陳玲玲，黃承志，毛潤乾，修寶林，高 晶，葉鳳嫻，Mubasher Hussain，邱棟梁，申寶營，王朝紅*

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福州 350002；2. 廣東省科學(xué)院動物研究所/廣東省動物保護與資源利用重點實驗室/廣東省野生動物保護與利用公共實驗室/廣東省礦物油農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，廣州 510260）

柑橘木虱Diaphorina citriKuwayama是柑橘類植物的重要害蟲之一，也是柑橘毀滅性病害——柑橘黃龍病最主要的傳播媒介，因此防控柑橘木虱是柑橘產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵舉措。亮腹釉小蜂Tamarixia radiate(Waterston)是柑橘木虱的優(yōu)勢寄生蜂，常寄生柑橘木虱 4～5齡的若蟲[1,2]。一頭亮腹釉小蜂通過取食和寄生的方式可殺滅柑橘木虱若蟲多達500頭。研究表明[3]，柑橘園釋放亮腹釉小蜂可有效控制柑橘木虱，在美國得克薩斯州，大量釋放亮腹釉小蜂可使柑橘木虱種群數(shù)量降低 91.2%[4]。目前，亮腹釉小蜂已被世界各地的柑橘種植區(qū)引入用于防控柑橘木虱[5-7]，并在巴西[8]、墨西哥[9]、美國加利福尼亞州[10]、得克薩斯州[4]和佛羅里達州等地[11]實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)。在中國，廣東省科學(xué)院動物研究所于2020年實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)[12]。

然而，不同地區(qū)生產(chǎn)的亮腹釉小蜂對柑橘木虱的寄生效率有明顯差異。在美國佛羅里達州，亮腹釉小蜂在春夏季寄生率相對較低，平均寄生率＜20%，而在秋季平均寄生率可達 60%以上[5]；在巴西，寄生率為 43.3%～88.8%[8]；在墨西哥西部，平均寄生率達 60.58%[14]。這可能受釋放地溫度、濕度等環(huán)境因素影響，也與亮腹釉小蜂的質(zhì)量相關(guān)。尤其是同一釋放地區(qū)寄生率的大幅度波動，極可能與寄生蜂質(zhì)量有直接關(guān)系。因此，建立亮腹釉小蜂質(zhì)量評價標準，對其生產(chǎn)和應(yīng)用有重要意義。

建立亮腹釉小蜂質(zhì)量評價標準，首先要保證產(chǎn)品的純度，在形態(tài)特征和分子數(shù)據(jù)方面確認物種。研究表明，亮腹釉小蜂的寄生能力與其活動能力、發(fā)育狀態(tài)、個體大小及性別比例等因素息息相關(guān)[8]。體色光鮮、健全的亮腹釉小蜂才能有效寄生柑橘木虱，殘肢或殘翅的雌蜂存活困難，無法進行寄生活動。亮腹釉小蜂營兩性生殖，僅雌性可以寄生，雄性本身并無寄生能力。因此，維持較高水平的雌性比例（雌蜂率），才能保證亮腹釉小蜂對柑橘木虱的防控效果。亮腹釉小蜂在20 ℃左右貯存3 d，仍能保持較高的存活率和寄生能力，但在高溫條件下其死亡率大大升高[8]。生產(chǎn)上獲得亮腹釉小蜂產(chǎn)品后，需盡快將其轉(zhuǎn)移至氣候箱保存，并盡快運送至田間釋放。但在實際生產(chǎn)中往往需要一定時間，檢測天敵產(chǎn)品短時間內(nèi)不同溫度下的存活能力可反映產(chǎn)品質(zhì)量。寄生能力是亮腹釉小蜂產(chǎn)品質(zhì)量好壞最直接的表現(xiàn)。前人研究表明，亮腹釉小蜂在不同地區(qū)對柑橘木虱的寄生能力有明顯的差異，在菲律賓，田間的寄生率為 15%～67%[7]；在中國臺灣，寄生率為30%～87%[6]；在美國，田間寄生率可高達91.2%[4]；對亮腹釉小蜂產(chǎn)品的寄生能力進行檢測極有必要。因此，本文選定亮腹釉小蜂的形態(tài)特征、分子特征、外觀（體色暗淡率和殘肢殘翅率）、包裝數(shù)量、雌蜂率、寄生率及不同貯存溫度條件下寄生蜂死亡率（15 ℃、25 ℃及30 ℃）共7個項目作為質(zhì)量評價指標，以廣東省科學(xué)院動物研究所生產(chǎn)的亮腹釉小蜂為測試對象進行質(zhì)量檢測，根據(jù)檢測結(jié)果建立和制定亮腹釉小蜂成蟲的產(chǎn)品質(zhì)量標準。

1 材料與方法

1.1 寄主植物與供試蟲源

年橘Citrus reticuiataBlanco cv. Nianju購自廣州，種植于廣州農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心溫室，室內(nèi)陽光充足，定期澆水施肥，及時修剪，保證充足的嫩梢嫩枝供試驗使用。

柑橘木虱種群采自廣東省科學(xué)院動物研究所實驗室，以年橘為植物載體飼養(yǎng)于網(wǎng)室內(nèi)作為試驗用蟲。

亮腹釉小蜂為廣東省科學(xué)院動物研究所生產(chǎn)產(chǎn)品，成蟲，每瓶200頭左右（瓶身標識：每瓶含亮腹釉小蜂200頭）。

1.2 儀器設(shè)備

PCR儀（廣州市昊洋貿(mào)易有限公司）、DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）、XW-80A旋渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、MSHOT體視顯微鏡MZ62（廣州市明美光電技術(shù)有限公司）、恒溫恒濕培養(yǎng)箱（天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠）、60目防蟲袋、吸蟲器（湖北廣之應(yīng)科技有限公司）

1.3 物種形態(tài)特征

物種形態(tài)特征是物種種類鑒定的基礎(chǔ)。對亮腹釉小蜂產(chǎn)品質(zhì)量進行評價首先應(yīng)進行形態(tài)鑒定，保證物種形態(tài)特征與前人描述[8,15]相吻合。本文隨機選擇5瓶亮腹釉小蜂，每瓶取其中10頭（5頭雌、5頭雄）進行物種形態(tài)鑒定。

1.4 物種分子特征

近年來利用基因序列對物種進行鑒定的方法得到廣泛的推廣和使用。目前在GeneBank上已能查到亮腹釉小蜂的多個基因序列特征，本文根據(jù)Folmer等[14]和Barr等[15]的試驗方法，分別利用細胞色素氧化酶I（cytochrome oxidase subunit I，COI）的保守區(qū)域和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1、2（internal transcribed spacer，ITS-1、ITS-2）進行物種分子鑒定。

隨機抽樣選擇5瓶亮腹釉小蜂，每瓶取其中1頭進行總DNA的提取，試劑盒選用天根生物血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（DP304），試驗步驟嚴格遵循試劑盒說明。PCR反應(yīng)使用50 μL體系，DNA模板2 μL，引物各0.5 μmol/L（表1），25 μL Mix（2X SanTaq PCR Mix 預(yù)混液，含藍染料，生工生物B532061），用無菌水補足。

表1 分子鑒定選用的上下游引物Table 1 Upstream and downstream primers selected for molecular identification

反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃（5 min）→變性94 ℃（30 s）→退火50～60 ℃（30 s）→延伸72 ℃（30～60 s/kb）→延伸72 ℃（10 min）→保存4 ℃（∞），其中第2步變性至第4步延伸重復(fù)35個循環(huán)。

1.5 雌蜂體色及殘疾檢測

利用體式顯微鏡觀察亮腹釉小蜂是否體色暗淡，是否殘翅殘肢。隨機選擇 10瓶亮腹釉小蜂，每兩瓶為1個樣本，從兩瓶中取200頭雌性亮腹釉小蜂測試，記錄體色暗淡或出現(xiàn)殘翅殘肢的雌蜂數(shù)量，并分別統(tǒng)計體色暗淡和殘肢殘翅個體數(shù)量占總數(shù)的比率（體色暗淡率和殘肢殘翅率），共檢測5次。

1.6 數(shù)量檢測

隨機選擇5瓶亮腹釉小蜂進行手動計數(shù)，記錄每瓶中亮腹釉小蜂的實際數(shù)量，計算每瓶亮腹釉小蜂數(shù)量占包裝瓶標識數(shù)量（200頭/瓶）的比率，每瓶為一個樣本，共檢測5個樣本。

1.7 雌蜂率檢測

本文隨機選擇5瓶亮腹釉小蜂，記錄其雌蜂數(shù)量，統(tǒng)計雌蜂率，重復(fù)5次。

1.8 不同溫度下亮腹釉小蜂貯存死亡率檢測

隨機選擇15瓶亮腹釉小蜂并分成3組，每瓶取100頭；將各組亮腹釉小蜂分別置于溫度15 ℃（低溫）、25 ℃（常溫）、30 ℃（高溫），相對濕度50%～70%、光周期14L:10D的人工氣候箱中處理10 h；記錄亮腹釉小蜂的死亡數(shù)量，統(tǒng)計死亡率。

1.9 寄生率檢測

準備帶有嫩稍的年橘，選取合適位置套15 cm×15 cm的60目防蟲袋，在其中轉(zhuǎn)入100頭4齡末柑橘木虱若蟲。從1瓶亮腹釉小蜂產(chǎn)品中隨機選取10頭雌蟲轉(zhuǎn)入上述防蟲袋中，24 h后移除亮腹釉小蜂。7～9 d后檢查統(tǒng)計被寄生的柑橘木虱數(shù)量，統(tǒng)計寄生率。以上試驗在26 ℃，相對濕度60%，光周期14L:10D的條件下進行，重復(fù)5次。

2 結(jié)果與分析

2.1 物種形態(tài)特征

（1）雌蜂

體長0.92～1.04 mm，大部分黑褐色，復(fù)眼和單眼紅褐色，頭寬于長，上顎2齒及1截齒，下顎須和下唇須各1節(jié)。觸角8節(jié)（觸角式1，1，3，3），具1小環(huán)狀節(jié)；柄節(jié)長為寬的3.7倍；梗節(jié)等長或稍長于第1索節(jié)；第1～3索節(jié)長比分別為11:10:9，分別具4～7個刺狀感覺器；棒節(jié)3節(jié)，末端具針狀突出，各棒節(jié)分別具7～11個刺狀感覺器。觸角基節(jié)暗褐色，柄節(jié)淺色，背緣暗色，其余各節(jié)暗黃色。

中胸盾中葉近側(cè)緣具2對毛，小盾片亞中線外緣具2對毛，盤狀感覺器靠近前1對毛；并胸腹節(jié)褶不完整，具不規(guī)則的網(wǎng)狀紋。翅透明，前翅長為寬的2.3倍；亞緣脈端部呈折斷痕，亞緣脈具1根剛毛，端部下方具2～3根毛；前緣室基部具1～2根細毛，端部具3～4根細毛；緣脈具7～9根剛毛。足跗節(jié)4-4-4，足淺黃色，基節(jié)和跗節(jié)末端暗褐色。

腹部腹板黃色，第1～4節(jié)背板或第1～5節(jié)背中央大部分黃色，呈大黃色斑。第3產(chǎn)卵瓣暗褐色，產(chǎn)卵器從腹部第2腹節(jié)伸出，稍突出腹末端，產(chǎn)卵器為中足脛節(jié)長的1.6倍，第3產(chǎn)卵瓣為產(chǎn)卵器長的0.2倍（圖1）。

圖1 亮腹釉小蜂（Patrícia Milano繪圖[8]）Fig. 1 Tamarixia radiata（Patrícia Milano[8]）

（2）雄蜂：

體色與形態(tài)相似于雌蟲，體長0.84～1.05 mm。觸角9節(jié)（觸角式1，1，4，3）；柄節(jié)基向近2/5～1/2處具1小長圓形感覺區(qū)；索節(jié)4節(jié)，各節(jié)分別具1排6～7根長剛毛；第1棒節(jié)1排剛毛稍短，棒節(jié)末端具針狀突出。腹部第1～2節(jié)背板中央大部分暗黃色，邊緣黑褐色，呈小暗黃色斑；腹部第1～3腹板大部分暗黃色，其余腹板黑褐色。雄性外生殖器長，從腹部第4腹節(jié)基部伸出，指狀突端部暗褐色（圖1）。

2.2 物種分子特征

亮腹釉小蜂分子鑒定結(jié)果顯示，目的基因COI、ITS-1和ITS-2在NCBI（National Center for Biotechnology Information Search Database）數(shù)據(jù)庫中比對的種內(nèi)相似度均較高（表2）：COI的種內(nèi)相似度為98.5%～100.0%，而與數(shù)據(jù)庫中同屬的其他種間相似度不高于94.0%；ITS-1種內(nèi)相似度最低為97.9%，而與同屬的其他種相似度僅為82.0%；ITS-2種內(nèi)相似度為99.0%～100.0%，種間相似度小于82.7%。因此本標準規(guī)定，COI、ITS-1和ITS-2相似度應(yīng)高于97%，則認為該種為亮腹釉小蜂。

表2 亮腹釉小蜂分子鑒定信息Table 2 Tamarixia radiata molecular identification information

2.3 雌蜂外觀檢測結(jié)果

檢測結(jié)果如表3，在5次亮腹釉小蜂雌蜂外觀檢測中，亮腹釉小蜂體色暗淡率最高為1.5%，亮腹釉小蜂殘肢殘翅率的比率最高為0.4%。

表3 亮腹釉小蜂檢測結(jié)果Table 3 Test data of Tamarixia radiata

本文根據(jù)檢測結(jié)果并結(jié)合生產(chǎn)實際，規(guī)定亮腹釉小蜂產(chǎn)品中的雌性亮腹釉小蜂體色暗淡率不高于2.0%、殘肢殘翅率不高于1.0%。

2.4 數(shù)量檢測結(jié)果

檢測結(jié)果如表3所示，隨機抽取5瓶亮腹釉小蜂產(chǎn)品，其數(shù)量占標識的比率最低為99.0%。根據(jù)檢測結(jié)果結(jié)合生產(chǎn)實際，本文規(guī)定產(chǎn)品包裝中亮腹釉小蜂的數(shù)量比率不低于標識數(shù)量的95.0%。

2.5 雌蜂率檢測結(jié)果

本文檢測結(jié)果如表3所示，在5次檢測中，雌蜂率最低為71.0%。所以，本文規(guī)定產(chǎn)品質(zhì)量標準中的雌蜂率不低于70.0%。

2.6 不同溫度下亮腹釉小蜂貯存死亡率檢測結(jié)果

天敵產(chǎn)品的耐貯存能力是決定天敵能否進行規(guī)模化生產(chǎn)和作為商品進行運輸?shù)臎Q定性條件之一。亮腹釉小蜂在不同貯存條件下的死亡率反應(yīng)其抗逆能力和對環(huán)境的適應(yīng)能力，是保證亮腹釉小蜂能夠有效寄生的指標之一，也是亮腹釉小蜂質(zhì)量指標一種重要參數(shù)。由于缺乏文獻和標準參考，本標準根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，將亮腹釉小蜂在不同溫度條件下貯存10 h后，記錄其死亡率。

檢測結(jié)果如表3，15 ℃低溫貯存死亡率最高為3.0%，25 ℃常溫貯存死亡率最高為2.0%，30 ℃高溫貯存死亡率最高為4.0%。

根據(jù)檢測結(jié)果，規(guī)定產(chǎn)品質(zhì)量標準中不同溫度下亮腹釉小蜂貯存死亡率均不得高于5.0%。

2.7 寄生率檢測結(jié)果

本次檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨機抽取的亮腹釉小蜂寄生率最低為92.0%，最高可達到100.0%（表3）。因此，本質(zhì)量標準規(guī)定，亮腹釉小蜂產(chǎn)品在實驗室條件下寄生率不低于90%。檢測結(jié)果用于質(zhì)量評價指標，不能用于田間標準評價。

3 討論

迄今為止，國際上巴西等國實現(xiàn)了亮腹釉小蜂的工廠化生產(chǎn)，在國內(nèi) 2020年廣東省科學(xué)院動物研究所實現(xiàn)了規(guī)模化生產(chǎn)[8-13]，而并無有關(guān)亮腹釉小蜂的質(zhì)量標準的研究。本文首次確定了亮腹釉小蜂成蟲質(zhì)量的檢測項目和檢測指標，檢測項目包括檢測物種形態(tài)及分子特征、外觀（體色暗淡率、殘肢殘翅率）、產(chǎn)品數(shù)量、雌蜂率、寄生率及不同溫度下（15 ℃、25 ℃及30 ℃）亮腹釉小蜂貯存死亡率共7個質(zhì)量指標。通過檢測廣東省科學(xué)院動物研究所生產(chǎn)的亮腹釉小蜂各項指標，首次確立了指標參數(shù)，制定了亮腹釉小蜂成蟲的質(zhì)量標準，見表4。

表4 亮腹釉小蜂產(chǎn)品質(zhì)量標準Table 4 Product quality standards of Tamarixia radiata

在物種分子特征檢測上，常用細胞色素氧化酶 I（cytochrome oxidase subunit I，COI）的保守區(qū)域、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1、2（internal transcribed spacer，ITS-1、ITS-2），本文做的這兩種檢測都是可以用于質(zhì)量技術(shù)檢測，在生產(chǎn)實際中只需選擇其中一種即可；而簡單重復(fù)間序列（Inter simple sequence repeat，ISSR）電泳條帶特征[16]進行物種分子檢測時，由于不易操作，所以不作為物種分子特征檢測的方法。

在不同溫度下貯存寄生蜂死亡率檢測上，目前采用15 ℃（低溫）、25 ℃（常溫）及30 ℃（高溫）3種溫度，將亮腹釉小蜂分別置于這3種溫度下處理10 h后進行檢測。對于在變溫條件下貯存不同時間寄生蜂死亡率的檢測方法，暫無可行的方法，還有待研究。

利用本標準檢測評價廣東省科學(xué)院動物研究所寄生蜂天敵工廠生產(chǎn)出來的亮腹釉小蜂成蟲[17]，結(jié)果表明該標準檢測方法合理，可操作性強。