鄧 茹,楊 強,周 鋒,王 強,孫子昕,雷正權(quán)

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬三二〇一醫(yī)院，陜西 西安 710000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 711300；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽 711300)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)是神經(jīng)外科常見急癥之一，隨著現(xiàn)在醫(yī)療技術(shù)的突飛猛進，其死亡率和致殘率較以前有所下降，但蛛網(wǎng)膜下腔出血后患者長期存在的認知功能障礙卻往往容易被人們忽視，其主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶受損、執(zhí)行功能發(fā)生障礙和注意力控制效率低下等；據(jù)調(diào)查，在全球范圍內(nèi)，每年將近有500多萬人患有SAH，雖經(jīng)及時治療可挽救一些生命，但仍有46%～60%的SAH患者在治愈后會出現(xiàn)認知功能低下的情況[1-2]，伴隨著生活節(jié)奏的逐漸加快，SAH的發(fā)病率呈上升趨勢，目前也尚未發(fā)現(xiàn)治療該病的特效藥物及方法[3-4]。蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦神經(jīng)細胞的生理病理變化過程較為復(fù)雜，包括顱內(nèi)壓和腦血流灌注異常、血腦屏障受損、氧化應(yīng)激損傷、神經(jīng)細胞凋亡及炎癥反應(yīng)等[5-7]，對其相關(guān)機制的進一步研究及尋找行之有效的治療方法是目前神經(jīng)系統(tǒng)研究的重點和熱點。本課題組團隊早期研究證實[8-10],“嗅三針”對改善大鼠認知功能方面具有一定的潛能，能夠延緩認知狀態(tài)的進展，促進神經(jīng)功能恢復(fù)。本研究通過行為學(xué)檢測干預(yù)效果，觀察海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)變化、海馬區(qū)凋亡相關(guān)蛋白糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表達，以探討“嗅三針”干預(yù)對蛛網(wǎng)膜下腔出血后認知障礙(SAH CI)大鼠保護的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

成年雄性SD大鼠32只,體質(zhì)量225～265 g，SPF級,皆從成都達碩實驗中心購買，許可證編號：SCXK(川)2020-030，在陜西省針藥結(jié)合中心重點實驗室飼養(yǎng)，實驗飼養(yǎng)條件:溫度(22±2)℃，濕度50%～60%，該實驗嚴格遵守實驗動物管理和保護規(guī)則。應(yīng)用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為4組:空白組、假手術(shù)組、模型組與嗅三針組,每組8只。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 儀器 Western電泳儀(美國Bio-Rad公司伯樂1645050);酶標儀(Molecular Devices公司Spectra MAX5);低溫高速離心機(德國Hettich公司Mikro185);組織全自動脫水機、石蠟包埋機和組織切片機(科迪儀器設(shè)備有限公司KD-TS3A,KD-BM.KD-2268);Morris水迷宮測試系統(tǒng)(諾達思信息技術(shù)有限責(zé)任公司W(wǎng)ater-Maze);電針治療儀(上海華誼公司G6805-2A)。

1.2.2 試劑 Caspase-3抗體(美國abcam EPR18297);GSK-3β抗體(美國abcam 3D10);β-Actin抗體(北京康為世紀CW0096M);高效RIPA裂解液(北京索萊寶科技公司R0010);山羊抗鼠lgG(H+L)(北京天德悅生物科技有限公司S001F);山羊抗兔lgG(H+L)(北京天德悅生物科技有限公司S004F);蘇木-伊紅染色試劑盒(北京索萊寶科技公司G1120);SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司AR0138);Bradford蛋白濃度測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司AR0145);ECL化學(xué)發(fā)光底物(廣州賽國生物科技有限公司W(wǎng)BKLS0100)。

1.3 模型制備與評定方法

模型組、嗅三針組采用枕大池注血法[11]制備蛛網(wǎng)膜下腔出血后認知障礙大鼠模型。造模前大鼠禁食12 h,以10%的水合氯醛(0.32 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，剔除大鼠頭部及左側(cè)股動脈部位的鼠毛，用碘酒常規(guī)消毒后，取大鼠俯臥位，以枕外隆凸為中點取約1 cm的直切口，緩慢分離皮下筋膜，暴露頸夾肌間隙，顯微剪稍分離，暴露枕骨脊間隙后；將大鼠改仰臥位，股動脈區(qū)常規(guī)消毒，沿股動脈走行切開皮膚，仔細分離出股動脈，用1 mL注射器抽取股動脈血0.3～0.4 mL，無菌棉球壓迫止血后，改俯臥位，使頭部與身體成大約135 °，注射器進針時與身體平行，從枕骨大孔處刺破環(huán)枕筋膜，有透空感后緩慢推進至枕大池處，將血液在2 min內(nèi)注入枕大池，俯臥位使其頭低30°保持20 min，使血液分布于基底動脈周圍。完成后縫合頭部及股部切口，待蘇醒后放入單籠常規(guī)喂養(yǎng)，并連續(xù)3 d予以常規(guī)抗感染干預(yù)(腹腔注射硫酸慶大霉素0.5 mg/100 g)。假手術(shù)組大鼠僅切開頭部和股部皮膚，然后縫合，具體手術(shù)方法同制備以上模型；空白組常規(guī)喂養(yǎng)，不做任何處理。

蛛網(wǎng)膜下腔出血后認知障礙模型大鼠造模成功的標準[12]：以空白組大鼠定位航行實驗逃避潛伏期的平均值作為參考值，計算造模大鼠逃避潛伏期平均值與參考值之差占該鼠平均逃避潛伏期的比值，若該值>20%，則認為蛛網(wǎng)膜下腔出血后認知障礙模型大鼠造模成功。

1.4 干預(yù)方法

假手術(shù)組、模型組于相同時間采用與嗅三針組相同方法抓取、固定，空白組不予干預(yù)。

嗅三針組在造模成功后第1天開始進行電針干預(yù)，依據(jù)《實驗針灸學(xué)》動物選穴標準[13]，取“印堂”、雙側(cè)“迎香”。將大鼠固定于大鼠固定架上，常規(guī)消毒后，選用0.25 mm×25 mm華佗牌不銹鋼針，迎香穴向內(nèi)上方斜刺0.3 cm，印堂穴向鼻根部平刺0.3 cm，針刺完后，連接G6805-2A型電針治療儀，選用0.5～2 mA疏密波,頻率為2～15 Hz,印堂穴接正極，一側(cè)迎香穴接負極，10 min后，換另一側(cè)迎香穴接負極，再給予10 min電針刺激，1次/d，連續(xù)針刺10 d。

1.5 行為學(xué)檢測

本實驗的行為學(xué)主要采用Morris水迷宮測試[14-15]，分別在各組大鼠造模前和造模結(jié)束后第11天，及針刺干預(yù)結(jié)束后第1天起，借助Morris水迷宮實驗通過定位航行實驗和空間探索實驗記錄各組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)，對數(shù)據(jù)進行分析，評估大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；該實驗用的游泳水池是直徑為120 cm、高為50 cm及水深22 cm的圓形水池和直徑為10 cm、高為20 cm的圓形平臺，平臺可隨意放置任何一象限，平臺沒于水下2 cm左右，池壁上4個等距離點將水池平均分為4個象限，池壁外標有4個入水點，水池外圍柱子有不同的標記物，整個實驗過程中要保持周圍參照物環(huán)境不變，光照適宜，水溫控制在22～25 ℃，由于實驗所用SD大鼠均為白色，為保證攝像系統(tǒng)的定位跟蹤和圖像采集，在水池中加入黑色食用色素混勻。實驗開始前對實驗室和水迷宮的環(huán)境進行檢查和調(diào)試，并對大鼠進行適應(yīng)性訓(xùn)練，使大鼠適應(yīng)水迷宮環(huán)境，減小影響實驗出現(xiàn)誤差的可能，同時使大鼠達到成模指標，剔除認知極差的大鼠。

1.5.1 適應(yīng)性訓(xùn)練 在任一象限圓形平臺對側(cè)象限的中點，將大鼠頭部面向池壁放入水中，觀察大鼠的游泳速度及能否找到圓形平臺且爬上平臺，適應(yīng)性訓(xùn)練實驗時長為120 s，若大鼠在規(guī)定時長內(nèi)沒有找到圓形平臺，實驗員將放置在平臺并記錄10 s，結(jié)束后將大鼠放置在吸水毛毯上，擦干毛后放入鼠籠中，按以上方法每只大鼠連續(xù)訓(xùn)練3 d，在3 d內(nèi)，如果大鼠游泳速度比其他大鼠較慢或者完全不會游泳,則作標記后剔除實驗。適應(yīng)性訓(xùn)練的數(shù)據(jù)不計為實驗結(jié)果。

1.5.2 定位航行實驗 定位航行實驗，連續(xù)進行5 d，每天固定時間段進行訓(xùn)練，每只大鼠實驗4次/d，記錄大鼠120 s內(nèi)尋找平臺的時間，即逃避潛伏期，隨機將圓形平臺放置在任一象限的中央位置中，第1天將大鼠按順時針方向依次由E、S、W、N共4個入水點順序，頭朝向池壁放入水中，后4 d逆時針調(diào)整更換入水位置。如果大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺，將引導(dǎo)其上臺并停留10 s，并將其逃避潛伏期記錄為120 s。每只大鼠每4次入水實驗間隔時間為15～20 min，每次測試完后，用干毛巾將大鼠身上的水擦干后放入干凈鼠籠中。實驗結(jié)束后，以5 d大鼠逃避潛伏期的平均值作為實驗數(shù)據(jù)。

1.5.3 空間探索實驗 空間探索實驗是在每次連續(xù)5 d的定位航行實驗結(jié)束后，第6天開始進行，實驗中不安裝圓形平臺，將原平臺的所在象限作為目標象限，選取剩余3個象限為入水點，將大鼠面朝池壁緩慢放入水中，觀察并記錄大鼠在60 s內(nèi)穿越原平臺次數(shù)的數(shù)據(jù)。

1.6 組織取材及指標檢測

1.6.1 組織取材 最后1次行為學(xué)檢測結(jié)束后立即取材。每組隨機選取4只大鼠，采用10%水合氯醛(0.32 mL/100 g)腹腔麻醉大鼠后，開胸，暴露心臟，灌注冰生理鹽水和4%多聚甲醛磷酸緩沖液后，快速剝離腦組織后放入裝有冰4%多聚甲醛的EP管中固定24 h后常規(guī)脫水、石蠟包埋制作切片(厚度為4 μm)；余下大鼠麻醉后，快速斷頭，剝離腦組織，在冰盒上快速分離雙側(cè)海馬組織，裝入 EP 管中，即時放入液氮內(nèi)，標記好放入-80 ℃冰箱待蛋白檢測。

1.6.2 HE染色法觀察大鼠腦組織形態(tài)變化 將制備好的石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化后浸入蘇木素染色液中 5 min，純水沖洗后3 min，分化液分化30 s,浸入伊紅染色液1 min，自來水浸泡3 min，鏡下觀察著色情況，再進行脫水、透明，然后中性樹膠封固，200×光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6.3 Western blot法檢測海馬組織GSK-3β、Caspase-3蛋白表達 取海馬組織60 mg，加600 μL RIPA 裂解液(含蛋白酶抑制劑)后在冰上勻漿，提取蛋白。然后計算樣品的蛋白濃度，金屬浴 95 ℃變性10 min。制10%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣、電泳、根據(jù)β-actin、GSK-3β及Caspase-3的分子量分別在膠上相應(yīng)位置取切。轉(zhuǎn)膜1.5 h后，5%脫脂奶粉封閉2 h，4 ℃過夜孵育一抗(β-actin 1∶5 000，GSK-3β1∶3 000，Caspase-3 1∶1 000)；1×TBST洗膜3次×10 min，孵育二抗(羊抗鼠IgG 1∶3 000，羊抗兔 IgG 1∶5 000)1.5 h。洗膜3次×10 min,用移液器均勻滴加ECL超敏化學(xué)發(fā)光液(1∶1比例配置)，在ECL成像系統(tǒng)下曝光成像并拍照，定量分析各蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較

2.1.1 各組大鼠定位航行實驗逃避潛伏期比較 造模前各組大鼠定位航行實驗的逃避潛伏期比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后與造模前比較，假手術(shù)組逃避潛伏期無明顯變化(P>0.05)，模型組和嗅三針組逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)。經(jīng)干預(yù)10 d后，嗅三針組逃避潛伏期較造模后縮短(P<0.01)；模型組較造模后無明顯變化(P>0.05)。治療后，與模型組比較，嗅三針組逃避潛伏期明顯縮短，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠不同時間點逃避潛伏期結(jié)果

2.1.2 各組大鼠空間探索實驗穿越原平臺次數(shù)比較 造模前各組大鼠穿越平臺次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后與造模前比較，假手術(shù)組穿越平臺次數(shù)無明顯變化(P>0.05)，模型組和嗅三針組穿越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.01)。干預(yù)10 d后，嗅三針組穿越平臺次數(shù)較造模后增多(P<0.05);治療后，與模型組比較，嗅三針組穿越平臺次數(shù)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠不同時間點穿越平臺次數(shù)結(jié)果

2.2 HE染色檢測大鼠海馬組織的形態(tài)變化

空白組及假手術(shù)組大鼠海馬HE染色可見CA1區(qū)神經(jīng)元細胞排列緊密，輪廓清楚，形態(tài)較規(guī)則，能夠較清楚看見胞核和胞質(zhì)，無細胞壞死；模型組神經(jīng)元細胞排列紊亂，有壞死空洞區(qū)，細胞間隙變大,細胞形態(tài)受損，出現(xiàn)了細胞核固縮變形、細胞碎裂的現(xiàn)象；嗅三針組細胞形態(tài)較模型組有所改善，胞核形態(tài)基本正常, 細胞疏松情況減輕，損傷部位得到修復(fù)。見圖1。

2.3 各組海馬組織 GSK-3β蛋白表達比較

通過Image J 軟件對蛋白條帶的平均灰度值進行分析得出：空白組和假手術(shù)組均有一定量的GSK-3β蛋白表達，但兩組大鼠的蛋白相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示僅切開頭顱皮膚對大鼠海馬區(qū)的GSK-3β蛋白表達影響不明顯；與假手術(shù)組和空白組相比，模型組及嗅三針組的蛋白條帶變寬、蛋白表達量明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比，嗅三針組的GSK-3β蛋白條帶變窄、表達量明顯減少(P<0.05)，提示嗅三針干預(yù)后能夠有效抑制SAH CI大鼠海馬GSK-3β的表達。見圖2、表3。

2.4 各組海馬組織Caspase-3蛋白表達比較

通過Image J軟件對蛋白條帶的平均灰度值進行分析得出：空白組、假手術(shù)組的Caspase-3蛋白表達量相當，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);在造模后，模型組和嗅三針組的Caspase-3蛋白表達量明顯增多，與空白組和假手術(shù)組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);在針刺干預(yù)后，嗅三針組的Caspase-3蛋白表達量與模型組比較，明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表3。

表3 各組大鼠GSK-3β、Caspase-3蛋白表達比較

3 討論

蛛網(wǎng)膜下腔出血是一種高發(fā)病率、高死亡率的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其發(fā)病后長期存在的認知障礙更嚴重威脅患者的生活質(zhì)量及生存時間，大部分患者由于缺乏對該類疾病的認識，從而錯過最佳的診療時間，使其病情更加惡化，發(fā)展為癡呆，導(dǎo)致各種意外的發(fā)生。因此對于蛛網(wǎng)膜下腔出血后認知障礙修復(fù)的機制迫在眉睫?，F(xiàn)代研究證實[14-15]，海馬神經(jīng)元的凋亡是引起SAH后認知障礙的重要機制學(xué)說之一，是其核心環(huán)節(jié)。神經(jīng)細胞死亡的主要原因是機體受到創(chuàng)傷后，細胞膜功能嚴重受損，離子轉(zhuǎn)運功能發(fā)生障礙，造成線粒體功能障礙，能量生成減少，引起機體內(nèi)源性和外源性凋亡途徑聯(lián)系起來共同觸發(fā)凋亡信號，啟動凋亡程序，從而加速細胞凋亡。有研究指出[14],SAH發(fā)生后由于血液迅速擴散至整個蛛網(wǎng)膜下腔，導(dǎo)致海馬區(qū)持續(xù)的微循環(huán)障礙及局部腦組織的缺血缺氧等繼發(fā)性損傷導(dǎo)致細胞凋亡，從而引發(fā)認知障礙。

GSK-3β是一種具有多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與多種信號途徑，在神經(jīng)細胞、心肌細胞和腫瘤細胞等不同類型細胞及多種器官中起到促凋亡的作用，主要是由于GSK-3β活性的異常調(diào)節(jié)促進了許多蛋白的磷酸化，最終被細胞內(nèi)的蛋白酶體系統(tǒng)降解，導(dǎo)致細胞凋亡[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)[18-19]，GSK-3β在大腦皮層和海馬中廣泛表達,參與突觸可塑性和記憶形成的控制，在學(xué)習(xí)、記憶和執(zhí)行等認知能力的調(diào)節(jié)中具有重要功能，GSK-3β活性的增強，加快了海馬神經(jīng)元凋亡的速度，從而導(dǎo)致多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。GSK-3β作為細胞凋亡的上游因子，被激活后可進一步激活Caspase家族、bax及c-jun等與凋亡相關(guān)的蛋白激酶，引起一系列的酶鏈反應(yīng)，最終加快細胞凋亡的速度。Caspases-3是Caspases家族中的代表性蛋白，位于細胞凋亡的下游，是介導(dǎo)細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，目前研究已將Caspase-3定為神經(jīng)元程序性死亡的核心介質(zhì)。在神經(jīng)退行性疾病過程中,GSK-3β活化可上調(diào)多巴胺能神經(jīng)內(nèi)Caspase-3含量,從而導(dǎo)致細胞凋亡的發(fā)生[5]。在腦缺血對神經(jīng)細胞凋亡影響的研究中，凋亡蛋白GSK-3β和Caspase-3的陽性表達呈正相關(guān)[20]。

嗅覺功能與腦神經(jīng)功能關(guān)系密切，嗅覺是人體最重要的感覺功能之一,其中樞位于海馬區(qū),而海馬區(qū)又是與人體學(xué)習(xí)記憶等認知功能聯(lián)系密切的中樞部位；研究表明[21]，通過針刺“嗅三針”可引起嗅覺通路的興奮,從而改善海馬區(qū)的功能,達到醒腦開竅、益智聰神和防治癡呆的效果；“嗅三針”是以雙側(cè)迎香穴為主穴，印堂為配穴，常規(guī)針刺后予以電針刺激的一組穴位，因均能治療與嗅覺功能障礙相關(guān)的疾病,故命名為“嗅三針”，是由劉智斌教授經(jīng)過多年臨床研究，基于“感知一體,嗅腦同治”的學(xué)術(shù)思想所創(chuàng)立的一種特色針法，在治療阿爾茲海默病、癡呆等方面已取得明確的療效。迎香穴，為手陽明大腸經(jīng)腧穴，有通利鼻竅的效果，故主治與鼻有關(guān)的疾患，正如《針灸大全》中關(guān)于此穴云:“鼻塞不聞香臭取迎香”。印堂歸屬督脈,督脈“入絡(luò)腦”，可醒腦開竅、通鼻竅,故印堂穴不僅可以治療鼻淵、鼻衄與嗅覺障礙等疾病,還可以治療督脈循行遠部的腦病,如癡呆病、癲狂病等神志疾病。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)“嗅三針”干預(yù)后，SAH CI大鼠水迷宮的平均逃避潛伏期較模型組明顯縮短，穿越平臺次數(shù)增多；海馬細胞形態(tài)正常，僅有少量的細胞疏松情況，損傷部位得到了一定的修復(fù)；海馬中GSK-3β和Caspase-3蛋白相對表達量降低。本研究結(jié)果提示“嗅三針”對改善SAH CI具有一定的治療作用，且該治療作用可能是通過抑制凋亡相關(guān)蛋白GSK-3β和Caspase-3的表達量，進而改善認知功能，該作用機制可能是“嗅三針”改善認知障礙的重要環(huán)節(jié)。

關(guān)于細胞凋亡的詳細機制研究，本課題組將在后續(xù)研究中進一步探討，為“嗅三針”在SAH CI 治療中的應(yīng)用提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。