劉玉蘭 何鳳屏 郭偉強 劉英 黃從云 李定云 黃亮 陳曉旋
胰腺癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一[1]。近年來,隨著我國人民的生活節(jié)奏加快及飲食結(jié)構(gòu)的改變,胰腺癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢。目前的腫瘤標(biāo)志物CEA 和CA-199 聯(lián)合檢測對胰腺癌診斷的靈敏度僅為45%左右[2],特別需要一種敏感性和特異性高的標(biāo)志物。microRNA(miRNA)是一類非編碼小分子的18~24 個核苷酸的單鏈RNA。miRNA 通過降解或抑制mRNA 的翻譯來抑制靶基因的表達[3]。miRNA 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到調(diào)控靶基因的重要作用[4]。張力蛋白同源物基因(PTEN)是腫瘤抑制基因,具有脂質(zhì)和蛋白雙重磷酸活性,在細胞生長、增殖、生存、凋亡、血管生成、細胞遷移和侵襲等方面發(fā)揮重要作用[5]。PTEN在腫瘤中表達下調(diào)或者發(fā)生缺失突變時,可激活PI3K/Akt 信號通路,從而引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。
miRNA 能在腫瘤組織內(nèi)穩(wěn)定表達,還能穩(wěn)定存在于血清、血漿、全血中[7-9],可作為一種無創(chuàng)的腫瘤診斷標(biāo)志物。Liu 等[10]研究發(fā)現(xiàn)miRNA在胰腺癌患者循環(huán)血中的表達明顯上調(diào),但是,miRNA-10 調(diào)控PTEN 促進胰腺癌細胞增殖和遷移的作用機制未見有報道。因此,本文通過研究miRNA-10 調(diào)控PTEN 在胰腺癌的表達、與病理分期的相關(guān)性以及生物學(xué)功能,為預(yù)測患胰腺癌的風(fēng)險和預(yù)后監(jiān)測提供實驗依據(jù)。
1.1 臨床資料 在粵北人民醫(yī)院肝膽外科選取2017 年3 月-2019 年9 月住院并病理診斷證實為胰腺癌的患者80 例作為研究組,所有患者術(shù)前均未接受放射治療、化學(xué)藥物、免疫治療。另選取同期健康體檢者80 例作為對照組。(1)納入標(biāo)準:①病理確診為胰腺癌;②未經(jīng)任何放療、化療等治療。(2)排除標(biāo)準:①合并其他惡性腫瘤病史;②家族遺傳性糖尿病。本研究已通過汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院倫理委員會批準,所有研究對象均簽署知情同意書。
1.2 試劑及儀器 總RNA 提取試劑盒、qRT-PCR試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由上海生工生物工程股份有限公司提供,miRNA-10 和PTEN 試劑盒與內(nèi)參U6上下游引物由廣州銳博生物有限公司提供。實時熒光定量PCR 檢測使用BIO-RAD CFX96 型儀器(美國BIO-RAD 公司)。
1.3 方法
1.3.1 采集樣本 所有研究對象靜脈采血3 mL,采用EDTA 抗凝劑,在3 300 r/min 下離心16 min,然后,選取血漿,放置于Eppendorf 管,在10 ℃的環(huán)境下,進行15 000 r/min 離心7 min,去除雜質(zhì)和細胞碎片,將血漿于-80 ℃冰箱保存及以備。選取胰腺原發(fā)腫瘤組織及距離腫瘤邊緣至少5 cm 的癌旁正常組織,在12 min 內(nèi)放置液氮保存。取液氮保存胰腺組織約500 mg,研磨至極細碎末狀,加入1 mL Trizol,用于提取總RNA。
1.3.2 總RNA 提取 在凍存的血漿進行復(fù)溫,嚴格按照提取RNA 說明書進行操作。采用紫外分光光度儀測定所提取RNA 的濃度及純度,其A260/A280 比值應(yīng)在1.5~2.0 間,用于進一步實驗。
1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照說明書進行操作逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中的特異性反轉(zhuǎn)錄引物和合成cDNA,逆轉(zhuǎn)錄體系20 μL,逆轉(zhuǎn)錄條件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃保存逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
1.3.4 qPCR 反應(yīng) qPCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照試劑盒說明書進行操作。
1.3.5 胰腺癌細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1 細胞加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培 養(yǎng) 液10 mL,4 ℃以800 r/min 離 心5 min,棄去上清液,重懸后將細胞加入RPMI 1640 培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞融合至80%~90%時傳代。(1)四甲基偶氮唑鹽(4-methylcyclohexanone,MTT)法檢測細胞增殖[10]:分別以每孔103細胞密度將3 組人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1 細胞接種于96 孔培養(yǎng)板,以培養(yǎng)液為空白對照,分別培養(yǎng)1、2、3、4 d。每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后終止培養(yǎng),棄去培養(yǎng)液,加入二甲基亞砜150 μL,振蕩、室溫孵育10 后,測定波長493 nm 處各孔吸光度(A 值)。繪制細胞生長曲線是根據(jù)時間擬為橫坐標(biāo),根據(jù)A 值擬為縱坐標(biāo)。(2)克隆形成實驗:以100、200、400 個細胞的密度分別將3 組人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1 細胞接種于培養(yǎng)皿中,靜止培養(yǎng)2 周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(≥50 個細胞的為一個克?。K止培養(yǎng),棄去培養(yǎng)液。平板克隆形成率=形成克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。(3)劃痕實驗:收集各組細胞,以5×103/L 密度接種于96 孔板中,待細胞融合約90%,用槍頭沿著與皿底垂直方向劃痕,PBS 洗滌3 次,加入無血清培養(yǎng)基,放置在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱24 h 后,觀察細胞遷移軌跡,拍照記錄。
1.4 靶基因的預(yù)測 應(yīng)用生物信息學(xué)軟件TargetScan 6.2、miRDB 和PicTar 預(yù)測miRNA-10 的靶基因,發(fā)現(xiàn)PTEN 基因可能為其潛在的靶基因。
1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,計量資料用(±s)表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析;計數(shù)資料以率(%)表示,比較采用χ2檢驗;采用Spearman 分析CRC 患者血清miRNA-10 與PTEN 表達水平的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 兩組一般資料比較 研究組,男50 例,女30 例;年齡37~68 歲,平均(57.91±5.36)歲;根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(UICC)胰腺癌TNM 分期標(biāo)準[10]:Ⅰ期3 例,Ⅱ期27 例,Ⅲ期28 例,Ⅳ期22 例。對照組,男45 例,女35 例;年齡45~65 歲,平均(56.39±5.24)歲。兩組性別、年齡比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。
2.2 兩組血漿中miRNA-10 和PTEN mRNA 的表達水平比較 經(jīng)實時熒光定量PCR 檢測,結(jié)果顯示研究組血漿中miRNA-10 mRNA 表達水平為(5.37±1.48),高于對照組的(0.46±0.24),PTEN mRNA表達水平為(0.34±0.13),低于對照組的(7.86±1.64),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=23.69,P=0.000;t=29.18,P=0.000)。
2.3 研究組組織中miRNA-10、PTEN mRNA 表達與病理特征及臨床分期的關(guān)系 不同TNM 分期患者miRNA-10、PTEN mRNA 表達水平:Ⅰ期為(2.26±1.09)、(0.83±0.47),Ⅱ期 為(3.17±1.83)、(0.58±0.31),Ⅲ期 為(5.04±2.06)、(0.29±0.16),Ⅳ期為(6.13±2.47)、(0.29±0.16)。不同TNM 分期患者miRNA-10 和PTEN mRNA 表達水平比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=820,P=0.000;F=1 170,P=0.000)。
2.4 miRNA-10 和PTEN mRNA 在胰腺癌患者血漿中表達的相關(guān)分析 miRNA-10 和PTEN mRNA 在胰腺癌患者血漿中表達呈線性負相關(guān)(r=-0.716,P<0.01)。
2.5 miRNA-10 在胰腺癌患者血漿和組織中表達的相關(guān)分析 胰腺癌患者血漿中miRNA-10 的表達與癌組織中的miRNA-10 表達呈正相關(guān)(r=0.938,P<0.01)。
2.6 miRNA-10 過表達對PANC-1 細胞生長的影響 MTT 法檢測結(jié)果顯示,miRNA-10 細胞轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h 的A 值(10.92±1.68、19.85±2.43、25.07±3.52、33.49±4.82)均高于對照組(2.432±0.261、4.471±0.343、4.896±0.392、4.765±0.384),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.008,P=0.047;t=12.609,P=0.006;t=31.387,P=0.000;t=42.698,P=0.000),見圖1。
圖1 轉(zhuǎn)染miRNA-10 mimics分別在不同時間的PANC-1細胞生長
2.7 miRNA-10 過表達對PANC-1 細胞增殖的影響 平板克隆形成實驗檢測結(jié)果顯示:miRNA-10轉(zhuǎn)染2 周后,miRNA-10 轉(zhuǎn)染的細胞克隆數(shù)為(380±84)個,明顯高于對照組(70±17)個,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=36.26,P=0.000)。
2.8 miRNA-10 和PTEN 對PANC-1 細胞遷移的影響 劃痕實驗結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miRNA-10 分別在24、48 h 的PANC-1 細胞中,miRNA-10 劃痕間距為(168.29±8.92)和(141.36±4.86)μm,與對照組的(375.43±19.25)和(368.62±17.71)μm比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.293,P=0.000;t=16.897,P=0.000);PTEN 組為(368.34±18.34)和(359.37±18.38)μm,與對照組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.113,P=0.910;t=0.209,P=0.834),見圖2。
圖2 miRNA-10和PTEN對PANC-1細胞遷移的影響
由于miRNA-10 在多種惡性腫瘤組織中的表達具有促癌基因的活性,主要通過對下游靶分子轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控發(fā)揮生物效應(yīng)[12]。miRNA-10 的表達與乳腺癌、肺癌、肝癌等惡性腫瘤的發(fā)病有密切關(guān)系[13],特別是miRNA-10 在調(diào)控腫瘤細胞增殖和遷移這一方面起到至關(guān)重要的作用。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)miRNAs 在胰腺癌患者的表達上調(diào)[14],但是目前胰腺癌的發(fā)病機制仍未清楚。為了進一步研究miRNA-10 在胰腺癌中的作用機制,本研究采用實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測胰腺癌患者血漿和組織中miRNA-10 的表達,發(fā)現(xiàn)血漿miRNA-10 與胰腺癌病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān),隨著腫瘤惡性度的升高,miRNA-10 表達逐步增高,在胰腺癌伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者miRNA-10 表達明顯增高,并與分化程度相關(guān),miRNA-10 的表達水平在低分化腫瘤組織中高于高分化者。同時還發(fā)現(xiàn)miRNA-10 的表達在胰腺癌患者的血清中與癌組織中的表達呈正相關(guān)(r=0.938)。國外學(xué)者也發(fā)現(xiàn)miRNA-10 表達水平與治愈率和生存率呈負相關(guān),上述的研究結(jié)果表明了血漿miRNA-10 的表達水平在胰腺癌的發(fā)展及惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用,可作為胰腺癌患者預(yù)后評價的指標(biāo)。
miRNA 通過調(diào)控結(jié)合靶基因而發(fā)揮作用,miRNA-10的靶基因 有PTEN,RECK,TIMP-3,SPRY1、PI3K/AKT、Wnt/β-catenin[15]。有研究認為PTEN 是miRNA-10的靶基因,miRNA-10 高表達能促進惡性腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。Lee 等[17]采用敲除PTEN 基因發(fā)現(xiàn)增加腫瘤細胞的惡性程度,促進了腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Jiang 等[18]研究胰腺癌患者的PTEN 基因突變在腫瘤Ⅲ分期患者居多,隨著腫瘤浸潤深度增加其預(yù)后就較差。本課題組通過對多種靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫進行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)張力蛋白同源物基因(PTEN)可能是miRNA-10 的下游靶點,PTEN 是腫瘤抑制基因,具有脂質(zhì)和蛋白雙重磷酸活性,在細胞生長、增殖、生存、凋亡、血管生成、細胞遷移和侵襲等方面發(fā)揮重要作用。PTEN 在腫瘤中表達下調(diào)或者發(fā)生缺失突變時,可激活PI3K/Akt 信號通路,從而引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。
PTEN 基因是目前發(fā)現(xiàn)的具有磷酸激酶活性的抑癌基因,人類許多惡性腫瘤中存在著PTEN 功能的失活,并與腫瘤進展有密切相關(guān)[19]。Zhang等[20]檢測胰腺癌癌組織PTEN 蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織(對照組)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),提示PTEN 蛋白表達下調(diào)在胰腺癌癌的發(fā)生過程中起到極為不良的事件。因此,PTEN 表達水平下調(diào)提示在一定的程度上促進細胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤轉(zhuǎn)移。結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn),采用實時熒光定量PCR 檢測PTEN mRNA 的表達量,隨著病情進展,胰腺癌細胞增殖越活躍、分化程度越低,惡性程度就越高、PTEN mRNA 的表達呈下降趨勢,提示PTEN 表達下調(diào)與胰腺癌細胞生長和增殖有密切相關(guān),Ⅰ期和 Ⅱ期分別與Ⅲ期和 Ⅳ期比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01和P<0.001)。近期Zou等[21]研究表明ncRNACASC2 上調(diào)PTEN 的活性,抑制PI3K-Akt 通路的作用,通過改善細胞和細胞間質(zhì)的相互作用,減弱腫瘤細胞的侵襲性。本研究結(jié)果也顯示,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PTEN mRNA 明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.001)。在T 分期的Ⅰ期→Ⅳ期胰腺癌組織PTEN mRNA 表達逐步下降(P<0.001)。以上結(jié)果表明在高侵襲、高轉(zhuǎn)移性的胰腺癌組織中的表達明顯降低或無表達,提示PTEN 表達的下調(diào)可能是腫瘤的侵襲程度和轉(zhuǎn)移增加的主要原因之一,促進胰腺癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移的作用。因此,PTEN 基因在一定程度上反映胰腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力等生物學(xué)行為特征[22]??傊?,隨著病情進展,患者的生存率下降,預(yù)示著患者預(yù)后極差。
Ma 等[23]研究表明miRNA-10 通過調(diào)控通路提高細胞轉(zhuǎn)移蛋白的表達水平而影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。Aguennouz 等[24]研究指出miRNA-10 與細胞轉(zhuǎn)移蛋白是相關(guān)聯(lián)基因,具有促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲的作用,設(shè)想在胰腺癌中也會存在這種效應(yīng)。本研究對轉(zhuǎn)染細胞的體外實驗表明:在miRNA-10的細胞轉(zhuǎn)染加速PANC-1 細胞生長;在細胞克隆實驗證實miRNA-10 過表達對PANC-1 細胞的增殖具有明顯促進的影響;細胞劃痕實驗結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染 miRNA-10 的PANC-1 細胞遷移能力高于PTEN 組和對照組。國外研究顯示miRNA-10 在細胞株和腫瘤組織呈高表達水平,并與患者的生存率成反比,提示miRNA-10 與腫瘤浸潤有密切相關(guān)[25]。本文采用qPCR 技術(shù)檢測胰腺癌患者血漿和組織中miRNA-10 的表達明顯上調(diào),并發(fā)現(xiàn)血漿miRNA-10 與胰腺癌病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān),隨著腫瘤惡性度的升高,miRNA-10 表達逐步增高,病理分期Ⅲ、Ⅳ期明顯高于Ⅰ、Ⅱ期,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。上述研究結(jié)果表明血漿miRNA-10 的水平可作為胰腺癌患者預(yù)后評價的指標(biāo)。本研究通過采用劃痕實驗研究miRNA-10 mimic 調(diào)控PTEN 在胰腺癌PANC-1 細胞生長和增殖能力水平,提示了miRNA-10 有很強的促進胰腺癌PANC-1 細胞的遷移能力,表明miRNA-10 高表達和PTEN 低表達均能夠明顯增加腫瘤細胞的遷移,這可能是由于miRNA-10 下調(diào)PTEN 基因,從而促進腫瘤細胞的侵襲和遷移能力。本文結(jié)果顯示miRNA-10 在胰腺癌患者血漿中的表達水平明顯高于健康對照組;PTEN 基因在胰腺癌患者血漿中的表達水平明顯低于健康對照組。兩者在胰腺癌患者血漿的表達呈負相關(guān)(r=-0.916),表明miRNA-10 負性調(diào)控PTEN 表達可能在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展及惡化過程中發(fā)揮重要作用。
綜上所述,miRNA-10 可以促進胰腺癌細胞的增殖和調(diào)控細胞凋亡過程,提示miRNA-10 在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用,PTEN 可能是miRNA-10 作用靶點,miRNA-10 的作用是通過負性調(diào)控PTEN 基因參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移,為胰腺癌的輔助診斷提供一個新的檢測指標(biāo),也為胰腺癌基因治療的一個新靶點。