葉 青,李志剛△,時(shí)素華,姚海江,胡 煜,孫潤(rùn)權(quán),曹祖懋,劉思遠(yuǎn),劉奕志,王 帥

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,北京 100029；3.中國(guó)康復(fù)研究中心 北京博愛(ài)醫(yī)院,北京 100068)

脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)是一種具有高致殘率和高死亡率的神經(jīng)創(chuàng)傷性疾病。由此可以引發(fā)如缺血、氧化應(yīng)激、炎性事件、凋亡途徑和運(yùn)動(dòng)障礙等一系列的并發(fā)問(wèn)題,導(dǎo)致嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)功能障礙、反射異常以及自主神經(jīng)功能紊亂[1]。原因主要有交通事故、跌倒或暴力等。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)道，全世界每年大約有25～50萬(wàn)人受到脊髓損傷的影響[1]。一項(xiàng)中國(guó)創(chuàng)傷性脊髓損傷住院患者流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示[2]：2018年俄國(guó)三級(jí)醫(yī)院脊髓損傷住院患者約為72 907例，平均年齡為51.6歲，男性是女性的3倍，高處墜落是最常見(jiàn)的原因，其次是跌倒。治療脊髓損傷的平均費(fèi)用在23 228～53 783元不等，單次住院費(fèi)用最高可達(dá)30萬(wàn)元，給患者及其家庭乃至社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。脊髓損傷機(jī)制主要分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷[3]。其潛在的治療策略主要包括增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)、減少繼發(fā)性損傷以及通過(guò)激活神經(jīng)元再生能力、改善微環(huán)境等來(lái)促進(jìn)再生修復(fù)[4]。其中脊髓損傷后，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Neurotrophic factors，NTFs)的缺乏是導(dǎo)致再生失敗的主要原因之一。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通常是通過(guò)軸漿運(yùn)輸以受體介導(dǎo)的方式進(jìn)入神經(jīng)末梢，以此來(lái)促進(jìn)胞體有關(guān)蛋白質(zhì)的合成以及神經(jīng)細(xì)胞的再生、發(fā)育和功能恢復(fù)[5]。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived Neurotrophic Factor，BDNF)是目前實(shí)驗(yàn)性脊髓損傷中研究最多的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。電針能有效抑制脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡相關(guān)因子、促進(jìn)神經(jīng)元軸突再生和功能恢復(fù)和減少膠質(zhì)瘢痕形成等[6]。重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(repetitive TMS, rTMS)是連續(xù)給予一定頻率脈沖作用于脊髓損傷患者的運(yùn)動(dòng)皮層，使之產(chǎn)生的感應(yīng)電流激活上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，進(jìn)一步誘發(fā)神經(jīng)沖動(dòng)的過(guò)程。rTMS 在臨床研究發(fā)現(xiàn)：rTMS對(duì)于脊髓損傷患者的運(yùn)動(dòng)呼吸功能與消化功能都有所改善，還具有鎮(zhèn)痛作用、防止肌萎縮及痙攣等作用[7-10]。本研究從神經(jīng)再生的角度，選擇不同時(shí)間點(diǎn)觀察 SCI大鼠神經(jīng)功能、組織病理形態(tài)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF)、原肌球蛋白受體激酶B((Tropomyosin receptor kinase B,TrkB)與p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體(p75neurotrophinreceptor ,p75NTR)的表達(dá)情況，探討電針聯(lián)合經(jīng)顱磁刺激治療SCI的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔級(jí)6周齡SD雄性大鼠120只，體質(zhì)量(220±20)g，由維通利華(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供[生產(chǎn)許可證證號(hào)：SCXK(京)2016-0006],北京中醫(yī)藥大學(xué)良鄉(xiāng)校區(qū)清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，溫度為(25±3)℃，濕度(45±10)%，自由飲水進(jìn)食，12 h晝夜規(guī)律調(diào)整，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠隨機(jī)分為6組：空白組(12只)、假手術(shù)組(12只)、模型組(24只)、電針組(24只)、經(jīng)顱磁刺激組(24只)和聯(lián)合組(24只)。模型組、電針組經(jīng)顱磁刺激組及聯(lián)合組再按干預(yù)1 d、7 d分為兩個(gè)亞組，每個(gè)亞組12只。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物處置符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑 rabbit anti-BDNF(美國(guó)Abcam公司ab108319);rabbit anti-TrkB(美Abcam公司ab187041);rabbit anti-p75(美國(guó)Abcam公司ab52987);4%組織細(xì)胞固定液(北京酷來(lái)搏科技有限公司);蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);兔二步法檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);Western Blotting檢測(cè)試劑盒(中國(guó)江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。

1.2.2 儀器 Allen’s打擊裝置(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院微循環(huán)研究所);CP-8000科德士寵物用電推剪(深圳市科德士電器有限公司);韓氏電針儀(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)公司);華佗牌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);經(jīng)顱磁刺激儀(武漢依瑞德醫(yī)療設(shè)備新技術(shù)有限公司);電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);RM2235 組織切片機(jī)(德國(guó) LEICA公司);BX53自動(dòng)化智能型正置研究級(jí)顯微鏡(日本OLYMPUS公司);移液器(德國(guó) eppendorf);電泳儀(美國(guó) Bio-rad Power Supplies Basic);臺(tái)式恒溫振蕩器(中國(guó)上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 THZ-312)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)MD Spectramac M3);PH計(jì)(美國(guó)OHAUS STARTER 2C);分析天平(中國(guó)精密分析天平JA3003)。

1.3 模型制備

大鼠術(shù)前禁食禁水8 h，紫外燈消毒動(dòng)物手術(shù)室30 min，手術(shù)器械消毒，手術(shù)室溫度不低于20 ℃。模型組、電針組、經(jīng)顱磁刺激組及聯(lián)合組腹腔注射麻醉后，固定于自制的弓形手術(shù)臺(tái)上，剔除背部T9～11及周圍毛發(fā)。消毒后分離背部肌肉、深筋膜，依次暴露T9～11段棘突和椎板，暴露脊髓；采用改良式Allen’s打擊裝置[11]:將10 g打擊錘套入鋼管內(nèi)高度為5 cm，致傷量為50 g/cm，造成T10～11節(jié)段脊髓損傷，此致傷量可造成大鼠的不完全性截癱，屬中等程度損傷?？焖倏p合傷口。大鼠清醒后,模型組造模后不進(jìn)行任何治療;假手術(shù)組只暴露脊髓，不損傷，隨后縫合傷口。術(shù)后單籠飼養(yǎng)、定時(shí)膀胱擠壓幫助排尿。模型評(píng)價(jià)成功標(biāo)準(zhǔn)為身體痙攣性顫動(dòng)、尾巴痙攣性擺動(dòng)、硬脊膜內(nèi)充血或血腫和麻醉醒后雙下肢表現(xiàn)為不完全癱瘓。

1.4 治療方法

1.4.1 空白組、模型組和假手術(shù)組 相同飼養(yǎng)條件下不做任何處理，模型組及假手術(shù)組造模后也不做任何處理，但均要在重復(fù)經(jīng)顱磁刺激組、聯(lián)合組治療時(shí)抓取1次，以保證處理?xiàng)l件相同。

1.4.2 電針組 參照《大鼠穴位圖譜的研制》[12]選取相當(dāng)于人體解剖部位的“大椎”(第7頸椎棘突下，向下斜刺)、“命門”(第2腰椎棘突下，向上斜刺)。用華佗牌規(guī)格Φ 0.25 mm×15 mm毫針進(jìn)行針刺，進(jìn)針約0.5～0.7 cm。針柄連接韓氏LH-202H型電療儀，上接陰極，下接陽(yáng)極，持續(xù)脈沖電流，頻率2 Hz，強(qiáng)度2 mA，治療時(shí)間20 min，輸出強(qiáng)度在剛開(kāi)始時(shí)以背部肌肉出現(xiàn)輕微抽動(dòng)為度，待其適應(yīng)后則以雙下肢癱瘓肌肉出現(xiàn)有節(jié)律的收縮為度。1 d組于造模清醒后治療1次，7 d組于造模后與1 d組同一時(shí)間每天重復(fù)治療1次，持續(xù)到達(dá)預(yù)定時(shí)間。

1.4.3 經(jīng)顱磁刺激組 采用YRD CCY-I型磁刺激儀，脈沖磁場(chǎng)峰值強(qiáng)度為3 T。造模1 d后，將大鼠置于固定器中，頭部固定，圓形線圈磁場(chǎng)中心置于大鼠左前囟上方，應(yīng)用90%靜息運(yùn)動(dòng)閾值(造模前，測(cè)量大鼠的運(yùn)動(dòng)閾值，結(jié)果示運(yùn)動(dòng)閾值為最大脈沖強(qiáng)度的21%),刺激頻率5 Hz。每序列2 s，間歇28 s，共15 min。1 d組于造模清醒后2 h治療1次，7 d組于造模后與1 d組同一時(shí)間每天重復(fù)治療1次，持續(xù)到達(dá)預(yù)定時(shí)間[13]。

1.4.4 聯(lián)合組 干預(yù)方法同電針組加經(jīng)顱磁刺激組治療。

1.5 取材及指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 行為學(xué)檢測(cè) 運(yùn)用運(yùn)動(dòng)功能BBB[14]計(jì)分法對(duì)大鼠脊髓損傷進(jìn)行評(píng)估，將大鼠后肢運(yùn)動(dòng)分為22個(gè)等級(jí)，后肢全癱為0分，完全正常為21分。綜合評(píng)定大鼠脊髓損傷后的功能，包括感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)、反射及肢體動(dòng)作協(xié)調(diào)等方面。

1.5.2 組織取材 在行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后立即取材。取每組6只大鼠腹腔注射麻醉后開(kāi)胸，暴露心臟，用灌注針從左心室心尖部插入直至主動(dòng)脈，灌注生理鹽水約240 mL后灌注4%多聚甲醛溶液約280 mL，取出損傷脊髓節(jié)段，約長(zhǎng)1 cm，放入4%多聚甲醛溶液中固定，隨后進(jìn)行脫水，石蠟包埋，切片，厚4 μm，用于HE染色和免疫組化。取剩余每組大鼠6只，麻醉后剪下?lián)p傷脊髓節(jié)段，放于液氮中，后保存于-80 ℃冰箱待蛋白檢測(cè)。

1.5.3 HE染色法觀察大鼠脊髓形態(tài)變化 將制備好的石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化后浸入蘇木素染色液5 min，純水沖洗后浸入伊紅染色液1 min，再洗，鏡下觀察著色情況，必要時(shí)加入0.5%鹽酸乙醇1～2 s，中性樹膠封片。采用400×光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠脊髓組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.5.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)損傷脊髓BDNF、TrkB和p75NTR陽(yáng)性表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化后行抗原修復(fù)，滴加3%過(guò)氧化物酶阻斷液浸泡10 min，滴加 150 μL一抗(BDNF1∶500,TrkB1∶250,P75NTR1∶250)，4 ℃過(guò)夜；滴加反應(yīng)增強(qiáng)液150 μL 10 min，滴加150 μL酶標(biāo)抗兔IgG聚合物10 min，避光條件下滴加DAB顯色液反應(yīng)5 min，自來(lái)水沖洗10 min。蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗浸泡，脫水，透明，中性樹膠封片，400×光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5.5 Western blot法檢測(cè)損傷脊髓BDNF、TrkB和p75NTR蛋白表達(dá) 取損傷脊髓組織80 mg，加200 μL RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)后勻漿，提取蛋白。計(jì)算樣品蛋白濃度，金屬浴95 ℃變性10 min。制備SDS-PAGE凝膠，上樣、電泳和轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，4 ℃過(guò)夜孵育一抗(rabbit anti-GAPDH 1∶1 000，BDNF 1∶1 000，TrkB 1∶1 000,P75NTR1∶1 000)；洗膜，孵育二抗。均勻滴加ECL超敏化學(xué)發(fā)光液，于ECL成像系統(tǒng)曝光拍照，定量分析各蛋白條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 BBB評(píng)分法評(píng)估大鼠后肢運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能

空白組與假手術(shù)組大鼠后肢功能正常，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，排除手術(shù)對(duì)于模型的影響；與空白組比較，1 d、7 d模型組BBB評(píng)分均顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；1 d時(shí)：各組BBB評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；7 d時(shí)：與模型組和經(jīng)顱磁刺激組比較，電針組和聯(lián)合組BBB評(píng)分顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與電針組比較，聯(lián)合組BBB評(píng)分顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠干預(yù)后不同時(shí)間BBB評(píng)分比較

2.2 各組大鼠脊髓HE染色

在HE染色中，圖像細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色淡染，細(xì)胞核呈藍(lán)色深染?？瞻捉M和假手術(shù)組大鼠脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，核仁清晰。組織結(jié)構(gòu)排列緊密，未見(jiàn)空洞、出血等。干預(yù)1 d，模型組可見(jiàn)脊髓組織結(jié)構(gòu)被破壞，組織壞死，細(xì)胞皺縮，灰、白質(zhì)分界不清，中央管結(jié)構(gòu)紊亂，白質(zhì)神經(jīng)纖維腫脹增粗，排列紊亂，灰質(zhì)內(nèi)紅細(xì)胞大量聚集，細(xì)胞間質(zhì)水腫，細(xì)胞核固縮、破碎等，并可見(jiàn)明顯的空泡。電針組、經(jīng)顱磁刺激組、聯(lián)合組與模型組病理改變相似；干預(yù)7 d，模型組可見(jiàn)白質(zhì)與灰質(zhì)的邊界仍然模糊不清，內(nèi)有固縮、破碎的細(xì)胞核,白質(zhì)神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)腫脹明顯，灰質(zhì)內(nèi)出血減少。電針組、聯(lián)合組較模型組組織結(jié)構(gòu)更加完整，空洞減少，可觀察到更多結(jié)構(gòu)正常細(xì)胞，整體修復(fù)情況優(yōu)于模型組。見(jiàn)圖1。

2.3 各組大鼠脊髓BDNF表達(dá)比較

脊髓經(jīng)免疫組織化學(xué)法染色，BDNF免疫陽(yáng)性產(chǎn)物主要在脊髓組織的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中表達(dá)，以胞漿著色為主，呈現(xiàn)棕黃色的，空白組和假手術(shù)組中可見(jiàn)分布于胞漿的棕黃色小顆粒?？瞻捉M與假手術(shù)組BDNF蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與空白組比較，1 d、7 d模型組BDNF蛋白表達(dá)均顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；1 d時(shí):各組BDNF蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；7 d時(shí)：與模型組和經(jīng)顱磁刺激組比較，電針組和聯(lián)合組大鼠脊髓組織中BDNF蛋白表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與電針組比較，聯(lián)合組大鼠脊髓組織中BDNF蛋白表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

表2 各組大鼠干預(yù)后損傷脊髓組織BDNF陽(yáng)性表達(dá)比較

Western blot法檢測(cè)顯示，空白組與假手術(shù)組BDNF蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與空白組比較，1 d、7 d模型組BDNF蛋白表達(dá)均顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；1 d時(shí):各組BDNF蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；7 d時(shí)：與模型組比較，經(jīng)顱磁刺激組BDNF蛋白表達(dá)微升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與模型組和經(jīng)顱磁刺激組比較，電針組和聯(lián)合組大鼠脊髓組織中BDNF蛋白表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與電針組比較，聯(lián)合組大鼠脊髓組織中BDNF蛋白表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表3。

表3 各組大鼠干預(yù)后損傷脊髓組織BDNF蛋白表達(dá)比較

2.4 各組大鼠脊髓TrkB表達(dá)比較

脊髓經(jīng)免疫組織化學(xué)法染色，TrkB免疫陽(yáng)性產(chǎn)物主要在脊髓組織的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中表達(dá)，主要集中在胞膜、胞質(zhì)，呈現(xiàn)棕黃色，空白組與假手術(shù)組中可見(jiàn)分布于胞膜、胞質(zhì)的棕黃色小顆粒?？瞻捉M與假手術(shù)組TrkB蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與空白組比較，1 d、7 d模型組TrkB蛋白表達(dá)量均顯著變化，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；1 d時(shí)：各組TrkB蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；7 d時(shí)：與模型組與經(jīng)顱磁刺激組比較，電針組和聯(lián)合組TrkB蛋白表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與電針組比較，聯(lián)合組TrkB蛋白表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4、表4。

表4 各組大鼠干預(yù)后損傷脊髓組織TrkB陽(yáng)性表達(dá)比較

Western blot法檢測(cè)顯示，空白組與假手術(shù)組TrkB蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與空白組比較，1 d、7 d模型組TrkB蛋白表達(dá)量均顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；1 d時(shí)：各組TrkB蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；7 d時(shí)：與模型組和經(jīng)顱磁刺激組比較，電針組和聯(lián)合組TrkB蛋白表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與電針組比較，聯(lián)合組TrkB蛋白表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5、表5。

表5 各組大鼠干預(yù)后損傷脊髓組織TrkB蛋白表達(dá)比較

2.5 各組大鼠脊髓p75NTR表達(dá)比較

p75NTR的免疫陽(yáng)性產(chǎn)物主要在脊髓組織的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中表達(dá)，其亞細(xì)胞定位主要位于陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿，呈現(xiàn)棕黃色?？瞻捉M與假手術(shù)組p75NTR基本不表達(dá)或表達(dá)較少，當(dāng)受到刺激或應(yīng)激狀態(tài)下被誘導(dǎo)進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡?？瞻捉M與假手術(shù)組p75NTR蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與空白組比較，1 d、7 d模型組p75NTR蛋白表達(dá)量均顯著上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；1 d時(shí)：各組p75NTR蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；7 d時(shí)：與模型組和經(jīng)顱磁刺激組比較，電針組與聯(lián)合組p75NTR蛋白表達(dá)顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與電針組比較，聯(lián)合組p75NTR蛋白表達(dá)顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖6、表6。

表6 各組大鼠干預(yù)后損傷脊髓組織p75NTR陽(yáng)性表達(dá)比較

Western blot法檢測(cè)顯示，空白組與假手術(shù)組p75NTR蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與空白組比較，1 d、7 d模型組p75NTR蛋白表達(dá)量均顯著上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；1 d時(shí)：各組p75NTR蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；7 d時(shí)：與模型組比較，電針組和聯(lián)合組p75NTR蛋白表達(dá)顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與經(jīng)顱磁刺激組比較，聯(lián)合組p75NTR蛋白表達(dá)顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖7、表7。

表7 各組大鼠干預(yù)后損傷脊髓組織p75NTR蛋白表達(dá)比較

3 討論

BDNF是1982年Barde等從豬腦中分離出的一種神經(jīng)元存活誘導(dǎo)因子[15]。在治療脊髓損傷中作為細(xì)胞存活和神經(jīng)突起生長(zhǎng)促進(jìn)劑具有非常大的潛力作用[16]。BDNF在脊髓損傷中發(fā)揮作用的途徑主要是通過(guò)相應(yīng)受體結(jié)合來(lái)激活細(xì)胞內(nèi)多種下游信號(hào)通路[17]。TrkB是BDNF具有高親和力的特異性受體(酪氨酸激酶受體)[18]。BDNF誘導(dǎo)的TrkB信號(hào)可能通過(guò)經(jīng)磷脂酰-3激酶( P1-3K ) /Akt通路、Ras/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)途徑、磷脂酶C-γ( PLC-γ) /3-磷酸肌醇(IP-3)通路和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的磷酸化等途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)的軸突生長(zhǎng)以及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改善[19-22]。另一方面，BDNF與p75NTR結(jié)合可以通過(guò)激活p53來(lái)激活Jun N末端(JNK)激酶，觸發(fā)細(xì)胞死亡，通過(guò)JNK非依賴性機(jī)制觸發(fā)促凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[23-24]。

《靈樞·寒熱病》關(guān)于“體惰”的描述:“身有所傷血出多，及中風(fēng)寒，若有所墮墜，四肢懈惰不收，名曰體惰?！迸c現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于脊髓損傷的描述極為相似。《難經(jīng)·二十八難》云:“督脈者，起于下極之俞，并于脊里，上至風(fēng)府，入屬于腦?！倍矫}與脊髓并行于脊柱之中，傷其脊骨是表象，損其督脈是實(shí)質(zhì)，故脊髓病變當(dāng)求治于督脈[25]。督脈電針治療脊髓損傷能夠促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)、功能的恢復(fù)和抑制細(xì)胞凋亡因子等[26]。馮紅霞等[27]發(fā)現(xiàn)電針“大椎”“命門”穴結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練能改善不完全性脊髓損傷的感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)功能,效果優(yōu)于單純的康復(fù)訓(xùn)練。經(jīng)顱磁刺激(TMS)技術(shù)是1985年由Barker及其助手創(chuàng)立的，其原理是利用交變磁場(chǎng)產(chǎn)生的感應(yīng)電流，對(duì)運(yùn)動(dòng)皮層產(chǎn)生電流刺激，同時(shí)對(duì)于運(yùn)動(dòng)皮層誘發(fā)電位作出相應(yīng)記錄[28]。重復(fù)經(jīng)顱磁刺激治療脊髓損傷的可能機(jī)制有：TMS刺激大腦皮層激活上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，進(jìn)而誘發(fā)神經(jīng)沖動(dòng)在皮質(zhì)脊髓束傳導(dǎo)；TMS能夠直接刺激中樞神經(jīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)大腦皮層的重塑，刺激運(yùn)動(dòng)通路，進(jìn)一步增強(qiáng)癱瘓肢體的功能[29]。Hoffman采用經(jīng)顱磁刺激對(duì)四肢癱瘓的患者進(jìn)行了為期3周的實(shí)驗(yàn)，研究表明患者運(yùn)動(dòng)皮層的投射面積增加，說(shuō)明經(jīng)顱磁刺激可以誘發(fā)皮層功能改變[30]。臨床研究發(fā)現(xiàn),rTMS可以改善患者的呼吸、消化和運(yùn)動(dòng)功能，具有鎮(zhèn)痛的作用[31-34]。電針和經(jīng)顱磁刺激一樣都具有安全可靠、無(wú)痛、無(wú)創(chuàng)、操作便捷和可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)選取1 d和7 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，希望更好地觀察脊髓損傷后大鼠行為學(xué)及其各項(xiàng)生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)在急性期1 d的變化，以及隨著干預(yù)次數(shù)和時(shí)間的增加，在脊髓損傷反應(yīng)期7 d的指標(biāo)變化和電針組、重復(fù)經(jīng)顱磁刺激組和聯(lián)合組的效果對(duì)比。結(jié)果表明1 d時(shí)相較于模型組，電針組、重復(fù)經(jīng)顱磁刺激組和聯(lián)合組對(duì)比大鼠行為學(xué)及其各生物學(xué)檢查指標(biāo)的效果差異不明顯，而在7 d時(shí)電針組和聯(lián)合組的結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，重復(fù)經(jīng)顱磁刺激組也有所提高，這與前期研究相一致[35-36]。通過(guò)1 d和7 d比較可知,首先大鼠自身具有一定的自愈能力。而進(jìn)行督脈電針、重復(fù)經(jīng)顱磁刺激或是兩者的聯(lián)合治療能加速它的恢復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)BBB評(píng)分，對(duì)脊髓損傷大鼠后肢功能進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)，可知在7 d的時(shí)間點(diǎn)時(shí)，各干預(yù)組大鼠后肢功能相較于模型組評(píng)分有所提高，電針組和聯(lián)合組有顯著改善，說(shuō)明其可以改善脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能損傷癥狀，重復(fù)經(jīng)顱磁刺激組的改善不顯著，但具有一定的上升趨勢(shì)，在下一步的研究中可以延長(zhǎng)干預(yù)時(shí)間，觀察重復(fù)經(jīng)顱磁刺激在脊髓損傷恢復(fù)期。HE染色觀察脊髓也能看到在7 d的時(shí)間點(diǎn)時(shí)，神經(jīng)元邊緣開(kāi)始清晰，出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞的增生,但是脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)邊界仍不清晰，損傷部位組織結(jié)構(gòu)致密程度有所改善。但相對(duì)于正常大鼠水平，仍有一定的差距。免疫組織化學(xué)法和Western blot法的檢查結(jié)果基本一致。在7 d的時(shí)間點(diǎn)時(shí)，可見(jiàn)在對(duì)BDNF、TrkB及p75NTR的蛋白表達(dá)影響方面，聯(lián)合組的效果優(yōu)于電針組;電針組的效果優(yōu)于重復(fù)經(jīng)顱磁刺激組和模型組；重復(fù)經(jīng)顱磁刺激組與模型組比較，效果不顯著。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)觀察電針聯(lián)合重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對(duì)脊髓損傷大鼠BDNF及其受體TrkB和p75NTR表達(dá)的影響，探討單純電針或重復(fù)經(jīng)顱磁刺激在脊髓損傷中發(fā)揮的作用，以及聯(lián)合治療是否能夠比單純電針或重復(fù)經(jīng)顱磁刺激在該實(shí)驗(yàn)中效果更好。結(jié)果表明電針相對(duì)單純經(jīng)顱磁刺激在大鼠脊髓損傷的反應(yīng)期效果更好，聯(lián)合治療對(duì)比單純電針的效果更顯著。說(shuō)明督脈電針聯(lián)合重復(fù)經(jīng)顱磁刺激可改善脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能損傷癥狀，促進(jìn)受損脊髓的出血減少、神經(jīng)元再生，其機(jī)制可能與上調(diào)激素中BDNF及TrkB以及下調(diào)p75NTR的表達(dá)有關(guān)。