徐 艷， 唐曉蕾， 韓雙羽， 劉雪蓮

作者單位：(621000)中國(guó)四川省綿陽(yáng)市，四川中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校1眼耳鼻咽喉科教研室；3內(nèi)科學(xué)教研室；2(621000)中國(guó)四川省綿陽(yáng)市中心醫(yī)院眼科

0引言

干眼(dry eye，DE)是眼科常見的一種疾病，主要是由于淚液質(zhì)量下降和動(dòng)力學(xué)異常變化而導(dǎo)致的眼表?yè)p傷，該疾病與患者的性別和年齡有密切的關(guān)聯(lián)，多發(fā)于女性和中老年人[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)DE的發(fā)病率高達(dá)21%～30%，且有逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。近年來(lái)，DE的發(fā)病機(jī)制逐漸引起眼科醫(yī)師的重視，但目前缺乏有效的診治標(biāo)志物，因此，尋找與DE發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系的生物指標(biāo)是十分有意義的。

叉頭框蛋白O3(forkhead box class O3，F(xiàn)OXO3)是FOXO家族中4大亞家族成員之一，其位于細(xì)胞質(zhì)中，在多種器官中都有分布，包括眼、心、胃等，參與調(diào)控氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等重要生理過(guò)程[3]。白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)是一種多向性的炎性因子，參與機(jī)體的多種生理反應(yīng)，過(guò)表達(dá)的IL-2可促進(jìn)炎癥發(fā)展[4]。IL-2在多種炎癥疾病中發(fā)揮重要作用，例如糖尿病[5]、結(jié)腸炎[6]等，另有研究發(fā)現(xiàn)，白內(nèi)障患者眼內(nèi)液中IL-2水平顯著升高[7]。有研究表明，機(jī)體的氧化應(yīng)激能夠激發(fā)炎癥反應(yīng)的進(jìn)程，二者在炎性疾病中具有協(xié)同作用[8]。因此，本研究通過(guò)探究FOXO3、IL-2在DE患者結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚液中的表達(dá)及意義，旨在為明確DE的發(fā)病機(jī)制提供參考依據(jù)。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象前瞻性研究。選取2019-03/2021-03我院收治的DE患者106例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)DE患者符合干眼的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；(2)患者均自愿簽署知情同意書；(3)未合并眼部其他疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他代謝疾??；(2)眼部接受過(guò)手術(shù)；(3)患有精神疾病，不能積極配合治療者。另選同期85位健康體檢者為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)無(wú)眼部疾?。?2)既往無(wú)眼部手術(shù)史或激光治療史；(3)自愿加入研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近1mo內(nèi)有眼局部用藥史；(2)合并其它器官疾病者；(3)精神異常者。本研究均經(jīng)受試者及家屬簽署知情同意書，且經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1樣本采集在DE患者治療前后分別采集樣本，在對(duì)照組首次檢查時(shí)采集樣本。細(xì)胞采集：使用結(jié)膜印記細(xì)胞法，首先在受檢者雙眼結(jié)膜囊內(nèi)滴入0.4%的鹽酸奧布卡因滴眼液局部麻醉，然后在結(jié)膜染色15min后收集結(jié)膜上皮細(xì)胞，將結(jié)膜聚醚礬濾膜分為2份置于球結(jié)膜上，濾膜保存于RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，從濾膜中獲得細(xì)胞后放于冷凍管中，并保存于-20℃?zhèn)溆?。淚液采集：使用毛細(xì)管采淚法，首先于受檢者雙眼內(nèi)眥滴入2滴0.9%的生理鹽水，數(shù)次瞬目使淚液與生理鹽水充分混合，然后用毛細(xì)塑料管(內(nèi)徑0.3～0.5mm)收集受檢者下瞼穹窿或外眥處的淚液100μL，于-20℃保存?zhèn)錅y(cè)。

1.2.2試劑與儀器Trizol試劑(南京森貝伽生物科技有限公司)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海羽哚生物科技有限公司)，2×SYBR Green PCR Master Mix試劑盒[易默(北京)生物技術(shù)有限公司]，引物(上海韻泰信息科技有限公司)，PCR擴(kuò)增儀(BIO-RAD)。

1.2.3FOXO3水平檢測(cè)DE患者樣本中均加入Trizol試劑，進(jìn)行總RNA的提取；根據(jù)RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照2×SYBR Green PCR Master Mix試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)試驗(yàn)，qRT-PCR條件：95℃初始變性30s，95℃ 30s、60℃ 30s和72℃ 30s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見表1。相對(duì)表達(dá)量按照2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4IL-2水平檢測(cè)IL-2水平檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法，嚴(yán)格按照人IL-2 ELISA試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自上海廣銳生物科技有限公司。

1.2.5臨床指標(biāo)檢測(cè)淚膜破裂時(shí)間(break-up time，BUT)：將熒光素鈉溶液均勻涂抹于患者下瞼結(jié)膜囊中，用藍(lán)鉆光照射并認(rèn)真觀察暴露的角膜，記錄瞬目后淚膜上第一次出現(xiàn)破裂點(diǎn)的時(shí)間，小于10s即為陽(yáng)性，取3次結(jié)果的平均值；淚液分泌試驗(yàn)(Schirmer Ⅰ test，SⅠt)：輕撥患者的下瞼，于下瞼結(jié)膜囊中外1/3處放入濾紙，閉眼5min后記錄濾紙濕潤(rùn)的長(zhǎng)度，小于10mm/5min為陽(yáng)性。角膜熒光素染色(cornea fluorescein staining，CFS)：0級(jí)即未染色；1級(jí)即呈散狀點(diǎn)狀染色；2級(jí)即呈密集狀點(diǎn)狀染色；3級(jí)即片狀染色，陽(yáng)性為2～3級(jí)。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.6治療方法所有DE患者均行左氧氟沙星滴眼液和聚乙烯醇滴眼液治療，均為1滴/次，每天5次，共2wk。

2結(jié)果

2.1兩組受試者一般資料比較所有患者均完成隨訪，無(wú)失訪病例。DE組106例中男36例，女70例，年齡40～61(平均52.36±4.84)歲。對(duì)照組85例中男31例，女54例，年齡40～60(平均51.61±4.79)歲，兩組受試者性別比例、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2.2兩組受試者結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚液中FOXO3和IL-2水平比較與對(duì)照組相比，DE組患者結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚液中FOXO3水平均明顯降低，IL-2水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組受試者結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚液中FOXO3和IL-2水平比較

2.3DE患者治療前后結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚液中FOXO3和IL-2水平比較與治療前相比，DE患者治療后結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚液中FOXO3水平明顯上調(diào)，IL-2水平明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表3 DE患者治療前后結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚液中FOXO3和IL-2水平比較

2.4結(jié)膜上皮細(xì)胞和淚液中FOXO3和IL-2水平的相關(guān)性Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，結(jié)膜上皮細(xì)胞、淚液中FOXO3和IL-2水平均呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.531，P<0.01；r=-0.469，P<0.01)，圖1、2。

圖1 結(jié)膜上皮細(xì)胞中FOXO3和IL-2水平的相關(guān)性。

圖2 淚液中FOXO3和IL-2水平的相關(guān)性。

2.5DE患者治療前后臨床指標(biāo)變化DE患者治療后BUT、SⅠt指標(biāo)較治療前上升，CFS指標(biāo)下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

表4 DE患者治療前后臨床指標(biāo)變化

2.6DE患者結(jié)膜上皮細(xì)胞FOXO3和IL-2水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系DE患者結(jié)膜上皮細(xì)胞FOXO3與BUT、SⅠt呈正相關(guān)，與CFS呈負(fù)相關(guān)，IL-2與BUT、SⅠt呈負(fù)相關(guān)，與CFS呈正相關(guān)(均P<0.01)，見表5。

表5 DE患者結(jié)膜上皮細(xì)胞FOXO3和IL-2水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系

2.7DE患者淚液FOXO3和IL-2水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系DE患者淚液FOXO3與BUT、SⅠt呈正相關(guān)，與CFS呈負(fù)相關(guān)，IL-2與BUT、SⅠt呈負(fù)相關(guān)，與CFS呈正相關(guān)(均P<0.01)，見表6。

表6 DE患者淚液FOXO3和IL-2水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系

3討論

隨著人們生活環(huán)境、生活方式的改變及電子設(shè)備的使用率提高，DE的發(fā)生率也在不斷上升，其具有女性比男性多，老年人高于青年人的發(fā)病特點(diǎn)。DE患者常常感覺(jué)眼睛干澀、有異物感、畏光、腫痛等，嚴(yán)重者甚至?xí)l(fā)結(jié)膜病變，造成視力低下，給人們的生活帶來(lái)了許多的不便[10]。研究表明，DE的發(fā)生機(jī)制是由多種因素共同造成的，包括氧化應(yīng)激、炎癥、神經(jīng)功能障礙、細(xì)胞凋亡等，其中氧化應(yīng)激和炎癥為DE發(fā)病的主要原因[11-12]。

FOXO3是FOXO家族中的一員，可在細(xì)胞核中與DNA結(jié)合，人們認(rèn)為FOXO3是一種長(zhǎng)壽基因，存在于機(jī)體的多種器官中[13]。FOXO3從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核，通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝等重要作用[14-15]。Chen等[16]研究表明，視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者血清中的FOXO3水平較對(duì)照組顯著降低，且該疾病會(huì)促使患者發(fā)生全身氧化應(yīng)激。Li等[17]研究表明，與年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者相比，糖尿病性白內(nèi)障患者前囊細(xì)胞中AMPK依賴性轉(zhuǎn)錄因子FOXO3水平受到抑制，同時(shí)細(xì)胞的自噬活性隨之下調(diào)，這可能是糖尿病白內(nèi)障的潛在機(jī)制。有研究表明氧化應(yīng)激與DE的發(fā)生密切相關(guān)。Liu等[18]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病DE小鼠角膜氧化應(yīng)激明顯增強(qiáng)，且角膜FOXO3水平較對(duì)照組顯著降低。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DE組患者結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚液中FOXO3水平較對(duì)照組呈低表達(dá)，考慮可能與DE發(fā)病后氧化應(yīng)激的增強(qiáng)有關(guān)；經(jīng)過(guò)治療，DE患者FOXO3水平明顯上調(diào)，且BUT、SⅠt指標(biāo)較治療前明顯上升，CFS指標(biāo)明顯下降，與Chen等[16]、Liu等[18]研究相似，提示FOXO3參與了DE的發(fā)生，經(jīng)治療后患者的眼表功能得到了一定的恢復(fù)。DE患者結(jié)膜上皮細(xì)胞、淚液FOXO3水平與BUT、SⅠt均呈顯著正相關(guān)，與CFS呈顯著負(fù)相關(guān)，提示FOXO3可反映DE患者病情的嚴(yán)重程度，可能是DE臨床檢測(cè)的生物標(biāo)志物。

IL-2是由113個(gè)氨基酸殘基組成的糖蛋白，為趨化因子家族中的一員，主要由T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生，參與多種生理和病理過(guò)程[19-20]。Pinto-Fraga等[21]研究發(fā)現(xiàn)，DE患者在接受治療第22d后IL-2濃度顯著下降，并表明IL-22可能是治療DE的潛在生物標(biāo)志物。Chen等[22]通過(guò)研究DE模型小鼠表明，在DE急性期IL-2的水平有所增加，而在炎癥緩解后，IL-2水平下降到基線水平。Kwon等[23]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病性黃斑水腫患者房水中IL-2水平較白內(nèi)障患者顯著升高。本研究中，DE組患者結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚液中IL-2水平表達(dá)增加，DE患者治療后結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚液中IL-2水平較治療前明顯下調(diào)，與Pinto-Fraga等[21]、Kwon等[23]研究類似，提示IL-2參與DE發(fā)病，且其水平降低可能與患者病情得到緩解有關(guān)。DE患者結(jié)膜上皮細(xì)胞、淚液IL-2與BUT、SⅠt均呈顯著負(fù)相關(guān)，與CFS呈顯著正相關(guān)，提示IL-2在DE的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用，有望成為DE臨床監(jiān)測(cè)及療效評(píng)估的有效參考指標(biāo)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，結(jié)膜上皮細(xì)胞、淚液中FOXO3和IL-2水平均呈顯著負(fù)相關(guān)，提示其機(jī)制可能為患者機(jī)體FOXO3水平下降，抗氧化應(yīng)激作用失效，氧化損傷發(fā)生，從而誘發(fā)炎癥因子的釋放，IL-2水平上升，進(jìn)而導(dǎo)致DE的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，DE患者結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚液中FOXO3水平降低，IL-2水平升高，二者與患者眼表指標(biāo)存在密切的聯(lián)系，可判斷DE病情的發(fā)展?fàn)顩r，有望成為DE臨床監(jiān)測(cè)及療效評(píng)估的實(shí)驗(yàn)室輔助指標(biāo)。DE的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，F(xiàn)OXO3、IL-2在DE發(fā)病過(guò)程中的具體機(jī)制尚需在今后的研究中進(jìn)一步探索，從而為DE的防治提供可靠的參考依據(jù)。

2陳旭, 申穎. SCD-1、LYSC在干眼癥患者結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚液中表達(dá)及意義. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 2020;42(4):444-448