黃婧 朱亮，2 薛蓬勃，2 付強(qiáng)

（1. 廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004；2. 廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南寧 530004）

鎘（cadmium，Cd）是生物毒性最強(qiáng)的重金屬之一，低劑量（0.1-1 mg/kg）即抑制動(dòng)植物的生長(zhǎng)繁殖［1］。隨著工業(yè)化的發(fā)展，我國受鎘、砷、鉛等重金屬污染的耕地面積近2 000萬hm2，約占耕地總面積的20%，每年生產(chǎn)鎘含量超標(biāo)的農(nóng)產(chǎn)品達(dá)14.6億kg，且有逐漸加重的趨勢(shì)［2］。水稻（Oryza sativaL.）是世界上約一半人口的主食，稻米是很多國家飲食中攝取鎘的最主要來源［3］。鎘在人體內(nèi)積累不易排出，且半衰期長(zhǎng)，對(duì)腎臟、肝臟和骨骼等造成危害，甚至引起癌癥［4］。因此，選育籽粒低鎘積累的水稻品種，最大限度減少鎘攝入量，對(duì)于保障糧食安全和人類健康具有重要意義［5］。

鎘在植物體內(nèi)的分布是一個(gè)由根質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的根吸收、木質(zhì)部裝載和卸載，以及韌皮部裝載和卸載所共同控制的連續(xù)的動(dòng)力學(xué)過程［6］。水稻Cd積累相關(guān)性狀屬數(shù)量性狀，遺傳機(jī)制復(fù)雜，同時(shí)受環(huán)境因素影響。不同基因型的水稻地上部分和籽粒中Cd的含量存在很大的差異，這為研究水稻低Cd積累的生理和遺傳機(jī)制提供了非常有用的種質(zhì)資源［7］。近年來，已有研究利用不同的低Cd/高Cd水稻品種組合構(gòu)建的F2、RIL、CSSLs等群體鑒定出不少控制Cd積累的QTL，在水稻12條染色體上均有分布［8-19］。除了OsHMA3［12］、OsCAL1［15］等基因外，上述研究中鑒定的QTL均未克隆到主效基因，關(guān)于控制Cd從根到莖轉(zhuǎn)運(yùn)繼而進(jìn)入籽粒的遺傳機(jī)制仍不明確，亟待研究。

本研究通過離子組學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)分析中國栽培稻核心種質(zhì)資源209個(gè)品種籽粒的離子譜，鑒定了一批Fe、Zn等籽粒部位高富集以及Cd低積累的水稻品種，為優(yōu)良品種的篩選和雜交育種提供了種質(zhì)資源。另一方面，開展水稻Cd積累生理試驗(yàn)和QTL定位分析，為闡明水稻Cd積累遺傳機(jī)制、運(yùn)用分子標(biāo)記輔助選育籽粒Cd含量低而Fe、Zn等營養(yǎng)元素均衡富集的水稻品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

中國栽培稻（Oryza sativaL.）核心種質(zhì)資源209份，由上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心提供。秈稻花楸03和粳稻SKC為親本構(gòu)建DH群體，包含137個(gè)株系。

1.2 方法

1.2.1 水稻種質(zhì)資源籽粒的離子譜測(cè)定 中國栽培稻核心種質(zhì)資源的209份，每份隨機(jī)挑選5粒籽粒至50 mL FalconTM管中，80℃烘箱中，24-48 h。加入5 mL硝酸（MOS級(jí)），在 SPB 50-48型石墨消解儀（Perkin Elmer）上進(jìn)行消解（120℃，30 min）。冷卻至室溫后，用Milli-Q水定容至50 mL，選取上清10 mL，并用電感耦合等離子質(zhì)譜儀ICP-MS（ELAN DRC-e，Perkin-Elmer）測(cè)量其中14種必需元素和Cd、Pb等有毒重金屬元素的含量，計(jì)算測(cè)量群體的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，最后計(jì)算出Z值［Z值=（樣本元素濃度-平均值）/標(biāo)準(zhǔn)差］，用以表示樣品中某元素含量偏離群體平均值的程度。

1.2.2 水稻的培養(yǎng)條件 生理學(xué)試驗(yàn)中，SKC和花楸03的種子浸泡于Milli-Q水中，28℃，避光48 h。去除液體，用濕的布巾包裹種子，密封，28℃避光24 h，萌發(fā)的種子轉(zhuǎn)入水稻培養(yǎng)液。人工氣候箱設(shè)置為相對(duì)濕度70%，光照周期為13 h光照（溫度為28℃）/11 h黑暗（溫度為25℃），光照強(qiáng)度80-200 mol/（m2·s）。大田及水槽種植試驗(yàn)區(qū)位于廣西省南寧市郊的鎘污染農(nóng)田，于當(dāng)年4月在秧田播種，5月移栽，各株系分別挑選20株長(zhǎng)勢(shì)一致的秧苗移栽，每株系插4行，每行5株。在秧苗生長(zhǎng)期間進(jìn)行常規(guī)田間管理，及時(shí)除草除蟲，注意避免雨天水位上漲淹沒秧苗。

1.2.3 生理學(xué)試驗(yàn)

1.2.3.1 Cd的耐受性分析 對(duì)照組和試驗(yàn)組水稻種子萌發(fā)后，分別種植于添加了0、0.2、1和5 μmol/L CdCl2的水稻培養(yǎng)液中，并置于人工氣候箱培養(yǎng)12 d后，分別選取地上和地下部分材料測(cè)量鮮重并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3.2 不同試驗(yàn)中的Cd處理?xiàng)l件 水稻種子萌發(fā)后直接在添加0、0.2、1或5 μmol/L CdCl2的培養(yǎng)液中培養(yǎng)2周，然后取地上部材料，測(cè)量水稻葉中Cd的積累。分別以0、0.2、1、5、10或25 μmol/L CdCl2處理兩葉一心期苗7 d后，分別對(duì)地上部和地下部取材，進(jìn)行Cd濃度梯度試驗(yàn)。兩葉一心期苗經(jīng)10 μmol/L CdCl2分別處理0、1、2、3、4或5 d后，分別對(duì)地上部和地下部取材，進(jìn)行Cd時(shí)間梯度處理試驗(yàn)。兩葉一心期苗在正常培養(yǎng)條件（28℃，A）和低溫條件（4℃，B）下分別用0、0.2、1、2和5 μmol/L CdCl2處理20 min后，選取根進(jìn)行根吸收動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。

1.2.3.3 水稻組織中Cd含量的測(cè)定 按照1.2.3.1和1.2.3.2處理后取材，將水稻地上部和根材料分別用Milli-Q水、CaCl2及Milli-Q水清洗，置于80℃烘箱中，24-48 h。烘干的植物材料，稱取10-20 mg至50 mL FalconTM管中。加入5 mL硝酸（MOS級(jí)），在石墨消解儀上進(jìn)行消解（120℃，30 min）。冷卻至室溫后，用Milli-Q水定容至50 mL，選取上清10 mL，并用ICP-MS測(cè)定各組織材料中的Cd含量。

1.2.4 土壤中元素含量的測(cè)定 在大田及污染、對(duì)照水槽土壤中元素含量的測(cè)定試驗(yàn)中，采用等間距采樣法，共設(shè)10個(gè)采樣點(diǎn)，采集深度為5 cm左右的耕層土壤，自然風(fēng)干并將土塊碾碎后封存。將各點(diǎn)采集的試樣混合后，反復(fù)按四分法棄取，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。每份準(zhǔn)確稱取0.1 g土壤，采用王水回流法酸解樣品，用Milli-Q水定容至50 mL后，選取上清10 mL，并用ICP-MS進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 水稻Cd積累的QTL定位 以秈稻花楸03和粳稻SKC為親本構(gòu)建包含137個(gè)單株的DH群體。對(duì)葉中Cd積累進(jìn)行QTL定位時(shí)，將DH群體植株種植于水稻營養(yǎng)液中，并置于人工氣候箱培養(yǎng)。兩葉一心期苗以10 μmol/L CdCl2處理7 d后取樣。每個(gè)株系取5個(gè)單株的地上部分混收為一份材料，設(shè)置4個(gè)重復(fù)，并用ICP-MS測(cè)定Cd含量。對(duì)籽粒中Cd積累進(jìn)行QTL定位時(shí)，將DH群體植株種植于Cd污染的水槽土壤中，每個(gè)株系種植20個(gè)單株。收種后脫粒取谷粒測(cè)量Cd含量，每個(gè)株系取5個(gè)單株，每個(gè)單株隨機(jī)選取10粒谷?；焓諡橐环莶牧希O(shè)置4個(gè)重復(fù)，并用ICP-MS測(cè)定Cd含量。

利用MAPMARKER/EXP3.0程序［20］進(jìn)行連鎖分析，構(gòu)建高密度SRR（simple sequence repeat）分子標(biāo)記連鎖圖譜，SSR分子標(biāo)記引物序列信息來源于Gramene網(wǎng)站（www.gramene.org）。結(jié)合分子標(biāo)記連鎖圖和Cd含量測(cè)定結(jié)果，利用MAPMAKER/QTL程序［21］進(jìn)行QTL分析。

2 結(jié)果

2.1 水稻核心種質(zhì)資源籽粒的離子譜

系統(tǒng)分析中國栽培稻核心種質(zhì)資源209個(gè)品種籽粒（見附表）的金屬離子譜，鑒定出20余個(gè)Cd、Fe、Zn、Mn等含量差異顯著的水稻品種（圖1）。從中挑選出Cd含量差異顯著而Fe、Zn、Mn等含量差異不顯著的秈稻品種花楸03（HQ03）和粳稻品種SKC進(jìn)行后續(xù)研究。另一方面，如圖2所示，DPS軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，水稻籽粒中Cd2+與Fe2+、Zn2+、Mn2+無拮抗關(guān)系（P>0.05），而Fe2+、Zn2+和Mn2+之間存在極顯著的協(xié)同關(guān)系（P<0.01）。

圖1 核心種質(zhì)資源水稻籽粒中Cd的積累Fig. 1 Profiling of Cd accumulation in grains of rice core germplasm

圖2 水稻籽粒中Cd2+、Fe2+、Zn2+和Mn2+元素的相關(guān)關(guān)系Fig. 2 Correlation among Cd2+, Fe2+, Zn2+ and Mn2+ elements in rice grains

2.2 花楸03與SKC籽粒中的Cd含量的測(cè)定

為在同樣生境下比較花楸03與SKC籽粒中的Cd含量，將這兩個(gè)品種分別在受污染大田、Cd污染水槽和對(duì)照水槽土壤中種植。如表1所示，土壤中Cd含量高低依次為：污染水槽>大田土壤>對(duì)照水槽，F(xiàn)e、Zn、Cu和As等元素含量在污染水槽和大田中差異不顯著。

表1 大田、鎘污染水槽和對(duì)照水槽土壤中Cd等元素的含量Table 1 Contents of Cd and other metals in the soil of contaminated paddy field，contaminated sink and control sink（μg·g-1 DW）

籽粒中Cd含量高低依次為：污染水槽>大田土壤>對(duì)照水槽，與土壤中Cd含量高低的趨勢(shì)一致（圖3-A）。除了對(duì)照水槽中兩品種的Cd含量均在檢測(cè)限附近外，其余情況下花楸03籽粒中的Cd含量均顯著高于SKC，與圖1結(jié)果一致（圖3-A，P<0.01）。而污染水槽中的花楸03與SKC精米中的Cd含量較低且差異不顯著（圖3-B，P>0.05）。

圖3 花楸03與SKC的籽粒和精米中的Cd含量Fig.3 Cd accumulation in the grains and milled rice of HQ03 and SKC

2.3 花楸03與SKC葉中Cd積累差異顯著，而對(duì)Cd的耐性和吸收無顯著差別

鑒于花楸03與SKC籽粒中Cd積累差異顯著，首先檢測(cè)這兩個(gè)品種地上部和地下部Cd積累是否也存在差異。種子萌發(fā)后直接在添加CdCl2的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，葉片中的Cd含量隨著CdCl2處理濃度的升高而升高，且花楸03葉中的Cd含量始終顯著高于SKC（圖4-A，P<0.01）。兩者葉中Fe、Zn、Mn等金屬元素和K、Mg、Ca等大量元素的含量無顯著差異（圖4-B、C）。

圖4 花楸03與SKC葉片中的元素積累Fig.4 Elements accumulation in the leaves of HQ03 and SKC

對(duì)兩葉一心期苗分別進(jìn)行CdCl2濃度梯度和時(shí)間梯度的處理，發(fā)現(xiàn)葉片中的Cd含量具有濃度梯度和時(shí)間梯度的依賴性（圖5）。除Cd含量均較低情況外，花楸03葉中的Cd含量始終顯著高于SKC（圖5-A、B），而根中Cd含量則無顯著差異（圖5-C、D）。

圖5 不同濃度和不同時(shí)間CdCl2處理后花楸03和SKC幼苗葉片與根中Cd的積累Fig.5 Cd accumulation in the leaves and roots of HQ03 and SKC from rice seedlings exposed to CdCl2 for indicated concentrations and days

由于兩品種葉中Cd積累差異顯著，接下來檢測(cè)它們對(duì)Cd的耐受性。種子萌發(fā)后直接在添加CdCl2的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，對(duì)照及不同濃度Cd處理下，花楸03和SKC地上部（圖6-A）和地下部（圖6-B）的鮮重均無顯著差異，說明這兩個(gè)品種對(duì)Cd的耐受性無顯著差別。

圖6 花楸03與SKC對(duì)Cd的耐受性分析Fig. 6 Tolerance assay of HQ03 and SKC to Cd

為明確花楸03與SKC葉中Cd積累差異是由根吸收還是從根向莖的轉(zhuǎn)運(yùn)差異所導(dǎo)致，對(duì)兩品種進(jìn)行了根吸收的動(dòng)力學(xué)研究。如圖7所示，無論是在正常培養(yǎng)條件（圖7-A）還是低溫條件下（圖7-B），兩品種根吸收Cd的動(dòng)力學(xué)曲線均基本重合，說明花楸03和SKC對(duì)Cd的吸收能力無顯著差異。

圖7 花楸03和SKC的根吸收試驗(yàn)Fig.7 Root uptake assay of HQ03 and SKC

2.4 DH群體的QTL定位

以秈稻花楸03和粳稻SKC為親本構(gòu)建了包含137個(gè)單株的DH群體，各株系葉和籽粒中的Cd積累量數(shù)據(jù)呈連續(xù)正態(tài)分布，表現(xiàn)出數(shù)量性狀的遺傳特點(diǎn)，符合QTL區(qū)間的作圖要求。共檢測(cè)到8個(gè)控制Cd在水稻葉和籽粒中積累的QTL，分別位于第2、3、4、7、8、10和11染色體上（表2、表3和圖8）。

圖8 水稻葉和籽粒Cd積累的QTL定位示意圖Fig.8 QTLs mapping of Cd accumulation in the rice leaves and grains

表2 水稻葉Cd積累的QTL定位Table 2 Quantitative trait loci（QTLs）mapping for Cd accumulation in rice leaves

表3 水稻籽粒Cd積累的QTL定位Table 3 Quantitative trait loci（QTLs）mapping for Cd accumulation in rice grains

3 討論

水稻是我國最重要的糧食作物，土壤重金屬鎘的污染不僅導(dǎo)致水稻生長(zhǎng)發(fā)育受阻，產(chǎn)量下降，還會(huì)在水稻體內(nèi)大量累積并通過食物鏈傳遞，危害國民健康［1，3-5］。因此，研究水稻鎘耐受和積累的機(jī)制，降低水稻籽粒中Cd含量從而最大限度的減小Cd的攝入量，對(duì)于保障糧食安全和人類健康具有重要意義。

不同基因型水稻地上部分和籽粒中Cd的積累存在很大的差異，為研究水稻低Cd積累的生理和遺傳機(jī)制提供了非常有用的種質(zhì)資源［9］。利用不同低Cd/高Cd積累水稻組合構(gòu)建的群體鑒定出不少控制Cd積累的QTL。如Xue等［8］報(bào)道了水稻中6個(gè)與Cd耐性相關(guān)和3個(gè)與Cd濃度相關(guān)的QTL。Ueno等［9］在第11染色體上鑒定到控制水稻地上部分Cd含量的主效QTL。Ishikawa等［10］將控制水稻籽粒Cd積累的QTL定位到第2和7染色體上，并將其中主效QTLqGCd7定位到第7染色體的短臂上。Hu等［16］利用DH群體定位到18個(gè)糙米和14個(gè)精米QTL，分別定位于2、3、4、5、7、9和11染色體上。Liu等［17］在第2、3、6、7、8和10染色體上鑒定到7個(gè)控制籽粒Cd濃度的QTL。Ueno等［11］利用Nipponbare/Anjana Dhan構(gòu)建的群體，Miyadate等［12］利用Cho-Ko-Koku/Akita 63構(gòu)建的群體，先后克隆出根液泡膜上Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsHMA3；Luo等［15］利用CJ06/TN1構(gòu)建的群體，鑒定出控制Cd在葉中積累的防御素類似蛋白CAL1。除此之外，其他研究中鑒定出的QTL均未克隆到主效基因，關(guān)于控制Cd從根到莖繼而向籽粒中轉(zhuǎn)運(yùn)的遺傳機(jī)制仍不明確。

本研究首先利用ICP-MS離子組學(xué)高通量分析手段測(cè)定了中國栽培稻核心種質(zhì)資源209個(gè)品種籽粒的離子譜，從中鑒定出Fe、Zn等高積累以及Cd低積累的品種20余個(gè)，為優(yōu)良品種的篩選和雜交育種提供了較為詳實(shí)的參考資料。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析籽粒中各元素的相關(guān)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Fe2+、Zn2+和Mn2+之間存在協(xié)同關(guān)系，這些元素同屬二價(jià)重金屬，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上具有很大的相似性，很可能在一定程度上共享植物體內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。本研究中未觀察到Fe2+、Zn2+、Mn2+與Cd2+等重金屬元素存在拮抗關(guān)系，原因可能在于籽粒中Cd2+、Pb2+等重金屬含量較低，且其產(chǎn)地重金屬污染狀況可能并不一致。

QTL定位的親本選擇對(duì)于基因挖掘至關(guān)重要，親本差異越顯著越有利于發(fā)現(xiàn)更多更穩(wěn)定的QTL。因此，本研究挑選了Cd含量差異顯著的秈稻品種花楸03和粳稻品種SKC作為親本構(gòu)建DH群體，并對(duì)它們進(jìn)行了一系列的生理學(xué)實(shí)驗(yàn)分析。盡管花楸03和SKC對(duì)Cd的耐性無顯著差異，花楸03葉和籽粒中的Cd含量顯著高于SKC。此外，這兩個(gè)品種精米中的Cd含量均很低且差異不顯著，說明Cd在籽粒中可能積累于胚、糊粉層或者穎殼?；ㄩ?3和SKC根中的Cd含量以及根吸收動(dòng)力學(xué)研究均表明，它們對(duì)Cd的吸收能力不顯著。該結(jié)果與文獻(xiàn)中報(bào)道的結(jié)果一致，普遍認(rèn)為木質(zhì)部介導(dǎo)的根-莖長(zhǎng)途轉(zhuǎn)運(yùn)是決定水稻地上部分和籽粒Cd積累的主要生理過程［22］。而這兩個(gè)品種籽粒和地上部分中Fe、Zn、Mn等微量元素及K、Mg等大量元素的含量均無顯著差異，說明這兩個(gè)品種Cd積累差異可能與Fe2+、Zn2+等二價(jià)陽離子的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)無關(guān)。因此，利用這兩個(gè)親本開展QTL定位對(duì)于選育籽粒Cd低積累的優(yōu)良品種具有重要價(jià)值，該過程中基因的鑒定有助于了解控制Cd向地上部分以及籽粒中轉(zhuǎn)運(yùn)的過程。

DH群體定位共檢測(cè)到8個(gè)控制Cd積累的QTL，分別位于第2、3、4、7、8、10和11染色體上，能解釋10.6%-39.4%的表型變異。QTL分析表明，無論是葉還是籽粒中，Cd與Fe、Zn均未參與共定位（數(shù)據(jù)待發(fā)表），與葉和籽粒中Fe等金屬元素積累結(jié)果相一致。說明這兩個(gè)品種的Cd積累差異可能與Fe2+、Zn2+等二價(jià)陽離子的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)無關(guān)，暗示控制Cd轉(zhuǎn)運(yùn)的QTL可能是特異性的。研究發(fā)現(xiàn)控制Cd向地上部分和籽粒轉(zhuǎn)運(yùn)的QTL存在較大差異，推測(cè)水稻中這兩個(gè)過程可能具有不同的調(diào)控機(jī)制。第2染色體上同時(shí)檢測(cè)到控制Cd向葉和籽粒轉(zhuǎn)運(yùn)的QTL，在染色體上位置與OsCAL1［15］接近；第7染色體上檢測(cè)到的QTL與OsHMA3［12］和OsNRAMP5［23］接近；第10染色體上檢測(cè)到的QTL與Xue等［8］接近。此外，其余4個(gè)QTL未見已報(bào)道的Cd積累相關(guān)基因落在相關(guān)區(qū)域。其中，第3染色體上檢測(cè)到的控制Cd向籽粒轉(zhuǎn)運(yùn)的QTL（qGCd3）定位至RM6266-RM2334的21 cM區(qū)間，LOD值（3.81）和貢獻(xiàn)率（39.4%）均較高。試驗(yàn)誤差、環(huán)境影響以及定位群體的背景差異，會(huì)造成同一QTL的貢獻(xiàn)率及LOD值在不同定位群體中會(huì)有所變化。LOD值的變化相對(duì)較小，是QTL定位中較為可靠的參數(shù)，一般說來LOD值在2以上該位點(diǎn)就有QTL的存在。本研究結(jié)果說明此位點(diǎn)QTL存在的可能性很高。但這兩個(gè)標(biāo)記之間約21 cM距離，包含近400個(gè)基因，需要進(jìn)一步進(jìn)行高精確度連鎖分析。目前已構(gòu)建以花楸03為供體親本，SKC為輪回親本的片段替換系，擬通過高精確度連鎖分析，找到控制鎘向水稻籽粒轉(zhuǎn)運(yùn)的主效基因，解析水稻鎘積累的分子機(jī)理。

4 結(jié)論

從花楸03和SKC構(gòu)建的DH群體中共檢測(cè)到8個(gè)控制Cd在葉和籽粒中積累的QTL。水稻中控制Cd向地上部分和籽粒轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控機(jī)制不同，其中木質(zhì)部介導(dǎo)的根-莖長(zhǎng)途轉(zhuǎn)運(yùn)是決定水稻地上部分和籽粒Cd積累的主要生理過程。第3染色體上檢測(cè)到的QTLqGCd3處可能存在一個(gè)控制鎘向籽粒轉(zhuǎn)運(yùn)的重要基因。

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