蔡佳 梁振宇 黃瑜 魯義善 施鋼 簡(jiǎn)紀(jì)常

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室（湛江），湛江 524088；2. 廣西科學(xué)院 廣西北部灣海洋研究中心 廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530007）

石斑魚作為我國南海諸省與東南亞各國重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類，其養(yǎng)殖業(yè)近年來受到病害問題的困擾，其中虹彩病毒?。╥ridovirus disease）和病毒性神經(jīng)壞死?。╲iral nervous necrosis）便是危害最大和影響最廣的兩種病毒性疫?。?-2］，虹彩病毒感染和神經(jīng)壞死病毒感染能誘導(dǎo)魚類細(xì)胞產(chǎn)生凋亡與自噬等不同類型的細(xì)胞死亡［3-4］，并且兩類病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡在病毒增殖以及抗病毒免疫調(diào)控的過程中發(fā)揮著重要作用［5-7］，然而魚類細(xì)胞死亡調(diào)控因子在病毒感染過程中的作用尚不清楚。因此，探究細(xì)胞死亡影響病毒感染的分子機(jī)制不僅能更好地了解魚類抗病毒天然免疫反應(yīng)的分子機(jī)制，還能為新型抗病毒策略的制定提供科學(xué)依據(jù)。

BAG（Bcl-2 associated athanogene）是一類重要的細(xì)胞死亡調(diào)控因子，該家族有6個(gè)成員 BAG1-6，其中BAG3在部分正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中被認(rèn)為是抗凋亡和前自噬因子，通過與Bcl2與HSP70家族蛋白等的相互作用，BAG3能調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡與自噬、增殖、遷移、黏附以及細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)［8-10］。此外，BAG3在病毒感染中也扮演了重要的角色［11］。在HIV-1 感染的膠質(zhì)細(xì)胞和 T 淋巴細(xì)胞中，BAG3 表達(dá)上調(diào)，BAG3 沉默明顯降低 Tat 蛋白誘導(dǎo)的 LC3-II水平并增加 sub-G0/G1期的細(xì)胞凋亡，這表明BAG3能通過調(diào)節(jié)自噬/凋亡平衡影響病毒的感染［8］；HIV-1 感染后BAG3 表達(dá)的增加還可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中 HIV-1 LTR 的轉(zhuǎn)錄［12］；BAG3 沉默則能促進(jìn)HIV-1 感染誘導(dǎo)的Caspase-3 活化，促進(jìn)病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［13］。在單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）的感染中，BAG3能促進(jìn)病毒α蛋白的表達(dá)和積累以及病毒的增殖［14］。但是BAG3影響病毒感染的分子互作網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)報(bào)道還相對(duì)較少。

本研究團(tuán)隊(duì)在石斑魚脾臟轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選得到了石斑魚BAG3基因（EcBAG3），通過熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)該基因在病毒感染GS細(xì)胞后表達(dá)上調(diào)（數(shù)據(jù)未發(fā)表），表明該基因可能參與了石斑魚抗病毒感染的免疫反應(yīng)。為深入研究了解EcBAG3的功能與作用機(jī)理，本研究構(gòu)建了石斑魚脾臟細(xì)胞（GS）的酵母雙雜交cDNA 文庫，并利用EcBAG3作為誘餌篩選互作蛋白，為闡明EcBAG3及其互作相關(guān)因子影響病毒感染的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

石斑魚脾臟細(xì)胞（GS細(xì)胞）和攜帶目的基因EcBAG3的PMD18T-EcBAG3質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、酵母質(zhì)粒提取試劑盒等購自O(shè)MEGA公司；酵母雙雜交試劑盒Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System（含酵母菌株、載體、培養(yǎng)基等），及限制性內(nèi)切酶等購自Clontech 公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與雙鏈cDNA合成 采用TRizol法提取石斑魚脾臟細(xì)胞總RNA，用1%瓊脂糖凝膠和NanoDrop2000分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量和濃度。以CDS III/3' PCR Primer為引物，總RNA為模板，利用MMLV Reverse Transcriptase合成cDNA一鏈，以cDNA一鏈為模板，利用50×Advantage 2 Polymerase Mix合成雙鏈cDNA。合成的雙鏈cDNA利用蛋白酶K處理后回收凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雙鏈cDNA與核蛋白酵母雙雜交載體pGADT7的重組和庫容量鑒定 將雙鏈cDNA均一化處理后與雙酶切（NdeI/XhoI）處理線性化的pGADT7載體混合，加入ExnaseTM II，混勻反應(yīng)體系后，置于37℃反應(yīng)30 min后冰浴冷卻5 min終止反應(yīng)。通過電擊轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，轉(zhuǎn)化后的混合物置于37℃，225-250 r/min培養(yǎng)1 h。取轉(zhuǎn)化后細(xì)菌原液10 μL稀釋100倍后取50 μL涂布LB平板（抗性Amp+抗性），剩余培養(yǎng)物加入甘油至終濃度20%存于-80℃，第2天對(duì)平板的克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定庫容量：CFU/mL= 平板上的克隆數(shù)/50 μL× 100倍×1×103μL，文 庫 總CFU= CFU/mL×文庫菌液總體積（mL）。

1.2.3 EcBAG3誘導(dǎo)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)EcBAG3序列和pGBKT7 載體序列設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的特異性引物，其中上游引物帶NdeI 酶切位點(diǎn)（5'-ATCTCAGAGGA GGACCTGCATATGTTTCAGTACTCGAC-3'），下游引物帶SalI 酶切位點(diǎn)（5'- ATGCGGCCGCTGCAGGTC GACTTATGATATCTCCTTTGCC-3'）；并以PMD18TEcBAG3 質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，膠回收目的片段；同時(shí)對(duì)pGBKT7 載體進(jìn)行NdeI 和SalI 的雙酶切，并膠回收線性化后的載體；參照試劑盒的操作方法，將目的片段和載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、挑選單克隆并測(cè)序，測(cè)序正確的克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取，即為誘餌載體pGBKT7-EcBAG3。

1.2.4 誘餌載體的自激活及毒性檢測(cè) 利用pGBKT7-Lam Control Vector和pGADT7-T Control Vector 作為陰性對(duì)照，pGBKT7-53 Control Vector 和pGADT7-T Control Vector作為陽性對(duì)照，將對(duì)照與誘餌載體pGBKT7-EcBAG3分別轉(zhuǎn)化酵母Y2H Gold感受態(tài)細(xì)胞，酵母感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化方法參考Yeastmaker Yeast Transformation System 2 操作手冊(cè)。將轉(zhuǎn)化液分別涂布在SD/-Trp、SD/-Trp-Leu 缺失培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)2-4 d 后觀察生長情況。通過觀察克隆判斷誘餌載體是否對(duì)酵母菌株有毒性，對(duì)報(bào)告基因是否存在自激活現(xiàn)象。

1.2.5 酵母cDNA 文庫篩選 參照Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System操作手冊(cè)，采用共轉(zhuǎn)法進(jìn)行雙雜交文庫篩選，制備3 mL Y2H Gold感受態(tài)，將10 μg酵母文庫質(zhì)粒、5 μg誘餌質(zhì)粒與50 μL預(yù)變性兩次后的Carrier DNA混勻后與Y2H Gold感受態(tài)混合，加入2.5 mL的1X PEG/LiAc后混勻，30℃水浴45 min，每15 min搖勻一次，隨后加入160 mL DMSO，混勻后42℃熱激20 min，每10 min上下顛倒混勻一次，700×g離心5 min收集菌體后加入3 mL YPD Plus，30℃培養(yǎng)90 min，700×g離心5 min后加入0.9% NaCl 溶液至6 mL重懸菌體，取100 μL按1/10、1/100涂 布100 mm SD/-Trp-Leu平 板，用于計(jì)算轉(zhuǎn)化效率，剩余菌液涂布于添加了SD/-Trp-Leu/X-α-Gal/AbA平 板 上（150 mL/塊，約50塊），30℃倒置培養(yǎng)3-5 d 后觀察單克隆。

1.2.6 互作蛋白的分離鑒定與測(cè)序分析 挑取上述QDO 四缺培養(yǎng)基中長出的單克隆，利用酵母質(zhì)粒提取試劑盒提取誘餌與互作蛋白表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB 固體培養(yǎng)基上（含50 μg/mL Ampicillin），37℃，260 r/mim振 蕩 培養(yǎng)20 h后提取質(zhì)粒，隨后進(jìn)行測(cè)序。

將插入片段進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果去除重復(fù)或結(jié)構(gòu)異常的克隆；將篩選后的插入片段在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastn 比對(duì)分析，找到與插入片段同源性最高的基因序列；利用該基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.arabidopsis.org/）中進(jìn)行Blastx 比對(duì)分析，找到其在數(shù)據(jù)庫中同源性最高的蛋白，通過注釋對(duì)插入片段的功能進(jìn)行推測(cè)。

1.2.7 互作蛋白的一對(duì)一驗(yàn)證 采用與1.2.5相同的方法，取200 ng測(cè)序后的質(zhì)粒與100 ng的EcBAG3誘餌質(zhì)粒、與10 μL Carrier DNA混勻后轉(zhuǎn)化Y2H Gold，轉(zhuǎn) 化 液 涂 布 在SD/-Trp-Leu-His/-Ade/X-α-Gal/AbA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3-5 d后觀察是否有藍(lán)色的陽性克隆。

2 結(jié)果

2.1 石斑魚脾臟細(xì)胞總RNA質(zhì)量檢測(cè)

利用Trizol法提取石斑魚脾臟細(xì)胞（GS）總RNA，在1%瓊脂糖膠中檢測(cè)總RNA的質(zhì)量。如圖1所示，28S和18S條帶清晰，無明顯彌散條帶，說明總RNA質(zhì)量較好，無明顯降解。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠檢測(cè)Fig. 1 Agarose gel electrophoresis for the detection of total RNA

2.2 酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建和質(zhì)量評(píng)估

將雙鏈cDNA連接到pGADT7載體后，電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中獲得酵母雙雜交cDNA文庫，取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物10 μL稀釋100倍后取50 μL涂布到平板上，計(jì)算得到初始文庫容量為5.6×106CFU。隨機(jī)挑取24個(gè)單克隆進(jìn)行進(jìn)行PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。如圖2所示，24個(gè)單克隆均能擴(kuò)增出條帶，重組率為100%，平均長度大于750 bp，且具有良好的多態(tài)性。

圖2 文庫部分插入片段瓊脂糖凝膠檢測(cè)Fig. 2 Agarose gel electrophoresis for the detection of partial inserted cDNA fragments in library

2.3 誘餌蛋白酵母雙雜交載體的構(gòu)建及其自激活檢測(cè)

將含有pGBKT7 空載體與pGBKT7-EcBAG3誘餌載體的Y2H Gold 酵母涂布于SD/-Leu/-Trp/X-αgal上生長，pGBKT7-EcBAG3質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入酵母菌株 后 在SD/-Leu/-Trp/-His/X-α-gal和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/AbA平板上不生長（圖3），說明pGBKT7-EcBAG3在Y2H Gold酵母菌株中沒有自激活活性，可進(jìn)行后續(xù)篩選實(shí)驗(yàn)。

圖3 pGBKT7-EcBAG3自激活檢測(cè)Fig. 3 Self-activation verification of pGBKT7-EcBAG3

2.4 EcBAG3互作蛋白的初步篩選及其序列分析

將GS細(xì)胞的酵母cDNA文庫質(zhì)粒和pGBKT7-EcBAG3共轉(zhuǎn)化入酵母感受態(tài)細(xì)胞Y2H Gold。將酵母菌液涂布于SD/-Leu-Trp-Ade-His培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，再將生長的陽性克隆挑到SD/-Leu-Trp-Ade-His/X-α-Gal/Aba培養(yǎng)皿上（圖4），共獲得83個(gè)轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色的陽性克隆，測(cè)序后經(jīng)過序列分析，去除重復(fù)序列和測(cè)序信號(hào)為雙峰的結(jié)果，獲得7個(gè)可能與EcBAG3互作的候選蛋白（表1），涉及免疫調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、脅迫響應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞發(fā)育與遷移等多個(gè)方面。

圖4 SD/-Leu-Trp-Ade-His/X-α-Gal/Aba平板上篩選獲得的部分陽性克隆Fig. 4 Partial positive clones screened from SD/-Leu-Trp-Ade-His/X-α-Gal/Aba plates

表1 酵母雙雜交陽性克隆比對(duì)結(jié)果Table 1 Alignments of positive clones screened through yeast two hybrid

2.5 互作蛋白的一對(duì)一驗(yàn)證

將2.4中篩選出的7個(gè)互作候選基因克隆的質(zhì)粒提取出來后與pGBKT7-EcBAG3、Carrier DNA共轉(zhuǎn)化至Y2H Gold酵母菌種，進(jìn)行一對(duì)一驗(yàn)證。結(jié)果顯示除了候選蛋白“CCN family member 1”，其余蛋白的候選轉(zhuǎn)化酵母菌在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA培養(yǎng)基上均能正常生長且呈藍(lán)色（圖5）。

圖5 EcBAG3與候選互作蛋白驗(yàn)證Fig. 5 Verification of EcBAG3 and candidate interacting protein

3 討論

目前篩選鑒定相互作用蛋白的方法主要有酵母雙雜交、Co-IP、pull-down 等［15］，其中酵母雙雜交系統(tǒng)常用的方法之一，但是該方法篩選獲得的假陽性較高，需要一對(duì)一驗(yàn)證等技術(shù)手段進(jìn)一步確認(rèn)。本實(shí)驗(yàn)以石斑魚脾臟細(xì)胞（GS）構(gòu)建cDNA酵母雙雜交文庫，使用EcBAG3作為誘餌蛋白初步篩選出83個(gè)單克隆并進(jìn)行了測(cè)序，通過分析測(cè)序結(jié)果去除了測(cè)序結(jié)果相同以及測(cè)序信號(hào)為雙峰的克隆，獲得了7個(gè)備選互作基因，進(jìn)一步的驗(yàn)證結(jié)果顯示有1個(gè)克隆未能正常生長，剩余的6個(gè)克隆測(cè)得的序列僅為功能結(jié)構(gòu)而并非完全的編碼區(qū)，因此后續(xù)還需要克隆互作基因全長再通過Co-IP、亞細(xì)胞定位等技術(shù)進(jìn)行確認(rèn)。

在篩選到的7個(gè)互作蛋白中，HSP70、HSC71與BAG3的相互作用已被廣泛報(bào)道，HSP家族蛋白與BAG3的互作能介導(dǎo)胞內(nèi)蛋白的聚集與清除［16-17］、調(diào)控細(xì)胞的自噬與凋亡［18］等過程。病毒感染能誘導(dǎo)胞內(nèi)的未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力啟動(dòng)炎癥反應(yīng)［19］，細(xì)胞自噬則能清除細(xì)胞中過度累積的蛋白，同時(shí)調(diào)節(jié)宿主抗病毒免疫反應(yīng)、病毒的侵染與增殖［20-21］。此外，哺乳動(dòng)物HSC71與HSP70還參與了病毒的復(fù)制、裝配與釋放［22］。Rao等［23］的研究表明草魚HSP70能增強(qiáng)HMGB1b與自噬因子Beclin 1互作來促進(jìn)自噬介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)，表明魚類HSP蛋白對(duì)細(xì)胞死亡的調(diào)控在魚體抵御病毒感染的過程中也扮演著重要的角色。Ec-BAG3也是真核細(xì)胞中一類重要的細(xì)胞死亡調(diào)控因子，其與HSP的互作在病毒感染中的作用可能與Rao等的發(fā)現(xiàn)類似。Filamin蛋白是一類肌動(dòng)蛋白交聯(lián)蛋白，在細(xì)胞受到外界壓力時(shí)該蛋白通過折疊狀態(tài)的改變維持激動(dòng)蛋白的柔性，BAG3則能通過監(jiān)測(cè)Filamin狀態(tài)的改變及時(shí)活化自噬清除外力導(dǎo)致的受損蛋白［24］，F(xiàn)ilamin A蛋白的表達(dá)還與病毒侵染與增殖相關(guān)［25-26］。與Filamin類似，Collagen作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，其表達(dá)有助于病毒的吸附及在細(xì)胞間的傳播［27-28］。篩選蛋白剩余的CCN1、ZNF、SOCS則參與病毒感染過程中炎癥通路、干擾素通路的調(diào)節(jié)，從而影響病毒的增殖［29-31］，但是目前關(guān)于BAG3與這3個(gè)蛋白的關(guān)聯(lián)還未見報(bào)道，因此在本實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展EcBAG3與候選互作蛋白的作用模式研究，對(duì)深入了解EcBAG3的功能及其在病毒感染過程中的作用機(jī)理具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究在用石斑魚脾臟細(xì)胞構(gòu)建酵母雙雜交cDNA 文庫后，利用石斑魚EcBAG3作為誘餌篩選到了脾臟細(xì)胞中與EcBAG3互作的蛋白。文庫容量為5.6×106CFU，插入片段大小均在750 bp以上，重組率為100%。獲得的候選互作蛋白提示BAG3 可能通過調(diào)控細(xì)胞死亡、細(xì)胞骨架的重排以及抗病毒免疫反應(yīng)來影響病毒的侵染與增殖。