郭志浩 金澤鑫 劉琦 高利

（1. 新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院 農(nóng)林有害生物監(jiān)測與安全防控重點實驗室, 烏魯木齊, 830052；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

由小麥矮腥黑粉菌（Tilletia contraversaKühn，TCK）引致的小麥矮腥黑穗病，是我國的一類檢疫性病害，也是一種重要國際檢疫性病害［1］。該病害對小麥生產(chǎn)具有破壞性，其發(fā)病率約等于小麥減產(chǎn)率，并可使小麥產(chǎn)量減少80%以上，甚至導致小麥顆粒無收。該真菌可以通過種子、土壤、空氣等傳播并且可以在土壤中生活多年，一旦引入很難根除。目前此病害已在世界范圍內(nèi)傳播擴散，并帶來極大的損失，在40多個國家被列為檢疫性病害，嚴重威脅著世界農(nóng)業(yè)發(fā)展與人類健康［2］。近年來我國每年進口小麥400萬t，隨著我國加入WTO和“一帶一路”政策的實施，小麥的進口風險不斷增加。

小麥是我國的三大主糧作物之一，小麥的安全生產(chǎn)和病害防控對確保國家糧食安全有著重大的戰(zhàn)略意義［2］。我國的小麥生產(chǎn)中，冬小麥占據(jù)絕大多數(shù)，而冬小麥是矮腥黑穗病的主要寄主。隨著國際貿(mào)易及國際交往的日益頻繁，TCK給我國帶來的風險越來越大，如果TCK沒有得到很好的控制，我國作為小麥生產(chǎn)國將會受到其巨大威脅，并對糧食生產(chǎn)和民生造成無法估量的損害［3］。因此，分析該病原菌侵染小麥的機制，對于有效預防和控制該病害具有重要意義。

小麥矮腥黑粉菌效應蛋白g11335為GSDH家族的效應蛋白，該家族的成員為葡萄糖/山梨醇酮脫氫酶。GSDH家族的一些相似家族UGDH家族和CbGDH家族的成員具有對植物體產(chǎn)生影響的報道。雷胤民［4］研究表明了GSDH家族的相似家族UGDH家族的蛋白尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶可以通過多糖代謝調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育。楊穎［5］研究發(fā)現(xiàn)GSDH家族的相似家族UGDH家族尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶能夠?qū)DP-葡萄糖轉(zhuǎn)化為UDP-葡萄糖醛酸，在毛竹體內(nèi)的半纖維素合成中起關(guān)鍵作用。陳英［6］證明了GSDH家族的相似家族CbGDH家族葡萄糖脫氫酶很可能與復合酶協(xié)同提高了竹筍膳食纖維的理化性質(zhì)。因此GSDH家族的成員葡萄糖/山梨醇酮脫氫酶是否能對植物體產(chǎn)生影響便成為了值得關(guān)注的研究。

本研究利用TCK基因組數(shù)據(jù)克隆出TCK的效應蛋白基因g11335，對該蛋白生物信息學進行分析，通過構(gòu)建亞細胞定位載體進行蛋白亞細胞定位分析［7-8］，為小麥矮腥黑粉菌的后續(xù)相關(guān)研究以及對GSDH家族的后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株及接種材料 小麥矮腥黑粉菌race-2生理小種菌株，煙草品種為本氏煙。

1.1.2 試劑 大腸桿菌Trans-t2blue感受態(tài)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。2×Pro Taq Master Mix酶、2×Phanta Flash Master Mix、50 mg/mL卡那霉素、20 mg/mL利福平購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠純化回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.1.3 主 要 儀 器 PCR儀，美 國Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)。超速離心機，德國eppendrof生命科學公司生產(chǎn)。50 mL離心機，德國Sigma公司生產(chǎn)。小型水平電泳儀，美國Bio-rad公司生產(chǎn)。高壓滅菌鍋，美國Zealway公司生產(chǎn)。GHB-202恒溫金屬浴，杭州博日科技有限公司生產(chǎn)。大容量全溫振蕩器，蘇州培英實驗設備有限公司生產(chǎn)。FastPrep-96高通量快速樣品制備儀，美國MP Biomedicals公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 TCKg11335基因的克隆 收集萌發(fā)后各個生長階段（包括初生擔孢子，次生擔孢子，H體和侵染菌絲，在土壤培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得）的TCK菌絲，利用Tirzol法提取RNA。再利用一步法反轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA。根據(jù)TCK基因組設計引物數(shù)據(jù)設計引物g11335-F和g11335-R（表1），以用反轉(zhuǎn)錄法獲得的TCK的cDNA為模板進行PCR 擴增，反應體系如下：cDNA 模板1 μL，2×Phanta Flash Master Mix 12.5 μL，引物g11335-F 1 μL，引物g11335-R 1 μL，ddH2O 9.5 μL，共 25 μL。擴增程序為：98℃ 30 s；98℃ 10 s，55℃ 5 s，72℃ 10 s，35個 循 環(huán)；72℃1 min。驗證PCR產(chǎn)物，采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。把目的片段純化回收，送至北京擎科生物科技有限公司進行測序。

1.2.2 PGR-107載體的線性化 PGR-107載體線性化的酶切體系如下：PGR-107載體質(zhì)粒5 μL，ClaI酶1 μL，SalI酶1 μL，Loading Buffer 2 μL，用無菌無酶水補至20 μL。將體系溶液37℃酶切3 h后電泳，切膠回收目的片段即可得酶切后的PGR-107質(zhì)粒溶液。

1.2.3 TCKg11335-PGR107載體的構(gòu)建 把g11335基因的質(zhì)粒體連接到酶切后的PGR-107，再轉(zhuǎn)入Trans-t2blue大腸桿菌的感受態(tài)細胞；將其中的陽性單菌落送北京擎科生物科技公司進行檢測，將測序正確的單菌落搖菌并提取質(zhì)粒即可得到g11335-PGR107的質(zhì)粒溶液。PGR107載體的測序引物為PGR107-F和PGR107-R。

1.2.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 把測序正確的g11335-PGR107質(zhì)粒溶液，按照GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞說明書步驟進行熱擊轉(zhuǎn)化，經(jīng)接種呈陽性克隆后在LB液體培養(yǎng)基中28℃搖菌擴繁，再次擴繁出大量的農(nóng)桿菌液。

1.2.5 煙草瞬時表達 將BAX和EGFP的農(nóng)桿菌液大量擴繁。OD600值調(diào)至0.5，隨后采用等容積的buffer（10 mmol/L MES，200 μmol/L AS，10 mmol/L MgCl2）溶液進行懸浮，并在室溫濕度下靜置約3-4 h活化，然后將下表皮細胞采用六區(qū)注射法注入長至四周大的煙草葉子背面，在繼續(xù)培養(yǎng)約4-6 d后觀察煙草葉子的顯癥狀況。

1.2.6 生物信息學分析方法 獲得g11335的基因序列后，通過NCBI比對獲得同名效應蛋白g11335氨基酸序列FASTA格式。運用（https://web.expasy.org/protparam/）即ProtParam軟件分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，運 用（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）即TMHMMServerv.2.0軟件預測其跨膜區(qū)，并使用NCBI中的Conserved Domains軟件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析它的結(jié)構(gòu)域，使 用（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=%20npsa_sopma.html）即SOPMA軟 件 來進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析，用（https://swissmodel.expasy.org/）即Swiss-Model軟件進行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)建模［7］。

1.2.7 效應蛋白g11335的亞細胞定位 首先將pBin載體線性化，酶切體系如下：pBin載體質(zhì)粒5 μL，KpnI酶1 μL，BamH I酶1 μL，Green Buffer 2 μL，用無菌無酶水補至20 μL。將體系溶液37℃酶切3 h后，采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。將目的片段純化回收即可獲得線性化的pBin載體。

以TCK的cDNA為 模 板，以g11335-YF和g11335-YR（表1）為引物，獲得具有pBin的同源臂的產(chǎn)物，反應體系如下：cDNA模板1 μL，2×Phanta Flash Master Mix 12.5 μL，引 物g11335-F 1 μL，引物g11335-R 1 μL，ddH2O 9.5 μL，共 25 μL。擴增程序為：98℃ 30 s；98℃ 10 s，55℃ 5 s，72℃ 10 s，35個循環(huán)；72℃ 1 min。驗證PCR產(chǎn)物，采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。將目的片段純化回收，克隆至pBin載體，轉(zhuǎn)入Trans-t2 blue大腸桿菌感受態(tài)細胞，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-12 h待其長出單菌落。對單菌落進行菌液PCR鑒定，將陽性菌液送至北京擎科生物科技有限公司進行測序。

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和亞細胞定位：將陽性菌液轉(zhuǎn)入10 mL的LB液體培養(yǎng)基擴繁（含有50 mg/mL卡那霉素）中，37℃，220 r/min培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒。利用熱擊轉(zhuǎn)化法按照GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞說明書步驟進行轉(zhuǎn)化，在28℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)2-3 d待其長出單菌落。對單菌落進行菌液PCR鑒定，將農(nóng)桿菌的陽性轉(zhuǎn)化子于5 mL的LB液體培養(yǎng)基（含有50 mg/mL卡那霉素和20 mg/mL利福平）中，28℃，220 r/min培養(yǎng)過夜。取部分培養(yǎng)后的菌液按1∶100的配比，轉(zhuǎn)入10 mL的LB液體培養(yǎng)基中擴繁，28℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600=0.8左右，后用等體 積 的buffer（10 mmol/L MES，200 μmol/L AS，10 mmol/L MgCl2）重懸菌體，離心棄上清，重復該步驟3次，再用buffer調(diào)至OD600=0.5左右，并在室溫下靜置3-4 h活化［8］，再由下表皮注射到4周的煙草葉片背面，在2-3 d后，用激光共聚焦顯微鏡觀察煙草中的定位情況［9］。

2 結(jié)果

2.1 小麥矮腥黑粉菌基因g11335的克隆

以TCK的cDNA為模板，用引物g11335-F和g11335-R（表1）擴增出約1.4 kb的目的基因片段。將 PCR凝膠產(chǎn)物回收，測序后獲得1 389 bp長度的序列，如圖1所示。

2.2 效應蛋白g11335的生物信息學分析

2.2.1 效應蛋白g11335的保守結(jié)構(gòu)域分析 基因g11335全長1 389 bp，通過NCBI比對得效應蛋白g11335氨基酸序列FASTA格式：MRVATFLAQASC LLSFATGALAARQLGNLGNVKFTADLWAANITGAR NLVFDAVGDLLVIQTDPNSSTNALDGVAGSGLLFPA VVGLVDFGTIDSPRVKTYPIVQNTSLPQGFIPNHGIEI IDNYLYLSNETSIWRWPYRAGQRRSVSASSAQLFTSN MPWKDDKFFVADGLDLNIDYTDNRSDIRYFPVRSAP IPAGGWDWYSRPIWALGLRNAVGLAIQPVTNWLWE TDQGIDDLYREDLGGDIHNDNPPDELNLLDNWSKPE TVNAQKPYHFGFPYCWTEGNITNASSTVGPHKAGD QWAQYLNRSDYTDAYCKDPKKNIKPLALVQAHAAP LGIQFFNGTGCVNTPNCNSKRNPFTCNYTGQLFFTA HGADNRDRSVGHFFGTFPFSSKTKLPSRPLAAPPAN YDELYGETDQTLCTVSFSGQNCWRPTMIKFDRFGRL FITENNRGEVWRLSIDGTA。

該效應蛋白共編碼462個氨基酸，含有典型GSDH結(jié)構(gòu)域，可能是葡萄糖/山梨醇酮脫氫酶家族成員，具有β螺旋折疊，如圖2所示。

圖2 效應蛋白g11335的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig. 2 Conserved domain analysis of effector g11335

2.2.2 效應蛋白g11335理化性質(zhì)分析 效應蛋白g11335的相對分子質(zhì)量為51 270.39 Da，理論等電點pI為5.68，說明了蛋白質(zhì)的偏酸。氨基酸總數(shù)則是462個，其 中 Ala（A）39個（8.4%）、Arg（R）24 個（5.2%）、Asn（N）35個（7.6%）、Asp（D）34個（7.4%）、Cys（C）8個（1.7%）、Gln（Q）17個（3.7%）、Glu（E）11 個（2.4%）、Gly（G）37 個（8.0%）、His（H）7 個（1.5%）、Ile（I）22 個（4.8%）、Leu（L）40個（8.7%）、Lys（K）15個（3.2%）、Met（M）3個（0.6%）、Phe（F）26個（5.6%）、Pro（P）30個（6.5%）、Ser（S）29個（6.3%）、Thr（T）32 個（6.9%）、Trp（W）14個（3.%）、Tyr（Y）16個（3.5%）、Val（V）23個（5.0%）。Asp和Glu的總數(shù)即負電性殘基總數(shù)為45個，而Arg和Lys的總量即正電荷殘基總數(shù)為39個。g11335蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)是34.17，屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪指數(shù)為75.22，而總平均親水性則為-0.333。預測該蛋白質(zhì)的半衰期是超過30 h在哺乳動物的網(wǎng)織紅細胞中，超過20 h在酵母中，以及超過10 h大腸桿菌感染中。該蛋白的親疏水性，最疏水性數(shù)值是2.533，而最親水數(shù)值則為-2.456。如圖3所顯示，在g11335效應蛋白中親水的氨基酸數(shù)量更多，是偏親水蛋白質(zhì)。

圖3 效應蛋白g11335的親疏水性圖Fig. 3 Hydrophilicity of effector g11335

2.2.3 效應蛋白g11335信號肽分析 效應蛋白g11335信號肽分析，信號肽長度為23個氨基酸，信號肽切割位點C的最高值為0.763，位于第23位氨基酸；信號肽分數(shù)S的最高值為0.900，位于第3位氨基酸；合并后切割位點的Y最高值約為0.791，位于第23位氨基酸。S平均值為0.819，所預測的切割位點約在1-22位氨基酸之間。如圖4所示。

圖4 效應蛋白g11335信號肽預測Fig. 4 Signal peptide prediction of effector g11335

2.2.4 效應蛋白g11335跨膜區(qū)分析 效應蛋白g11335跨膜區(qū)分析，通過對跨膜區(qū)的預測發(fā)現(xiàn)，在g11335效應蛋白質(zhì)的全部462個氨基酸中，無跨膜區(qū)，如圖5所顯示。

圖5 效應蛋白g11335的跨膜區(qū)預測Fig. 5 Prediction of transmembrane region of effector g11335

2.2.5 效應蛋白g11335二級結(jié)構(gòu)預測分析 效應蛋白g11335二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，該氨基酸具有α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲。其中，有51個氨基酸形成α-螺旋占11.04%，115個氨基酸形成延伸鏈，占24.89%；30個氨基酸形成β-轉(zhuǎn)角，占6.49%；266個氨基酸形成不規(guī)則卷曲，占57.58%，如圖6所顯示。

圖6 效應蛋白g11335的二級結(jié)構(gòu)預測Fig. 6 Secondary structure of effector g11335

2.2.6 效應蛋白g11335三級結(jié)構(gòu)預測分析 為了解g11335蛋白的三維結(jié)構(gòu)，利用Swiss Model軟件對其進行同源建模。以6ilq.1.A蛋白質(zhì)為模板，6ilq.1.A蛋白質(zhì)與效應蛋白g11335的同源相似度為31.44%。6ilq.1.A蛋白質(zhì)為可溶性奎諾蛋白葡萄糖脫氫酶，具有里氏木霉糖活性酶家族AA12的碘化結(jié)構(gòu)。以6ilq.1.A蛋白質(zhì)為模板預測分析獲得效應蛋白g11335三維效果圖，如圖7所示。

圖7 效應蛋白g11335的三級結(jié)構(gòu)預測Fig. 7 Tertiary structure prediction of effector g11335

2.3 效應蛋白g11335亞細胞定位及熒光觀察

利用激光共聚焦顯微鏡進行亞細胞定位觀察，發(fā)現(xiàn)對照pBin空載體在本氏煙的細胞膜和細胞核都有表達，效應蛋白g11335定位在本氏煙的細胞膜上。說明g11335效應蛋白大部分表達于細胞膜，如圖8所示。

圖8 效應蛋白g11335亞細胞定位圖Fig. 8 Subcellular localization of effector g11335

2.4 效應蛋白g11335煙草毒性驗證

煙草毒性驗證結(jié)果顯示，效應蛋白g11335不能夠抑制由Bax引起的煙草壞死癥狀。結(jié)果說明效應蛋白g11335無毒性。如圖9。

圖9 效應蛋白g11335的毒性驗證Fig. 9 Toxicity validation of effector g11335

3 討論

小麥矮腥黑粉菌所誘發(fā)的小麥矮腥黑穗病，被認為是對小麥的威脅最大、最難以預防的檢疫性病害之一［10-11］。在環(huán)境條件適宜且存在大量感病植株時，該病害可導致50%-80%的小麥生產(chǎn)經(jīng)濟損失，甚至絕收［12］。

TCK侵染小麥之后使小麥分蘗增多，植株矮化。并且小麥的整個麥粒都變成了充滿黑粉孢子的TCK黑粉菌癭，使小麥損失嚴重［13］。該病害流行年份，發(fā)病率大約相當于產(chǎn)量減產(chǎn)率［14］。據(jù)報道，在美國西北部蒙大拿州的部分地方TCK發(fā)病率高達20%，而產(chǎn)量虧損則為45%［15］。其威力不可小覷。該病害在我國的風險評估結(jié)果表明，我國19.3%的冬小麥種植區(qū)都屬于高危險區(qū)，具有適宜于TCK擴散生長的自然環(huán)境條件［16］，所以TCK一旦不能及時控制，就會威脅到我國的糧食生產(chǎn)，也將對我國的食品安全甚至是國民生活造成難以想象的危害。所以有必要加大對TCK生物特征、為害規(guī)律和防治技術(shù)的深入研究，對TCK實施早期預防和檢疫監(jiān)測，從而能夠更加全面的對其進行防治。為我國的TCK防控工作提供技術(shù)儲備。

由于效應蛋白是病原菌與植物之間的重要武器，在病原菌感染植物的整個過程中起著重要的作用，對小麥矮腥黑粉菌效應蛋白的研究有助于闡明小麥與小麥矮腥黑粉菌之間的互作機理。本研究成功的從TCK基因組中克隆出了編碼效應蛋白的基因g11335，該基因長度為1 389 bp，編碼462個氨基酸，且該基因編碼的效應蛋白g11335包含了GSDH super家族的功能保守域cl26817，屬于GSDH 家族的葡萄糖/山梨醇酮脫氫酶，該家族的相似家族UGDH家族和CbGDH家族，皆具有家族成員影響植物體的報道。

在對基因功能的研究中表明，亞細胞定位和基因功能之間存在著密切聯(lián)系，蛋白質(zhì)處在不同的細胞部位中，其執(zhí)行的功能也就有所變化［17］。本研究結(jié)合EGFP即增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescence protein）在煙草中的瞬時表達技術(shù)［17-18］對g11335基因及其編碼的效應蛋白進行亞細胞定位。結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)定在了本氏煙的細胞膜上，因此推測它主要在細胞膜上行使功能。研究表明，細胞膜在細胞轉(zhuǎn)換物質(zhì)、吸取營養(yǎng)、清除代謝垃圾、產(chǎn)生和運送蛋白質(zhì)等各種處理過程中都起到著非常關(guān)鍵的功能［19-20］。對效應蛋白g11335進行了煙草毒性分析，結(jié)果顯示該效應蛋白無毒性。這表明GSDH家族的成員葡萄糖/山梨醇酮脫氫酶很可能并不會對植物體產(chǎn)生毒性影響。

本文成功克隆出TCK編碼效應蛋白的g11335基因，并基于基因克隆和煙草瞬時表達技術(shù)對該蛋白進行了亞細胞定位觀察以及煙草毒性驗證，得出該效應蛋白對本氏煙草植物體無毒性。本研究成果為進一步深入分析基因g11335及編碼的效應蛋白在小麥矮腥黑粉菌中的具體功能，以及其GSDH家族成員能否影響植物體的研究奠定了基礎。

4 結(jié)論

小麥矮腥黑粉菌基因g11335全長1 389 bp，共編碼462個氨基酸。其所編碼的效應蛋白質(zhì)具有一個跨膜區(qū)，包含典型GSDH家族結(jié)構(gòu)域，該家族成員可能是葡萄糖/山梨醇酮脫氫酶，具有β螺旋折疊。該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)是34.17，屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪指數(shù)為75.22，而總平均親水性則為-0.333，是偏親水蛋白質(zhì)。效應蛋白g11335定位在本氏煙的細胞膜中，無毒性。