江美彥 周楊 劉仁浪 姚菲 楊云舒 侯凱 馮冬菊 吳衛(wèi)

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130）

中藥白芷為傘形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch. ex Hoffm.）Benth. et Hook. f.或杭白芷Angelica dahurica（Fisch. ex Hoffm.）Benth. et Hook. f. var.formosana（Boiss.）Shan et Yuan的干燥根。白芷為藥食兩用藥材，主要含揮發(fā)油類、香豆素類、氨基酸類等多種活性成分，在臨床上常用于治療各種類型的疼痛癥狀，在食品、化工、香料等多個方面也有應(yīng)用。市場上主要以川白芷、杭白芷、禹白芷和祁白芷4種作為主流商品藥材［1-3］。而在白芷的道地產(chǎn)區(qū)四川遂寧，存在白芷早期抽薹、化肥農(nóng)藥不合理施用等問題，導(dǎo)致白芷藥材產(chǎn)量和品質(zhì)下降［4-5］。目前，為解決此類問題，在白芷播種、化肥配施、采收加工等方面已有大量研究［6-8］，但有關(guān)白芷根際促生細(xì)菌的研究尚未見報道。

植物根際是土壤微生物最活躍的區(qū)域，包含古細(xì)菌、細(xì)菌、病毒、真菌、線蟲等多種類群，其中細(xì)菌是最豐富的類群之一。植物根際促生菌（PGPR）即指非致病的有益的根際細(xì)菌［9］，PGPR能夠在植物根際產(chǎn)生和分泌各種調(diào)節(jié)化學(xué)物質(zhì)，或者抑制植物病原體和其他有害微生物，直接或間接地影響植物生長發(fā)育，從而起到促進(jìn)植物生長、提高作物產(chǎn)量、防治植物病害等作用［9-12］。PGPR具有環(huán)保、安全、有效等特點，同時具有改善土壤結(jié)構(gòu)、提升作物產(chǎn)量和品質(zhì)等方面的潛力［13-14］。

土壤N、P、K配比情況對白芷早抽薹、產(chǎn)量和質(zhì)量均有影響，植物PGPR分泌的鐵載體和IAA對植物也有一定的促生作用［15-17］。本試驗以種植于四川遂寧的白芷品種BZA001和品系BZB003根際土壤為材料，分離篩選出川白芷根際促生細(xì)菌，通過盆栽試驗進(jìn)一步驗證所篩促生細(xì)菌對白芷的促生效果，挖掘白芷根際細(xì)菌潛力，為白芷高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)種植提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

5份種植于四川遂寧涪江流域不同地點的兩種白芷的根際土壤，分別為四川省遂寧市船山區(qū)順江村（XA）、順河村（XB）、遂寧市射洪市桑樹林村（XC）和遂寧市蓬溪縣永益村（XD）的白芷品種BZA001根際土壤，及遂寧市蓬溪縣永益村種植的白芷品系BZB003的根際土壤（XI）。BZA001和BZB003均為課題組多年來選育的遺傳穩(wěn)定的川白芷品種（系），BZA001已于2012年審定為“川芷2號”白芷品種。

1.2 方法

1.2.1 白芷根際細(xì)菌的分離純化 采用五點法及抖根法挖取白芷根系，抖掉根系多余的土，用刷子輕輕刷下根系表面的土收集作為試驗材料。將各根際土樣過孔徑2 mm的篩后，參照楊茉等［18］的方法分離純化根際細(xì)菌，以“來源+數(shù)字”的格式命名，置4℃冰箱存放。

1.2.2 促生細(xì)菌的篩選 固氮、溶磷、解鉀細(xì)菌的篩選參照王明歡等［19］方法，接種細(xì)菌于固氮、無機(jī)磷、解鉀培養(yǎng)基上，通過菌株在選擇培養(yǎng)基上的生長情況和有無透明圈來判斷菌株有無固氮、溶磷、解鉀活性。

產(chǎn)鐵載體細(xì)菌的篩選采用鉻天青比色法，參照程誠［20］的方法進(jìn)行菌株培養(yǎng)和比色反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在630 nm處測定吸光度值，根據(jù)下列公式計算鐵載體含量：Su（%）=（Ar-A）/Ar×100%（Su為鐵載體含量；Ar為對照反應(yīng)后的吸光度值；A為菌液反應(yīng)后的吸光度值）。

產(chǎn)IAA細(xì)菌的篩選采用Salkowski比色法，參照劉曄等［21］的方法進(jìn)行菌株培養(yǎng)和比色反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在530 nm處測定吸光值，將20 mg/L IAA標(biāo)準(zhǔn)液分別稀釋為5、10、15和20 mg/L，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各個菌株IAA產(chǎn)量（μg/mL）。

1.2.3 形態(tài)學(xué)鑒定 觀察純化后的菌株菌落，記錄其形狀、顏色、邊緣、高度、干濕等性狀，并參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》方法進(jìn)行革蘭氏染色觀察［22］。

1.2.4 促生細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定 按照TIANGEN細(xì)菌基因組提取試劑盒（DP302）說明書提取DNA，采用通用引物27F/1492R進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA基因序列的擴(kuò)增。將擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物送擎科生物科技有限公司測序，得到的16S rDNA序列用BLAST于GenBank數(shù) 據(jù) 庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）中與己知序列進(jìn)行同源性比對分析。

1.2.5 白芷PGPR的促生效應(yīng)驗證 通過盆栽試驗驗證所選促生能力最強(qiáng)的PGPR菌株對白芷的促生效應(yīng)。將菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，180 r/min，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)3 d，6 000 r/min離心10 min后收集菌體，加入無菌水振蕩重懸，將菌液濃度調(diào)至OD595=1（備用）。盆栽試驗土壤來自于四川省遂寧市川白芷種植基地（船山區(qū)余建村）。盆栽試驗所用白芷品種BZA001、品系BZB003幼苗于2020年10月播種于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)青蒲園內(nèi)，第二年3月選擇長勢一致的川白芷植株（每株白芷幼苗保持在相似重量下），用流水沖洗白芷幼苗根部至無褐色土壤痕跡后，將白芷根部浸泡于75%乙醇5 min后，迅速用無菌水沖洗掉殘余酒精（重復(fù)兩次），移栽于圓形花盆（d=35 cm），每盆種5株。

試 驗 共4個 處 理 組：（1）BZA001+蒸 餾 水；（2）BZB003+蒸 餾 水；（3）BZA001+XI-1；（4）BZB003+XI-1。每組6個重復(fù)，每個重復(fù)5株，共30株。從4-6月在白芷根部3.0 cm處澆灌菌液，每株100 mL，每月澆菌一次，共3次，對照組澆等量無菌水。在白芷采收期7月下旬進(jìn)行采收，統(tǒng)計各組白芷株高、根長、根粗、地上鮮重和根鮮重，并以根鮮重衡量各組產(chǎn)量，計算增產(chǎn)率，參考《中國藥典》測定歐前胡素和異歐前胡素含量［23］。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 利用Microsoft Excel 2010和 SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 根際細(xì)菌菌株分離純化

從5份種植于四川遂寧不同地點的白芷根際土壤中共分離純化出77株細(xì)菌，分別編號為XA-1-9；XB-1-16；XC-1-2；XD-1-36；XI-1-14。

2.2 促生細(xì)菌篩選

2.2.1 固氮活性菌株篩選 將77株細(xì)菌在固氮培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，2 d后轉(zhuǎn)接，經(jīng)3次轉(zhuǎn)接后，有23株仍能生長，具有固氮能力，如表1所示。其中菌株XB-8、XB-9、XB-11、XB-13、XB-14、XB-15、XD-9、XD-10、XD-13、XD-23、XD-27、XI-1、XI-3長勢較好，具有較強(qiáng)的固氮能力，如圖1所示。

圖1 部分白芷根際細(xì)菌固氮效果圖Fig. 1 Nitrogen-fixing effect of rhizosphere bacteria of A.dahurica var. formosana

表1 白芷根際菌株固氮活性篩選Table 1 Screening of nitrogen-fixing activity of strains around the rhizosphere of A. dahurica var. formosana

2.2.2 溶磷活性菌株篩選 將77株細(xì)菌分別點接在無機(jī)磷培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，以透明圈直徑/菌落直徑（D/d）的值判斷株菌溶磷能力。20株細(xì)菌在無機(jī)磷培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈，具有溶磷活性（D/d=1.03-2.42），其中，菌株XI-1和XI-3溶解無機(jī)磷的能力最強(qiáng)（圖2-3）。

圖2 白芷根際細(xì)菌溶解無機(jī)磷活性測定Fig. 2 Determination of dissolving inorganic phosphorus activities of bacteria around the rhizosphere of A.dahurica var. formosana

2.2.3 解鉀活性菌株篩選 將77株細(xì)菌點接在解鉀培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，以透明圈直徑/菌落直徑（D/d）的值判斷株菌解鉀能力。有5株細(xì)菌在在解鉀培養(yǎng)基上生長，但均未出現(xiàn)透明圈，說明全部菌株均無解鉀活性（圖4）。

圖4 部分白芷根際細(xì)菌解鉀效果圖Fig. 4 Potassium-solubilizing effect of bacteria around the rhizosphere of A. dahurica var. formosana

圖3 白芷根際細(xì)菌XI-1溶磷效果圖Fig. 3 Phosphorus-solubilizing effect of bacteria XI-1 around the rhizosphere of A. dahurica var. formosana

2.2.4 產(chǎn)鐵載體菌株篩選 利用鉻天青比色法初步篩選出能夠產(chǎn)生鐵載體的細(xì)菌，根據(jù)溶液變黃程度判斷產(chǎn)鐵載體能力，顏色越黃表示菌株產(chǎn)鐵載體能力越強(qiáng)。77株細(xì)菌中有50株細(xì)菌菌液加入CAS檢測液后溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S綠色，4株細(xì)菌（XB-13、XB-14、XC-1、XD-29）菌液變?yōu)辄S色，說明這些細(xì)菌具有一定產(chǎn)鐵載體能力，以XB-13、XB-14、XC-1、XD-29產(chǎn)鐵載體能力相對較強(qiáng)（圖5）。

圖5 白芷部分根際細(xì)菌產(chǎn)鐵載體顯色反應(yīng)Fig. 5 Color reaction of siderophores produced by the bacteria around rhizosphere of A. dahurica var.formosana

用酶標(biāo)儀在630 nm處測定變黃菌液吸光度值，按公式計算菌液鐵載體含量。如圖6所示，4株產(chǎn)鐵載體能力較強(qiáng)的細(xì)菌（XB-13、XB-14、XC-1、XD-29）所產(chǎn)生鐵載體含量均大于30%，其中菌株XB-13產(chǎn)鐵載體能力最強(qiáng)，其菌液鐵載體含量為34.08%。

圖6 白芷根際細(xì)菌產(chǎn)鐵載體測定Fig. 6 Determination of producing siderophores capacity of bacteria around the rhizosphere of A. dahurica var. formosana

2.2.5 產(chǎn)IAA菌株篩選 利用Salkowski’s比色液顯色反應(yīng)判斷77株白芷根際細(xì)菌是否產(chǎn)生IAA。以未接種培養(yǎng)液為陰性對照，以5 μg/mL IAA溶液為陽性對照，根據(jù)反應(yīng)后菌液顏色變粉紅色程度進(jìn)行判斷，顏色越紅代表菌株產(chǎn)IAA能力越強(qiáng)（圖7）。與Salkowski’s比色液 反 應(yīng)后77株 細(xì)菌中有15株細(xì)菌的菌液變?yōu)榈凵?，表明其產(chǎn)IAA能力較弱；7株 細(xì) 菌（XA-6、XB-14、XB-14、XD-11、XD-29、XI-1、XI-3）的菌液顯著變紅色，產(chǎn)IAA能力較強(qiáng)。

圖7 測定部分白芷根際細(xì)菌產(chǎn)IAA活性的顯色反應(yīng)Fig. 7 Color reaction of IAA production activity of some bacteria around the rhizosphere of A. dahurica var.formosana

使用酶標(biāo)儀在530 nm處測定顯著變紅的7株細(xì)菌菌液的吸光度值，計算細(xì)菌的IAA產(chǎn)量結(jié)果如圖8所示。7株細(xì)菌IAA分泌量范圍為5.39-21.96 μg/mL，其中菌株XI-1和XI-3產(chǎn)IAA的能力最強(qiáng)，分泌量為21.96和20.82 μg/mL，其次為XD-29，為17.17μg/mL。

圖8 白芷根際細(xì)菌產(chǎn)IAA定量測定Fig. 8 Quantitative determination of IAA production by bacteria around the rhizosphere of A. dahurica var.formosana

2.3 促生細(xì)菌的鑒定

根據(jù)固氮、溶磷、解鉀、產(chǎn)鐵載體和產(chǎn)IAA五種促生特性篩選的結(jié)果，去除46株無促生潛力或促生潛力較弱的的菌株，對剩下的31株P(guān)GPR菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。其中，綜合能力最強(qiáng)的XI-1菌株將作為后續(xù)盆栽試驗研究材料。

2.3.1 形態(tài)鑒定 觀察并記錄31株菌的菌落形狀、顏色、邊緣、高度、光澤等性狀，挑取單菌落并進(jìn)行革蘭氏染色。其中，菌株XI-1菌落為灰白色，圓形，拱起，邊緣波狀，有光澤，屬革蘭氏陰性細(xì)菌（圖9，表2）。

表2 白芷根際細(xì)菌的形態(tài)和革蘭氏染色特征Table 2 Morphology and Gram staining characteristics of bacteria around the rhizosphere of A. dahurica var. formosana

圖9 白芷根際細(xì)菌XI-1菌落圖Fig. 9 Colony of bacteria XI-1 around the rhizosphere of A. dahurica var. formosana

2.3.2 16S rDNA序列比對分析 將31株菌分別依次進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增和測序，測序后在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析。如表3所示，所篩31株白芷PGPR比對結(jié)果同源性均大于99%，可確定為同一種［24］。結(jié)合形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，31株P(guān)GPR中有20株菌株來源于芽孢桿菌屬（Bacillus），占64.52%，4株菌株來源于腸桿菌屬（Enterobacter），2株菌株來源于類芽孢桿菌（Paenibacillus），2株菌株來源于假單胞菌屬（Pseudomonas），2株菌株來源于克雷伯菌屬（Klebsiella），1株來源于假芽孢桿菌屬（Fictibacillus）。菌 株XI-1與Klebsiella grimontii菌株同源相似性最高，達(dá)99.79%，結(jié)合菌落形態(tài)特征，初步鑒定XI-1菌株為Klebsiella grimontii。

表3 菌株的16S rDNA序列同源性分析Table 3 Homology analysis of 16S rDNA sequences of all strains

2.4 PGPR對川白芷促生效果的驗證

選擇綜合能力最強(qiáng)的白芷根際細(xì)菌克雷伯氏菌株XI-1進(jìn)行盆栽試驗，該XI-1具有較強(qiáng)的固氮、溶磷、產(chǎn)IAA活性，其溶磷能力達(dá)2.42（D/d），產(chǎn)IAA能力達(dá)21.96 μg/mL。

盆栽試驗結(jié)果如圖10所示，克雷伯氏菌株XI-1對各處理組白芷生長均有明顯的促進(jìn)作用。該試驗發(fā)現(xiàn)接種菌株XI-1后，BZA001的株高、根粗和根鮮重均顯著增長，增產(chǎn)率達(dá)31.85%（圖10-A，10-C，10-E）；歐前胡素含量顯著下降為6.04 mg/g，但單株歐前胡素總含量略有上升（圖10-G，圖10-I）；異歐前胡素含量差異不顯著（圖10-H，圖10-I）。試驗還發(fā)現(xiàn)接種后BZB003的株高、根長、根粗、地上鮮重和根鮮重均顯著增長，且該菌對BZB003的增產(chǎn)效果優(yōu)于對BZA001的效果，增產(chǎn)率達(dá)64.59%（圖10-F）；歐前胡素含量顯著下降，為5.91 mg/g，但其單株歐前胡素總含量處于顯著上升水平，達(dá)48.73 mg/株（圖10-G，圖10-I）；施菌后異歐前胡素含量顯著下降為1.0 mg/g，而其單株總含量仍處于略高于對照的水平（圖10-H，圖10-J）。這些結(jié)果表明該P(yáng)GPR菌株確實對兩種川白芷品種（系）均有促進(jìn)白芷生長和產(chǎn)量起作用。

圖10 接種XI-1對兩個不同白芷品種（系）的促生效果Fig. 10 Growth-promoting effect of inoculated XI-1 on two different varieties（line）of A. dahurica var. formosana

3 討論

目前，生物肥料以固氮生物肥料為主，其次是增磷生物肥料，生物肥料種類和數(shù)量遠(yuǎn)少于合成農(nóng)用化學(xué)肥料［9］。而應(yīng)用于中藥材種植的微生物菌肥不足百種，市場需求較大［25］。已有的研究表明，由PGPR制成的微生物肥料經(jīng)濟(jì)、環(huán)保，可替代部分化肥用量，同時可增加產(chǎn)量，提高品質(zhì)［26］，是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展下化肥的有效補(bǔ)充，這在黃瓜［27］、番茄［28］、玉米［29］、小麥［30］等研究中已有大量報道。由此，本試驗開展白芷根際促生細(xì)菌對白芷產(chǎn)量和品質(zhì)影響研究具有重要意義，可為生產(chǎn)實際中提高白芷產(chǎn)量和改進(jìn)品質(zhì)，以及開展白芷專用菌肥研究提供理論依據(jù)。

本試驗結(jié)合細(xì)菌固氮、溶磷、溶鉀、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA能力，共篩選出31株促生潛力較強(qiáng)的白芷根際促生菌。土壤PGPR具有多樣性及廣泛性，Maria等［31］從番茄根際分離出200株細(xì)菌，篩選出兩株P(guān)GPR菌劑潛在菌種資源，分別屬于泛菌屬和假單胞菌屬；雷海英等［32］以苦參根際土壤為材料，共分離鑒定了20株促生菌，發(fā)現(xiàn)它們分屬于5個菌屬，其中假單胞菌屬占所有菌株的50%。本試驗細(xì)菌鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)31株白芷根際促生菌多為芽孢桿菌屬（Bacillus），占64.52%。芽孢桿菌屬是常見的PGPR種類之一［33］，路曉培［34］在內(nèi)蒙古武川馬鈴薯和涼城植物檸條根際土中共分離鑒定了134株細(xì)菌，其中以芽孢桿菌屬數(shù)量最多，占所有菌株的22.31%。芽孢桿菌因其耐受性強(qiáng)、促生防病效果明顯，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及綠化造林中［35］，白芷根際芽孢桿菌應(yīng)同樣存在巨大應(yīng)用潛力。

本試驗中促生潛力最強(qiáng)的菌株XI-1為Klebsiella grimontii，屬克雷伯氏菌屬菌株。已有的研究表明，該屬的產(chǎn)酸克雷伯氏菌可提高土壤酶活、促進(jìn)玉米幼苗的生長并提高玉米的耐鹽堿能力［36］。除此之外，克雷伯氏菌還可降解部分有害物質(zhì)，林楊等［37］發(fā)現(xiàn)吉林克雷伯氏菌2N3對噻吩磺隆污染土壤具有較好修復(fù)作用。謝澳文等［38］以香豆素為唯一碳源篩選出的克雷伯氏菌株對黃曲霉毒素具有顯著降解作用。有關(guān)K. grimontii作為微生物菌肥運用于植物的研究還相對較少，菌株XI-1在白芷促生和其他功能開發(fā)上具有較大潛力，但進(jìn)一步開發(fā)利用還需進(jìn)行安全性評價［39］。

本試驗發(fā)現(xiàn)，接種來源于BZB003的根際PGPR菌株XI-1后，2份不同的白芷品種（系）歐前胡素和異歐前胡素含量均下降，其中BZB003歐前胡素和異歐前胡素含量下降均達(dá)顯著水平。謝澳文等［38］發(fā)現(xiàn)香豆素可作為部分克雷伯氏菌株的碳源供其生長，據(jù)此推測白芷的香豆素成分（如歐前胡素和異歐前胡素）可能是使PGPR菌株XI-1在白芷根際定殖的因素之一，這為菌株XI-1和白芷相互作用研究提供了新的思路。

XI-1同時具有較強(qiáng)的固氮、溶磷和產(chǎn)IAA能力，且在不施肥條件下對白芷生長及產(chǎn)量表現(xiàn)出積極的促進(jìn)作用，增產(chǎn)率分別高達(dá)31.85%和64.59%，具有成為微生物菌肥的應(yīng)用前景。白芷主要有效成分歐前胡素和異歐前胡素含量雖顯著下降，但其單株總成分含量并未下降，且遠(yuǎn)高于《中國藥典》（2020版）規(guī)定的歐前胡素和異歐前胡素含量［23］，這一方面可能與白芷品種（系）BZA001和BZB003自身性狀優(yōu)良有關(guān)，另一方面也可能與白芷在盆栽的低營養(yǎng)逆境下生長受抑，次生代謝產(chǎn)物反而累積有關(guān)［40］。同時，本試驗結(jié)果還表明，XI-1對BZB003白芷品系的促生長作用優(yōu)于BZA001品種，表明該菌株更能與BZB003建立良好的互利共生關(guān)系，至于其中的相互作用機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

總體而言，本試驗所篩白芷根際PGPR菌株具有很大的開發(fā)前景，可為未來白芷種植中增產(chǎn)保質(zhì)、化肥減施提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

從白芷根際分離篩選得到31株P(guān)GPR菌株，其 中64.52%均 屬 于 芽 孢 桿 菌 屬（Bacillus）。K.grimontii菌株具有較強(qiáng)的固氮、溶磷、產(chǎn)IAA活性，綜合促生潛力最強(qiáng)，其溶磷活性達(dá)2.42（D/d），產(chǎn)IAA活性達(dá)21.96 μg/mL。盆栽結(jié)果表明，在不施肥的條件下XI-1對2種不同白芷品種（系）的生長及產(chǎn)量均有顯著提高，增產(chǎn)率分別為31.85%和64.59%。K. grimontii菌株XI-1在一定程度上緩解了缺肥對白芷生長的限制，具有發(fā)展為白芷微生物菌劑的潛質(zhì)。