣泛，在細菌[7]、真菌[8]、植物[9]和動物[10]中均有發(fā)現(xiàn)，但是，野生型漆酶的總體產(chǎn)酶水平較低，不利于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

隨著基因工程和酶工程的迅速發(fā)展，大腸桿菌(Escherichiacoli)因其發(fā)酵周期短、操作簡單、產(chǎn)量高等優(yōu)勢，已成為重組蛋白生產(chǎn)的常用宿主[11]。雖然包括Klebsiellapneumoniae[12]、Proteushauseri[13]和Streptomycescyaneus[14]等多種細菌漆酶均成功表達于E.coli中，但是表達形式主要還是胞內酶。針對胞內酶，可通過添加溶菌酶或者超聲波破碎法回收，但前者增加了處理成本，而后者會因操作過程中不可控的機械作用或者破碎后產(chǎn)生的細胞碎片大小不一而影響蛋白回收效果，均存在弊端。有研究通過共表達磷脂酶C[15]或者α-溶血素分泌系統(tǒng)和YebF分泌系統(tǒng)[16]能將漆酶從胞內分泌至胞外，前者胞外酶活力可達到1 257.22 U/L而后者可達2 401.3 U/L。上述研究雖實現(xiàn)了胞外表達，但是產(chǎn)量不高。

在細菌中，核糖體結合位點(ribosome binding site，RBS)和其他調節(jié)性RNA序列是翻譯起始和蛋白質表達的有效控制元件[17]，適當調整RBS序列可以大大提高蛋白質的表達水平[18]。有研究通過RBS策略組合優(yōu)化了四氫嘧啶合成的3個途徑酶，將四氫嘧啶的產(chǎn)量提升至521.24 mg/L[19]。源自噬菌體phi X174的裂解蛋白E可以幫助細胞裂解，原理是通過在革蘭氏陰性菌細胞膜上形成一個跨膜孔道結構，細胞胞質內容物會在滲透壓的作用下從該孔道排出[20]。此時，細菌會變成不含核酸、核糖體及其他內容物的空殼，能有效實現(xiàn)胞內酶的胞外生產(chǎn)。

本研究將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)來源的漆酶CotA表達于E.coliBL21(DE3)，通過核糖體結合位點、誘導表達條件及共表達裂解蛋白，顯著提高了CotA的分泌表達水平。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

菌株E.coliJM109，E.coliBL21(DE3)和質粒pCDF Duet-E保存于本研究室。委托蘇州金唯智公司按照E.coli密碼子偏好性將漆酶CotA(Accession WP_003243170.1)合成于載體pET24a中，宿主為E.coliJM109。

1.1.2 試劑

柱回收試劑盒，Thermo fisher公司；大腸桿菌感受態(tài)制備試劑盒、Prime STAR Max DNA聚合酶，大連TaKaRa公司；卡那霉素、質粒提取試劑盒、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、ABTS，上海生工生物工程(上海)股份有限公司；一步克隆試劑盒，南京諾唯贊公司；酵母粉、胰蛋白胨，英國OXOID公司；蛋白marker，上海翊圣生物公司；蛋白電泳Loading buffer、Bis-Tris 預制凝膠，Invitrogen 公司。其他常規(guī)試劑及藥品為國產(chǎn)或進口分裝。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，瓊脂粉20，自然pH。

LB液體種子培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，自然pH。

TB液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨12，酵母粉24，丙三醇5，KH2PO42.31，K2HPO412.54，自然pH。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)漆酶重組菌株的構建與表達

委托蘇州金唯智公司按照E.coli密碼子偏好性合成CotA(Accession WP_003243170.1)，所用載體為pET24a，宿主為E.coliJM109。將菌株E.coliJM109/pET24a-CotA接種至含有卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中37 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)12 h后，按照質粒提取試劑盒說明書提取質粒pET24a-CotA，將漆酶表達質粒pET24a-CotA轉化入感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)，得到重組菌株CotA-RBS。將CotA-RBS接種于含有卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，按照2%(體積分數(shù)，下同)接種量接種于TB培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)至OD600約為0.8時，加入1 mmol/L Cu2+和0.1 mmol/L IPTG，20 ℃，220 r/min條件下繼續(xù)發(fā)酵至28 h。定時取樣測定酶活力和OD600，將最高酶活力對應的樣品處理后進行SDS-PAGE驗證。

1.2.2 重組RBS菌株的構建與表達

基于在線軟件RBS Calculator和RBS Library Calculator(https://www.denovodna.com/software/)預測具有不同翻譯起始效率的RBS序列(表1)。以pET24a-CotA為模板，采用一步克隆法將質粒pET24a-CotA上原始RBS序列替換成所選RBS序列，按照表2所示引物進行PCR，擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)34次；最后72 ℃延伸10 min。得到擴增片段后回收純化，步驟參考柱回收說明書。將經(jīng)過純化的片段轉化進感受態(tài)細胞E.coliJM109中，挑取3～5個轉化子送公司進行驗證。將驗證正確的菌株重新活化培養(yǎng)12 h后，參考質粒提取說明書提取質粒，得到重組質粒pET24a-CotA-RBS1、pET24a-CotA-RBS2、pET24a-CotA-RBS3、pET24a-CotA-RBS4和pET24a-CotA-RBS5。

表1 本研究所選RBS序列Table 1 The sequence of selected RBS in this study

表2 本研究所用引物Table 2 The primers used in this study

將各重組質粒轉化進感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)中，構成重組RBS替換菌株CotA-RBS1、CotA-RBS2、CotA-RBS3、CotA-RBS4和CotA-RBS5。將重組菌株CotA-RBS和各重組RBS替換菌株劃線至含有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中活化，按照2%接種量轉接至TB發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)至OD600約為0.8時，依次加入終濃度為1 mmol/L Cu2+和0.1 mmol/L IPTG誘導表達，在20 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)20 h后取樣測定胞內酶活力，確定最優(yōu)RBS替換菌株。

1.2.3 正交實驗優(yōu)化誘導條件

為了進一步提高重組漆酶的表達水平，以誘導OD600、發(fā)酵溫度、IPTG誘導濃度和Cu2+添加濃度為因素，設計如表3所示正交實驗表。在正交實驗條件下發(fā)酵CotA-RBS5并比較不同條件對酶表達水平的影響。通過計算各條件下的k值和極差R，確定影響CotA表達的關鍵因素及最佳誘導條件。

表3 正交實驗因素與水平Table 3 Factors and levels of orthogonal experimental test

1.2.4 共同表達裂解蛋白E釋放胞內酶

為促進漆酶的胞外生產(chǎn)，將裂解蛋白表達質粒pCDF Duet-E與pET24a-CotA-RBS5共同轉化入感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)中，得到重組共表達菌株CotA-RBS5-E。利用最優(yōu)誘導條件進行發(fā)酵培養(yǎng)。分別發(fā)酵至不同OD600時加入終濃度為2 mmol/L的阿拉伯糖誘導表達裂解蛋白E，定時取樣測定胞外酶活力和OD600。

1.2.5 漆酶活性測定

漆酶活性測定采用ABTS法：總體系為3 mL，將100 mmol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.5)和底物1 mmol/L ABTS放入30 ℃水浴鍋中預熱5 min后向石英比色皿中依次加入2.4 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.5)、0.1 mL經(jīng)適當稀釋的酶液及0.5 mL底物ABTS。每分鐘氧化1 μmol底物ABTS所需要的酶含量為一個漆酶活力單位(U)。酶活力按公式(1)計算：

(1)

式中：ΔOD/Δt,每分鐘吸光值的變化；ε,顯色物的摩爾消光系數(shù)L/(mmol·cm)。底物ABTS在420 nm處的摩爾消光系數(shù)為ε=36 L/(mmol·cm)。

1.2.6 SDS-PAGE電泳分析

發(fā)酵液12 000 r/min離心10 min后的上清液即為胞外可溶部分，菌體部分用檸檬酸-Na2HPO4緩沖液(pH 6.0)重懸進行超聲波破壁，超聲波細胞破碎儀工作條件為：超聲波2 s, 暫停4 s，總時長5 min。將破碎后的樣品低溫高速離心20 min，上清液即為重組菌株胞內可溶部分，菌體沉淀為胞內不溶部分，沉淀用檸檬酸-Na2HPO4緩沖液(pH 6.0)重懸，將所有樣品進行SDS-PAGE蛋白電泳驗證。蛋白樣品上樣量為30 μL，V(蛋白樣品上樣量)∶V(4×SDS蛋白上樣緩沖液)=3∶1混合、95 ℃煮沸15 min，進行SDS-PAGE凝膠電泳，設置恒壓120 V。

2 結果與討論

2.1 產(chǎn)漆酶重組菌株的構建與表達

基于E.coli密碼子偏好性合成漆酶CotA(Accession WP_003243170.1)基因，并克隆至pET24a的RBS序列之后，得到表達質粒pET24a-CotA(圖1)。

圖1 漆酶表達質粒pET24a-CotAFig.1 The plasmid pET24a-CotA expressed for laccase

將表達質粒轉入感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)中得到產(chǎn)漆酶重組菌株CotA-RBS。為探究漆酶CotA的表達情況，設定基本誘導條件為：誘導起始OD6000.8，誘導劑IPTG終濃度0.1 mmol/L，Cu2+添加終濃度1 mmol/L，20 ℃、220 r/min條件下發(fā)酵28 h，測定其發(fā)酵過程曲線。如圖2-a所示，隨著細胞密度的增加，胞內酶活力不斷升高；發(fā)酵20 h，酶活力達到最大(449 U/L)。SDS-PAGE分析顯示，胞內可溶和不溶部分均有CotA條帶(理論量58.5 kDa)，且胞內不溶部分條帶明顯粗于可溶部分(圖2-b)。上述結果表明，CotA在E.coli成功表達，但大部分以包涵體形式存在。大量的研究表明，翻譯速率過快導致酶分子錯誤折疊是包涵體形成的首要原因。本研究采用了T7強啟動子及其RBS，可能使CotA的轉錄和翻譯均處于較高水平。此外，Cu2+有助于漆酶的折疊與組裝[21]。重組菌采用的發(fā)酵培養(yǎng)基中的Cu2+濃度并不高(1 mmol/L)。因此，進一步優(yōu)化RBS序列及誘導表達條件將有助于CotA的活性表達。

a-發(fā)酵過程曲線;b-SDS-PAGE驗證圖2 重組菌株CotA-RBS的表達情況分析Fig.2 Expression analysis of the recombinant strain CotA-RBS

2.2 重組RBS替換菌株的構建與表達

蛋白質翻譯過程的速率主要由翻譯起始速率和翻譯延伸速率決定，其中起始速率主要受mRNA上的RBS序列、起始密碼子及翻譯起始區(qū)二級結構影響[22]。為了進一步提高漆酶的表達水平，對RBS序列進行優(yōu)化，探究不同翻譯起始速率對表達水平的影響。在T7啟動子和CotA序列條件下，在線軟件RBS Calculator推薦的RBS序列(RBS1)的翻譯起始速率是原始RBS序列(RBS0)的87.2倍(表1)。在上述同樣的鄰近序列條件下，RBS Library Calculator共推薦具有不同翻譯起始速率的364個RBS序列。為提高所選RBS序列的代表性，基于翻譯起始速率將上述RBS序列分為4組(160 000～100 000、100 000～50 000、50 000～10 000、10 000～0)，依次選取RBS2、RBS3、RBS4和RBS5進行表達驗證(表1)。構成重組RBS替換菌株后測定胞內漆酶的表達水平。如圖3所示，重組菌株胞內CotA-RBS5較出發(fā)菌株的449 U/L提高了1.75倍，達到1 236 U/L，而其他翻譯起始速率高于出發(fā)菌株的重組菌株的胞內酶活力均有不同程度的降低。上述結果表明，較低的翻譯起始速率有利于漆酶的高效表達。研究發(fā)現(xiàn)，在細菌表達系統(tǒng)中，過高的翻譯起始速率可能降低核糖體與mRNA翻譯起始區(qū)域結合的穩(wěn)定性[23]。此外，高的翻譯起始速率還會導致后續(xù)翻譯過程中核糖體之間發(fā)生碰撞的概率提高，引起核糖體脫落及表達效率下降[23]。因此，在后續(xù)工作中將進一步分析比RBS5翻譯起始速率更低或者接近的RBS對漆酶表達水平的影響。

RBS0-出發(fā)菌株CotA-RBS胞內酶；RBS1-CotA-RBS1胞內酶； RBS2-CotA-RBS2胞內酶；RBS3-CotA-RBS3胞內酶； RBS4-CotA-RBS4胞內酶；RBS5-CotA-RBS5胞內酶圖3 重組RBS替換菌株胞內可溶部分酶活力Fig.3 The intracellular soluble enzyme activity of recombinant strains with RBS substitutions

2.3 正交實驗優(yōu)化誘導條件提高漆酶表達水平

誘導條件優(yōu)化是有效提高蛋白表達的策略之一。選擇合適的起始誘導OD600、發(fā)酵溫度和IPTG添加濃度可以幫助減少包涵體的生成，Cu2+作為輔助因子可以幫助激發(fā)漆酶活性[24]。為進一步提高重組菌株胞內酶的表達水平，對24 h時各組胞內酶活力的數(shù)據(jù)進行處理，分別計算各因素下的k值和極差R，確定最佳誘導條件。如表4所示，Cu2+濃度、誘導OD600、發(fā)酵溫度和IPTG濃度對CotA表達的影響依次降低，Cu2+添加濃度的極差R遠遠高于其他影響因素的極差。所有添加2 mmol/L Cu2+濃度的實驗組胞內酶活力均高于其他相同IPTG添加濃度、發(fā)酵溫度或者起始誘導OD600的實驗組，說明Cu2+添加濃度對CotA胞內表達水平的影響最大。證實了Cu2+是漆酶催化中心的重要組成部分，Cu2+的存在有助于漆酶的折疊與組裝[21]，其作為輔助因子可激發(fā)漆酶的活性[24]。

表4 正交實驗優(yōu)化結果Table 4 Results of the orthogonal experimental test

由圖4可知，最佳的誘導條件組合為誘導起始OD600為0.8，IPTG誘導濃度為0.1 mmol/L，Cu2+添加濃度為2 mmol/L，發(fā)酵溫度為30 ℃。在此條件下，胞內酶活力可達到7 926 U/L，較未優(yōu)化前(1 236 U/L)提高了5.4倍。

圖4 重組菌株CotA-RBS5正交實驗胞內酶活力Fig.4 The intracellular activity of the orthogonal experimental test of recombinant strain CotA-RBS5

為探究誘導條件和RBS對細胞生長及漆酶胞外生產(chǎn)的影響?；诖?，我們對比了重組菌株CotA-RBS和CotA-RBS5誘導條件優(yōu)化前后的細胞生長和胞外酶活力情況。由圖5可知，替換最優(yōu)RBS和優(yōu)化誘導條件均會影響細胞生長。誘導條件優(yōu)化前，CotA-RBS和CotA-RBS5僅在發(fā)酵32 h后產(chǎn)生胞外漆酶(圖5-a和圖5-c)。誘導條件優(yōu)化后，CotA-RBS和CotA-RBS5胞外酶活力分別提前至發(fā)酵24 h和10 h。其中，重組菌株CotA-RBS5發(fā)酵24 h胞外漆酶活力達到最大值(4 984 U/L)，比CotA-RBS高117.6倍(圖5-b和圖5-d)。值得注意的是，CotA并沒有融合分泌信號，且相同誘導條件下CotA-RBS5的菌體生長明顯低于CotA-RBS。因此，在優(yōu)化后的誘導條件下CotA-RBS5細胞可能發(fā)生了裂解，使胞內的CotA釋放至胞外。大量的研究表明，外源基因的過量表達對細胞生長造成脅迫甚至裂解[25]。如圖3和圖4所示，RBS及誘導條件優(yōu)化均提高了胞內的CotA表達水平。因此，較高的CotA胞內表達水平導致了CotA-RBS5細胞的裂解。

a-重組菌株CotA-RBS發(fā)酵條件優(yōu)化前；b-重組菌株CotA-RBS發(fā)酵條件優(yōu)化后； c-重組菌株CotA-RBS5發(fā)酵條件優(yōu)化前；d-重組菌株CotA-RBS5發(fā)酵條件優(yōu)化后圖5 重組菌株CotA-RBS和CotA-RBS5胞外酶活力和OD600Fig.5 The extracellular activity and OD600 of recombinant strains CotA-RBS and CotA-RBS5

2.4 共表達裂解蛋白E促進漆酶的胞外生產(chǎn)

為簡化下游分離提取過程，更好地實現(xiàn)漆酶的胞外生產(chǎn)，探索含有噬菌體裂解蛋白E的重組菌CotA-RBS5-E的誘導表達條件，考察細胞裂解對漆酶胞外生產(chǎn)的影響。向感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)中共同轉化裂解蛋白E表達質粒pCDF Duet-E(圖6)和RBS優(yōu)化后的漆酶表達質粒pET24a-CotA-RBS5，構成重組菌株CotA-RBS5-E。

在優(yōu)化后的誘導條件下，分別培養(yǎng)至OD600=3.0、3.5和4時(分別對應圖7-b～圖7-d)時加入終濃度為2 mmol/L的阿拉伯糖，在30 ℃、220 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)，定時取樣測定OD600、胞外可溶部分酶活力。漆酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，加入阿拉伯糖開始誘導裂解蛋白E后，胞外很快能檢測到漆酶活性。隨著發(fā)酵時間的延長，除較早開始誘導(OD600=3時誘導)的重組菌株的OD600先上升后下降外(圖7-b)，其他實驗組的OD600均很快下降并最終維持穩(wěn)定；胞外漆酶活性由急至緩上升，幅度明顯，說明細胞發(fā)生裂解，裂解蛋白E成功發(fā)揮作用。當OD600=3.5時開始誘導裂解蛋白，重組菌CotA-RBS5-E發(fā)酵至30 h時，胞外酶活力達到最高(10 283 U/L)，是對照組(5 695 U/L)的1.8倍。由此可知，共表達裂解蛋白E可以使細胞裂解作用加強，促進漆酶的胞外生產(chǎn)。

圖6 裂解蛋白表達質粒pCDF-Duet-EFig.6 The plasmid pCDF-Duet-E expressed for lysis protein

a-對照組；b-OD600=3；c-OD600=3.5；d-OD600=4圖7 不同OD600時誘導裂解蛋白后胞外CotA活性及OD600分析Fig.7 The analysis of extracellular activity and OD600 after inducing lysis protein at different OD600

為進一步探究RBS優(yōu)化、誘導條件優(yōu)化和裂解蛋白E對胞內酶的表達和裂解效率的影響，測定發(fā)酵至20 h時各個樣品中胞內外漆酶的分布情況。如圖8所示，誘導條件優(yōu)化前后出發(fā)菌株CotA-RBS均僅在胞內產(chǎn)酶且優(yōu)化效果不明顯，替換最優(yōu)RBS后若不經(jīng)誘導條件優(yōu)化，重組菌株CotA-RBS5僅在胞內產(chǎn)酶。經(jīng)誘導條件優(yōu)化后，胞外可檢測到漆酶活性，占總酶活力比例約為27%，說明需要在最優(yōu)RBS和誘導條件的共同作用下，細胞才會提前發(fā)生破裂釋放胞內酶。通過共表達裂解蛋白E，胞外酶的占比大幅提高。其中，OD600=4時誘導裂解蛋白E的裂解效率最高，可達93%，說明在裂解蛋白E的作用下，細胞破裂的程度加劇，胞內酶的釋放作用加強。此外，誘導裂解蛋白的時間也是影響細胞產(chǎn)酶的重要因素，過早或者過晚誘導，體系中的總酶活力會有不同程度的下降。推測可能是由于過早誘導會導致細胞在密度不夠充足的情況下發(fā)生裂解作用，影響細胞的積累進而漆酶總產(chǎn)量低；過晚誘導時，裂解蛋白表達量較多，細胞裂解過度致使細胞生長情況變差，不利于后期胞內酶的產(chǎn)生與積累。

a-誘導條件優(yōu)化前;b-誘導條件優(yōu)化后;c-誘導條件優(yōu)化后，CotA-RBS5和CotA-RBS5-E在不同OD600誘導裂解蛋白E圖8 發(fā)酵20 h時各樣品胞內和胞外CotA酶活力分析情況Fig.8 Activity analysis of intracellular and extracellular CotA in each sample when fermented at 20 h

3 結論

大腸桿菌作為常用的原核表達系統(tǒng)之一，擁有周期短、成本低、操作簡便的優(yōu)勢，常被用來異源表達漆酶蛋白，然而漆酶在大腸桿菌宿主中常常以胞內酶的形式出現(xiàn)，無法分泌至胞外，往往需要通過破壁的手段得到目的蛋白，增加了下游分離提取的成本。本研究成功通過RBS序列優(yōu)化，將胞內CotA從449 U/L提升至1 236 U/L。利用正交實驗設計，確定了最佳誘導條件為細胞培養(yǎng)至OD600約為0.8時加入終濃度為2 mmol/L Cu2+和0.1 mmol/L IPTG，于30 ℃繼續(xù)誘導，并確定了Cu2+在發(fā)酵過程中起到了激發(fā)漆酶活性的關鍵性作用。最佳誘導條件下，胞外CotA酶活力可達7 926 U/L，較優(yōu)化前提升了5.4倍；同時發(fā)現(xiàn)，通過降低翻譯起始速率和優(yōu)化誘導條件，細胞提前裂解，胞內酶釋放至胞外，胞外酶活力可達4 984 U/L。最后，通過共表達裂解蛋白E，促進了細胞裂解，提高了胞外酶的產(chǎn)量，在菌體濃度OD600達到3.5時誘導裂解蛋白E表達，胞外CotA酶活力在發(fā)酵30 h達到10 283 U/L。研究結果為漆酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要的基礎數(shù)據(jù)。