嚴(yán)慧玲， 郭新波， 劉金釧

（華南理工大學(xué)輕工與食品國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，廣東 廣州 510640）

0 引言

培養(yǎng)具有創(chuàng)新意識(shí)和創(chuàng)新能力的高素質(zhì)人才，是目前各高校人才培養(yǎng)的共同追求。在人才培養(yǎng)的過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)教學(xué)是其中的重要組成部分。通過(guò)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，可以培養(yǎng)學(xué)生發(fā)現(xiàn)及解決問(wèn)題的能力，激發(fā)其創(chuàng)新意識(shí)，養(yǎng)成嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度。在提高學(xué)生學(xué)術(shù)綜合素養(yǎng)的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)高等教育內(nèi)涵發(fā)展，提升人才培養(yǎng)質(zhì)量， 強(qiáng)化學(xué)生實(shí)踐能力和創(chuàng)新思維的目標(biāo)。

由于學(xué)時(shí)有限等原因，實(shí)驗(yàn)課程內(nèi)容安排欠合理是目前本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)面對(duì)的一大難題。為了完成教學(xué)內(nèi)容安排，大部分高校的實(shí)驗(yàn)課程按照“一門(mén)實(shí)驗(yàn)跟一門(mén)課程”的模式進(jìn)行教學(xué)。如《食品微生物實(shí)驗(yàn)》對(duì)應(yīng)《食品微生物學(xué)》課程，主要講述食品中微生物各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。此外，不同實(shí)驗(yàn)課程的教學(xué)內(nèi)容比較孤立，各實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之間相互獨(dú)立。即使是綜合性實(shí)驗(yàn)，綜合的一般都是本門(mén)理論課程中的各個(gè)知識(shí)點(diǎn)，與其他課程的內(nèi)容交叉甚少甚至完全獨(dú)立[1]。

為了提高實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)效果，鞏固學(xué)生所學(xué)的知識(shí)，讓學(xué)生熟悉與掌握實(shí)踐性較強(qiáng)的技術(shù)，在食品生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中引入科研實(shí)驗(yàn)室常用的葉酸含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)，同時(shí)融合了微生物相關(guān)的知識(shí)點(diǎn)。旨在通過(guò)葉酸含量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)，將維生素的性質(zhì)、酶的應(yīng)用、微生物培養(yǎng)等知識(shí)內(nèi)容結(jié)合在一起，從葉酸的提取、菌種活化到接種、培養(yǎng)、含量測(cè)定，將食品生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課重新編排，以葉酸的提取及含量測(cè)定作為教學(xué)模塊，形成具有連貫性的教學(xué)內(nèi)容。

1 葉酸含量測(cè)定綜合性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 基本思路

食品生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)是食品專業(yè)本科生重要的專業(yè)基礎(chǔ)課，根據(jù)專業(yè)培養(yǎng)目標(biāo)及課程設(shè)置要求，針對(duì)營(yíng)養(yǎng)類綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了探索和實(shí)踐[2-3]?；舅悸罚阂越ㄔO(shè)食品科學(xué)一流學(xué)科為目標(biāo)，更多地體現(xiàn)學(xué)科特色，充分考慮到課程的銜接性和延續(xù)性，盡可能將零散的知識(shí)點(diǎn)串聯(lián)在一起，綜合目前科研實(shí)驗(yàn)室常用的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)，激發(fā)和培養(yǎng)學(xué)生對(duì)本專業(yè)的熱情及科研參與積極性，增強(qiáng)學(xué)生靈活應(yīng)用理論知識(shí)解決實(shí)際問(wèn)題的意識(shí)和能力。

葉酸含量測(cè)定的綜合性實(shí)驗(yàn)涵蓋了微生物學(xué)、分析化學(xué)、食品生物化學(xué)3 門(mén)課程。由于實(shí)驗(yàn)涉及的知識(shí)點(diǎn)較多，為使學(xué)生能夠更好地理解操作步驟，將對(duì)應(yīng)知識(shí)點(diǎn)進(jìn)行歸納總結(jié)，如表1 所示[4-5]。

表1 實(shí)驗(yàn)步驟及對(duì)應(yīng)知識(shí)點(diǎn)Tab. 1 Experimental steps and knowledge points

1.2 菌種的選擇

酪乳酸桿菌（ATCC 7469） 、糞鏈球菌（ATCC 8043）是葉酸需求菌，其生長(zhǎng)狀況和所處環(huán)境中葉酸的含量高低具有極強(qiáng)的相關(guān)性[6-7]。在一定條件下，酪乳酸桿菌和糞鏈球菌的繁殖速度與葉酸含量呈正比關(guān)系，細(xì)菌增殖的量以吸光度值計(jì)，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，能計(jì)算出樣品中葉酸的含量。國(guó)標(biāo)GB 5 009.211－2014采用酪乳酸桿菌（ATCC 7 469）作為檢測(cè)菌，但因其檢測(cè)限低、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，不適合用于本科教學(xué)，故選用糞鏈球菌作為本實(shí)驗(yàn)的葉酸檢測(cè)菌[8-10]。

2 實(shí)驗(yàn)安排

考慮到本科實(shí)驗(yàn)的難度及深度，葉酸含量測(cè)定綜合性實(shí)驗(yàn)在本科第4 學(xué)期開(kāi)設(shè)。此時(shí)學(xué)生已完成分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、無(wú)機(jī)化學(xué)、微生物等課程的學(xué)習(xí)，具有一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。為了保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，讓學(xué)生從基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)到綜合性實(shí)驗(yàn)有一個(gè)較好的過(guò)渡，將葉酸含量測(cè)定綜合性實(shí)驗(yàn)設(shè)置為半開(kāi)放實(shí)驗(yàn)：即將實(shí)驗(yàn)分成兩部分，葉酸的提取為開(kāi)放部分，由學(xué)生自行查找文獻(xiàn)以確定方法；葉酸含量的檢測(cè)為給定部分，教師提供既定的方法。實(shí)驗(yàn)室根據(jù)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)方案向其提供實(shí)驗(yàn)所需的試劑及設(shè)備。

2.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

市面上常見(jiàn)果蔬、谷物類及營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑型樣品均可，材料由學(xué)生自帶。

實(shí)驗(yàn)用菌種：糞鏈球菌（Streptococcus faecalis, S.F.ATCC 8 043）。

提供學(xué)生實(shí)驗(yàn)方案涉及的所有試劑。

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.2.1 檢測(cè)菌懸液的制備

菌種的復(fù)蘇：從甘油管中挑取小部分菌液，用平板劃線法得到單菌落；用接種環(huán)挑取ATCC8043 平板上一顆單菌落，接種至裝有30 mL 已滅菌的腦心浸液肉湯培養(yǎng)基的50 mL 無(wú)菌離心管中，輕輕旋上蓋子，置于37 °C 搖床培養(yǎng)4 h 至肉眼可見(jiàn)溶液變渾濁即可。

菌懸液的制備：菌種復(fù)蘇完畢后，8 000 r/min 離心2 min，在無(wú)菌環(huán)境中，倒去上清液，添加30 mL 0.85%無(wú)菌生理鹽水，重懸菌體，8 000 r / min 離心2 min。重復(fù)以上步驟3 次以清洗菌體，最后加入一定量的生理鹽水重懸菌體，在660 nm 下調(diào)整光密度至0.8 左右，即得到實(shí)驗(yàn)用菌懸液，需現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2.2 葉酸的提取

常用的葉酸提取方法包括單酶法和三酶法[11-16]。針對(duì)不同的食品種類，葉酸的提取方法略有不同，此部分設(shè)置為開(kāi)放實(shí)驗(yàn)，樣品的預(yù)處理及提取由學(xué)生自行查閱文獻(xiàn)確定，教師提供其所需試劑。為消除試劑本身所含葉酸對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，按照同樣的提取方法準(zhǔn)備一支空白管，樣品部分以等質(zhì)量的超純水代替。

1.1.1 細(xì)胞 SiHa、Hela、MS751人宮頸癌細(xì)胞、HcerEpic人正常子宮頸上皮細(xì)胞，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

2.2.3 葉酸含量的測(cè)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

取15 mL 離心管按照0～9 號(hào)進(jìn)行標(biāo)記，向每支管中分別加入5 mL 葉酸測(cè)定培養(yǎng)基，于0～9 號(hào)管分別加入葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液（2 ng/mL）：0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、1.75、2.00、2.50 和3.00 mL，用超純水補(bǔ)至5 mL，于121 °C 滅菌20 min 后冷卻，在無(wú)菌操作的條件下，吸取50 μL 生理鹽水菌懸液至每支測(cè)定離心管中，于37 °C 搖床中培養(yǎng)18～20 h。將培養(yǎng)完畢后的離心管置于4 °C 冰箱中靜置15～30 min。以0 號(hào)管為參比，于660 nm 處測(cè)量吸光值，記錄數(shù)據(jù)。以標(biāo)準(zhǔn)系列管中葉酸含量為自變量（x），吸光度值為因變量（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）測(cè)定。

取15 mL 離心管分別標(biāo)注樣品管及空白管，每孔分別加入5 mL 葉酸測(cè)定培養(yǎng)基，于樣品管、空白管分別加入100 μL 樣品提取液（實(shí)際加樣體積應(yīng)按照樣品具體情況進(jìn)行調(diào)整）、100 μL 空白對(duì)照提取液（具體體積應(yīng)與樣品管相等），用超純水補(bǔ)至5 mL。接種及培養(yǎng)方法同上。測(cè)各樣本生長(zhǎng)后在660 nm 處的吸光值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算樣品中葉酸含量。

2.3 結(jié)果計(jì)算

試樣中葉酸含量計(jì)算公式為

3 具體實(shí)施及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

不同于以往的實(shí)驗(yàn)，葉酸綜合性實(shí)驗(yàn)知識(shí)點(diǎn)較多且實(shí)驗(yàn)的連貫性強(qiáng)，若實(shí)驗(yàn)操作的其中一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)紕漏，則容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差大，甚至失敗。所以教師在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的引導(dǎo)作用尤為重要，具體流程如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程Fig. 1 Experimental process

為了取得更好的教學(xué)效果，采取小班分組的方式進(jìn)行教學(xué)，每個(gè)教師指導(dǎo)3～4 組學(xué)生，學(xué)生以2 人為單位組成一個(gè)小組，單獨(dú)完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。為了讓實(shí)驗(yàn)更連續(xù)，摒棄了“一周一次課，一次4 學(xué)時(shí)”的傳統(tǒng)教學(xué)時(shí)間安排，改為連續(xù)的“兩天12 學(xué)時(shí)”的時(shí)間安排，讓學(xué)生更多地參與實(shí)驗(yàn)過(guò)程。由于本項(xiàng)目支持學(xué)生重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若學(xué)生無(wú)法在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成，則可以在課后與教師預(yù)約，另行安排時(shí)間完成。

在樣品的選擇上設(shè)置了開(kāi)放環(huán)節(jié)，由學(xué)生根據(jù)自己的興趣自帶樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如西紅柿、奶粉、維生素強(qiáng)化劑等。如何對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，稱取多少樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這些都需要學(xué)生查閱文獻(xiàn)后確定。實(shí)驗(yàn)室給每組學(xué)生提供試劑，而溶液的配制及樣品的處理均由學(xué)生自行完成。

比較學(xué)生繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)以半開(kāi)放形式開(kāi)展本實(shí)驗(yàn)，得到的數(shù)據(jù)具有較好的穩(wěn)定性。以標(biāo)準(zhǔn)系列管中葉酸含量為x值， 吸光度值為y值，繪制一階方程得到R2>0.960 的標(biāo)準(zhǔn)曲線；按照唐靚等[16]的方法繪制4 階方程，則R2≥0.999，線性擬合良好。

實(shí)驗(yàn)完成后，要求學(xué)生以小論文的形式提交報(bào)告，撰寫(xiě)嚴(yán)格按照華南理工大學(xué)本科畢業(yè)論文格式的要求。小論文的撰寫(xiě)需要學(xué)生查閱大量的文獻(xiàn)，累計(jì)一定的知識(shí)，形成自己的實(shí)驗(yàn)思路。除了課堂上的有限學(xué)習(xí)時(shí)間，促使學(xué)生充分利用課后時(shí)間，改變應(yīng)試教育模式，讓學(xué)生學(xué)以致用，擴(kuò)大知識(shí)面。教師以引導(dǎo)者的身份引導(dǎo)學(xué)生完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)，及時(shí)解答學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)的各種問(wèn)題，通過(guò)提問(wèn)的方式啟發(fā)學(xué)生找到問(wèn)題原因，并解決問(wèn)題。不同于其他實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)過(guò)程允許出錯(cuò)，支持學(xué)生重復(fù)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生養(yǎng)成鍥而不舍的科研精神。

4 結(jié)束語(yǔ)

自2018 年開(kāi)始在本科食品生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中實(shí)施以來(lái)，葉酸含量測(cè)定綜合性實(shí)驗(yàn)獲得了學(xué)生的一致好評(píng)。因該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目與現(xiàn)實(shí)生活貼近，實(shí)驗(yàn)選材為生活中常見(jiàn)的食品，學(xué)生表現(xiàn)出較高的興趣，大大提高了學(xué)習(xí)的主動(dòng)性。以學(xué)生為主、教師為輔的教學(xué)模式，充分鍛煉了學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)和探索精神。學(xué)生自行組隊(duì)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，獨(dú)立提出實(shí)驗(yàn)方案和實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，自主實(shí)驗(yàn)、分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)論文。連貫性較強(qiáng)，避免了基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)存在的知識(shí)點(diǎn)分散等問(wèn)題，讓學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)的整個(gè)流程更加清晰，有利于其對(duì)現(xiàn)行檢測(cè)方法的掌握。小班教學(xué)、小組配合，可以加深學(xué)生對(duì)基礎(chǔ)理論知識(shí)的理解，提高基本實(shí)驗(yàn)技能，增強(qiáng)分析問(wèn)題、解決問(wèn)題的能力，培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)思維方法、逐步建立探索創(chuàng)新意識(shí)，又能培養(yǎng)團(tuán)隊(duì)合作精神，為今后進(jìn)入科學(xué)研究領(lǐng)域奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

該實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求不高，但綜合性強(qiáng)，具有一定的廣度及深度，適合作為食品專業(yè)的綜合性實(shí)驗(yàn)在各高校中開(kāi)展。