楊 琳，張金玲，王莉菲，梁秀云

深圳市人民醫(yī)院·暨南大學第二臨床醫(yī)學院·南方科技大學第一附屬醫(yī)院婦科，廣東 深圳 518020

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%。近年來，子宮內(nèi)膜癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率有上升及年輕化趨勢，是威脅女性健康重要的疾病之一［1-4］。子宮內(nèi)膜癌的病因并不十分清楚，越來越多的學者認為，所有導致腫瘤的機理是直接或間接影響了細胞周期調(diào)控因子的正常運轉(zhuǎn)，細胞周期持續(xù)演進，細胞進入自主的無約束的增殖和分裂，表現(xiàn)出旺盛的增殖活性進而產(chǎn)生惡性轉(zhuǎn)化。因此，段光明等［5］認為腫瘤是一類細胞周期病。透明質(zhì)酸結合蛋白1（hyaluronan binding protein 1, HABP1）和細胞周期蛋白A（Cyclin A）都是細胞周期的正向調(diào)節(jié)因素，其表達規(guī)律的改變是細胞周期破壞的重要特征之一。HABP1是一種多功能蛋白，其獨特的晶體結構和多種生物學特性，可以與多種細胞蛋白發(fā)生作用。是線粒體凋亡信號通路的一個重要調(diào)節(jié)因子，涉及介導細胞—細胞及細胞—基質(zhì)間的黏附、細胞信號的轉(zhuǎn)導等方面。近年來的研究發(fā)現(xiàn)［6-8］，HABP1 在一些腫瘤組織中呈現(xiàn)異常表達，同時參與某些腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲過程，而且與化療藥物誘導的細胞凋亡存在著密切關系。Cyclin A 是細胞周期驅(qū)動機制中的一個重要調(diào)控因子，其異常表達可導致細胞周期調(diào)節(jié)失控，促進細胞在DNA復制不完全時即進入M 期，從而直接或間接地導致細胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的形成。HABP1 和Cyclin A 在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)異常表達（如肝癌、食管癌、乳腺癌等），參與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲過程，并可以預示腫瘤的生物學行為和臨床結果。直到現(xiàn)在，國內(nèi)外尚無關于HABP1和Cyclin A在子宮內(nèi)膜癌組織表達相關性的研究報道。本研究擬通過采用免疫組織化學染色法檢測Cyclin A及HABP1在正常子宮內(nèi)膜、非典型增生子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜腺癌中的表達，研究和探討其表達水平與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理參數(shù)之間的關系，進一步探究二者之間有無關聯(lián)性，以期初步求證Cyclin A 及HABP1 可否成為早期預測子宮內(nèi)膜癌發(fā)生和判斷子宮內(nèi)膜癌預后的標志物?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015—2017年樣本醫(yī)院手術存檔的資料，采取隨機隨機抽樣的方法分為3 組：（1）正常子宮內(nèi)膜組織標本20例。（2）來源于手術切除的子宮內(nèi)膜非典型增生組織標本或同期宮腔鏡檢查獲得的子宮內(nèi)膜非典型增生組織標本24 例。（3）子宮內(nèi)膜腺癌組織56 例，組織學分級G1 組18例、G2 組20 例、G3 組18 例；有淋巴結轉(zhuǎn)移14 例，無淋巴結轉(zhuǎn)移42 例；參照FIGO（2009 年）的分類標準，Ⅰ期和Ⅱ期32 例，Ⅲ期和Ⅳ期24 例；肌層浸潤＞1/2 的21 例，肌層浸潤≤1/2 的35 例。標本來源的所有患者均未做化療或放療。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色 （1）切片脫蠟至水：石蠟切片依次放入二甲苯I→二甲苯II→二甲苯:無水酒精（1:1）→無水酒精I→無水酒精II→95%乙醇→80%乙醇→70%乙醇→50%乙醇脫蠟至蒸餾水。（2）切片染色：①石蠟切片從蒸餾水中拿出放入PBS 中浸泡5 min。②置于90 ℃抗原修復液中進行抗原修復6～7 min。③3%過氧化氫（H2O2）（無色液體）去離子水孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。緩沖液洗H2O2。④滴加5%BSA 封閉液，室溫孵育10～15 min，傾去，勿洗。封閉組織蛋白，以防止非特異性反應。⑤直接滴加200 倍稀釋的抗人Cyclin A 單抗，濕盒中37 ℃孵育2 h 后PBS 沖洗，3 min×3 次；隨后進行陰性對照組染色：用0.01 mol/L PBS 代替單抗。⑥滴加二抗，室溫孵育20 min 后PBS 沖洗，3 min×3 次。⑦滴加SABC，室溫孵育20 min 后PBS 沖洗，3 min×3 次。⑧DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色效果。陰性對照組不染色而實驗組染色之后停止顯色，放入蒸餾水中充分沖洗（3 min×3次）。⑨蘇木素染細胞核1 min→蒸餾水洗1 min→分色液分色30 s→自來水中返藍2 h。⑩梯度乙醇脫水（流程中每個環(huán)節(jié)2 min，過程與脫蠟至水相反），二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.2 圖像分析 HABP1 和CyclinA 主要表達于細胞漿中，呈棕黃色。免疫組織化學染色的切片在光學顯微鏡下觀察，顯微圖像分析系統(tǒng)進行數(shù)字成像，并采集圖片，計算光密度值（IOD），分析各組之間的HABP1 和Cyclin A的平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)值連續(xù)變量以均數(shù)±標準差（±s）表示。用t 檢驗進行不同臨床分期和有無淋巴結轉(zhuǎn)移以及肌層浸潤深度分析。采用方差分析子宮內(nèi)膜腺癌、非典型增生子宮內(nèi)膜與正常子宮內(nèi)膜間差異、子宮內(nèi)膜腺癌不同分化程度間差異。Cyclin A 和HABP1 相互關系采用相關性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HABP1和Cyclin A在不同子宮內(nèi)膜組織免疫組織化學染色結果

子宮內(nèi)膜腺腺癌根據(jù)其分化程度分為三級，G1：高分化腺癌，腺體較規(guī)則，可見復層細胞，細胞排列緊密；G2：中等分化腺癌，腺體很不規(guī)則，部分癌組織呈實體結構。癌細胞呈單層或復層緊密排列；G3：低分化腺癌，腺體結構很少見或極不規(guī)則，癌巢多呈實性。HABP1 和Cyclin A 抗體染色的樣本陽性區(qū)主要是子宮內(nèi)膜細胞漿中，可以看到對應組織學分級所具有的典型的形態(tài)特征。HABP1 和Cyclin A 在子宮內(nèi)膜組織的免疫組織化學染色結果見圖1和圖2。

圖1 CyclinA在子宮內(nèi)膜組織化學染色結果

圖2 HABP1在子宮內(nèi)膜組織化學染色結果

2.2 HABP1和Cyclin A在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達

三組患者HABP1 和Cyclin A 的表達呈逐漸上升的趨勢。在非典型增生子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜癌組，二者的表達均高于在正常子宮內(nèi)膜組的表達水平，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。非典型增生子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜癌兩組間HABP1 和Cyclin A 的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 HABP1和Cyclin A在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達

2.3 HABP1和CyclinA在各子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達

HABP1 和Cyclin A 的表達在低分化組明顯高于高分化組和中分化組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在肌層浸潤深度＞1/2 的子宮內(nèi)膜腺癌中，表達明顯高于肌層浸潤深度≤1/2 的子宮內(nèi)膜癌，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在有淋巴結轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜腺癌中，表達也明顯高于無淋巴結轉(zhuǎn)移組的子宮內(nèi)膜癌，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。由此可見，子宮內(nèi)膜腺癌的組織分化越差、肌層浸潤越高。

表2 HABP1和Cyclin A在各子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達（±s）

表2 HABP1和Cyclin A在各子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達（±s）

a 表示與正常子宮內(nèi)膜組比較，P＜0.05；b 表示與子宮內(nèi)膜非典型增生組比較，P＜0.05。

組別臨床分期Ⅰ期+Ⅱ期（n=32）Ⅲ期+Ⅳ期（n=24）組織分化G1（n=18）G2（n=20）G3（n=18）肌層浸潤＞1/2（n=21）無或≤1/2（n=35）淋巴結轉(zhuǎn)移陰性（n=42）陽性（n=14）HABP1表達Cyclin A表達1 083.87±463.47 2 381.01±898.79a 737.17±294.47 2 994.01±1 142.76a 395.47±171.86 834.31±275.18a 2 149.31±923.18b 559.47±314.46 1157.31±824.09a 1 949.31±1 026.31b 2 106.31±837.62a 1 374.82±324.91 2 586.47±938.29a 984.71±424.03 879.41±355.14 2 516.31±792.65a 946.26±381.61 2 706.35±972.41a

2.4 HABP1和Cyclin A的相互關系

HABP1 和Cyclin A 間存在呈正相關，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 HABP1和Cyclin A的相互關系

3 討論

子宮內(nèi)膜癌的病因尚不明確，侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤治療失敗、臨床預后不良的重要生物學原因。影響預后的因素較為復雜，年齡、腫瘤分期、組織學分級、肌層浸潤深度和淋巴結轉(zhuǎn)移是公認的影響其預后的獨立危險因素。

誘發(fā)惡性腫瘤有多種原因，如抑癌基因的缺失、生長因子信號轉(zhuǎn)導通路的持續(xù)和癌基因的過度擴增等。近年來越來越多的學者注意到細胞生長周期的失調(diào)在腫瘤的發(fā)生中起重要作用。有研究［5］認為腫瘤是一類細胞周期病。腫瘤的本質(zhì)是細胞失控性生長—增殖過度和凋亡減少。幾乎所有癌基因的功能效應，最終都會匯聚到細胞周期機制上來。

HABP1 和Cyclin A 都是細胞周期的正向調(diào)節(jié)因素，其表達規(guī)律的改變是細胞周期破壞的重要特征之一。異常表達導致細胞異常增殖不僅涉及腫瘤的起始階段，而且促進細胞癌變的發(fā)生和使腫瘤組織具有侵襲、轉(zhuǎn)移和復發(fā)的能力，其過度表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、不良預后有關。

一般情況下，細胞周期驅(qū)動機制調(diào)控異常，細胞就會進入非正常狀態(tài)，即病理狀態(tài)，從而出現(xiàn)如細胞轉(zhuǎn)化、癌變等異常情況。Cyclin A 正是細胞周期驅(qū)動機制中的一個非常重要的因子。目前研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin A 基因位于染色體4q27 上，是432 個氨基酸組成的球形結構，由12 個a 螺旋形成（它是兩段分別由90個左右的氨基酸形成的相似折疊）。相對分子質(zhì)量為60×103，它在DNA 開始合成前即出現(xiàn)。有證據(jù)證實，如果把Cyclin A抗體或反義質(zhì)粒注入G1期培養(yǎng)的組織細胞中，可以阻止細胞進入S 期［7］。Cyclin A 在G1→S 轉(zhuǎn)換中起著非常重要的作用。在哺乳動物組織細胞培養(yǎng)中，Cyclin A 與p33cdk2 結合形成復合體，在G1晚期開始增多，調(diào)節(jié)細胞增殖并進入S 期，于S 期和G2 期達到峰值，Cyclin A/p33cdk2 激酶在G1→S 轉(zhuǎn)換過程中被活化且存在于S 期的細胞核中［7］，具有促進有絲分裂的作用。Cyclin A 異常表達可導致細胞周期調(diào)節(jié)失控，促進細胞在DNA 復制不完全時即進入M 期，從而直接或間接地導致細胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的形成［8］。

近年來的研究表明，很多腫瘤組織中HABP1 和Cyclin A 都表達過度，而且參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，故它可以預示腫瘤的臨床結果及生物學行為。例如：在肝癌組織的細胞中，低分化肝癌組中Cyclin A 陽性表達比高分化肝癌組明顯升高。所以，細胞分化越差，Cyclin A 的表達越高［9］。在星形細胞瘤中，Cyclin A表達與腫瘤病理分級顯著相關［10］。Cyclin A 陽性表達與喉鱗癌病理組織學分級呈負相關［11］。

HABP1是透明質(zhì)酸黏素家族中的一個特殊成員，它能夠特異性的與透明質(zhì)酸結合［12］。生理條件下，HABP1 主要以一種非共價鍵連接的三聚體形式存在，在氧化環(huán)境中，以六聚體的形式存在，這一六聚體形式使HABP1 與其配體結合的能力大大提高［13］。不同類型的細胞在不同的生理條件下，HABP1可存在于不同的細胞器中，除了線粒體外，還可出現(xiàn)在細胞核、細胞漿及細胞膜上。根據(jù)HABP1的結構特點及這種生物學特性，推測它是一種多功能蛋白，參與細胞內(nèi)的分子運輸，以連接不同細胞器間的信號轉(zhuǎn)導記憶連接細胞器和細胞膜之間的信號轉(zhuǎn)導。HABP1與細胞凋亡之間的關系是近年來的研究熱點。有研究［14-16］發(fā)現(xiàn)，HABP1 可以通過多條通路誘導細胞凋亡。HABP1與透明質(zhì)酸具有很高的親和力， HABP1通過與HA結合介導細胞內(nèi)和細胞間的信號轉(zhuǎn)導，具有促進細胞黏附的特性。透明質(zhì)酸是構成細胞外基質(zhì)和細胞間質(zhì)的主要成分，不僅對維持組織結構、促進細胞黏附、活化和遷移以及細胞信號的轉(zhuǎn)導有著重要作用，而且還是促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移、引發(fā)腫瘤細胞抗藥反應的主要物質(zhì)。盡管在腫瘤細胞的HABP1 基因中并未發(fā)現(xiàn)有腫瘤特異性的突變位點，但是HABP1 蛋白在許多惡性腫瘤組織中呈高表達。Rozanov等［17］研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞株中有HABP1蛋白的過度表達。用抗HABP1 的單抗對甲狀腺癌、卵巢癌、結腸癌、胰腺癌、胃癌、食管癌以及肺腺癌組織中進行免疫組化染色，與各自的非惡變組織進行對照，結果顯示，HABP1蛋白在這些癌組織中呈高表達，同時發(fā)現(xiàn)，HABP1高表達的腫瘤中HA 的含量也是升高的，說明HABP1 與HA 間的相互作用可能與腫瘤有關［18］。由此可見，根據(jù)HABP1 所介導的各種功能來看，HABP1 可能是惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中一個重要的調(diào)節(jié)因子。盡管已有研究證實在多種腺癌組織中HABP1 蛋白呈高表達，但是在子宮內(nèi)膜癌中的表達情況及其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，國內(nèi)無報道，國外報道也較少。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)， HABP1 和Cyclin A 的表達呈逐漸上升的趨勢。在非典型增生子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜腺癌組，二者的表達均高于在正常子宮內(nèi)膜組的表達水平，差異有統(tǒng)計學意義。從前文的分析可見，子宮內(nèi)膜癌的組織分化越差、肌層浸潤越深、臨床分期越晚，HABP1 和Cyclin A的表達越高。這提示了HABP1和Cyclin A不僅參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生，而且與子宮內(nèi)膜癌進展有關，還參與了子宮內(nèi)膜癌腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲過程。

綜上所述，本實驗結果表明，HABP1 和Cyclin A 參與子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移，異常高表達可作為子宮內(nèi)膜癌的早期預測和子宮內(nèi)膜病變不同階段的診斷的參考指標。