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        高效液相色譜法測定西咪替丁片中的有關物質(zhì)和含量

        2022-12-31 11:28:32劉振麗
        黑龍江醫(yī)藥 2022年15期
        關鍵詞:檢測

        劉振麗,徐 麗

        駐馬店市食品藥品檢驗所食品藥品檢驗科,河南 駐馬店 463000

        西咪替丁片屬于H2 受體拮抗劑,具有較強的抑酸作用,是臨床治療胃酸過多、胃潰瘍等胃部疾病的常用藥物[1-2]。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn),西咪替丁片還具有治療病毒所致的哮喘、黏膜出血和抗癌等功效[3]。故準確檢測西咪替丁片中的有關物質(zhì)和含量對后續(xù)臨床治療具有積極意義。紫外-可見分光光度法是檢測西咪替丁含量的重要方式,但難以檢測西咪替丁片中的有關物質(zhì)。高效液相色譜法(HPLC)為色譜法重要分支,具有靈敏度高、可靠性高等優(yōu)點,以液體為流動相,借助高壓輸液系統(tǒng),能夠?qū)⒉煌瑯O性單一溶劑或不同比例混合溶劑等流動相泵入色譜柱內(nèi),從而分離各種成分,并進入檢測器檢測,故被廣泛應用于多種藥物的測定中[4-5]。本研究分析高效液相色譜法測定西咪替丁片中的有關物質(zhì)和含量,為臨床用藥提供參考,現(xiàn)報告如下。

        1 資料與方法

        1.1 儀器與材料

        (1)儀器。高效液相色譜儀(Agilent LC1260 型,美國安捷倫);Hypersil C18色譜柱(5 μm,250 mm×4.6 mm);sartorius MSA225S 電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司產(chǎn)品);PHS-3C 型酸度計(上海精密科技雷磁);紫外燈254(上??扑嚬鈱W儀器廠)。(2)材料。西咪替丁片(一力制藥股份有限公司,規(guī)格:0.2 g,國藥準字:H44023079,批號:20191208);西咪替丁對照品(中國食品藥品檢定研究院,純度為99.8%,批號:20191115)。乙腈、甲醇(色譜純)。過氧化氫、氫氧化鈉、鹽酸、己烷磺酸鈉、磷酸(分析純)。

        1.2 方法與結果

        1.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 以Kromasil C18 作為色譜柱,以甲醇—水—乙腈(250∶680∶70,每1 000 mL中含0.5 mL 磷酸和1.081 g 己烷磺酸鈉) 作為流動相,檢測波長為220 nm,流速1.0 mL/min,進樣量調(diào)整為10 μL,以室溫為柱溫度。精密稱取適量西咪替丁對照品,用流動相溶解、稀釋制成每1 mL中含有100 μg西咪替丁的溶液,取10 mL,滴加0.2 mL 的3%過氧化氫,置入水浴中加熱,時間為20 min,待其冷卻,即可獲得系統(tǒng)適用性試驗溶液。取上述溶液10 μL,加入液相色譜儀實施檢測,記錄色譜圖,按西咪替丁峰計算≥6 000為理論板數(shù),與西咪替丁相鄰有關物質(zhì)峰和西咪替丁峰間的分離度≥6。

        1.2.2 流動相優(yōu)選 用240∶760 比例的甲醇—水(每1 000 mL 中含0.3 mL 磷酸和0.94 g 己烷磺酸鈉)作為流動相測定時,前3 min 噪音值偏大,基線不易走穩(wěn),峰形拖尾、變鈍,甚至有峰裂現(xiàn)象出現(xiàn)。當用200:760:40 比例的甲醇—水—乙腈(每1 000 mL 中含0.5 mL 磷酸和1.081 g己烷磺酸鈉)作為流動相測定時,分離度變小,出峰時間變長,無峰裂和拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)。用250∶680∶70比例的甲醇—水—乙腈(每1 000 mL 中含0.5 mL 磷酸和1.081 g 己烷磺酸鈉)作為流動相測定時,峰形完美,峰形對稱、變銳,無拖尾現(xiàn)象出現(xiàn),可更好的分離有關物質(zhì)中某些成分,最終以250∶680∶70 比例的甲醇—水—乙腈作為流動相。

        1.2.3 測定方法 (1)含量測定。取20 片西咪替丁,研成細粉,取約200 mg 西咪替丁,加入量瓶(200 mL)中,滴加150 mL 鹽酸,振搖,使其充分溶解,再使用鹽酸稀釋至刻度,充分混勻后,濾過,取10 mL 續(xù)濾液,用250:680:70比例的甲醇—水—乙腈稀釋至100 mL,混勻后作為供試品溶液,取10 μL,根據(jù)1.2.1 色譜條件,加入高效液相色譜儀,對色譜圖紀錄。另外取適量西咪替丁對照品,加入之前獲取的溶液,稀釋呈等同于供試品溶液濃度,作為對照組溶液,測定方法同上。以峰面積計算含量,檢測含量為RSD 為0.6%,標識量為99.7%。(2)有關物質(zhì)測定。取之前獲取的供試品溶液1 mL,加入刻度為200 mL量瓶中,滴加250∶680∶70 比例的甲醇—水—乙腈至刻度,充分混勻后作為對照溶液,取10 mL 加入高效液相色譜儀,對檢測敏感度調(diào)節(jié),確保主成分色譜峰的峰值高度為滿量程的20%~25%。在兩區(qū)10 μL對照溶液和10 μL供試品溶液,按照1.2.1色譜條件,加入高效液相色譜儀,對色譜圖記錄。若供試品溶液有有關物質(zhì)峰顯現(xiàn),各有關物質(zhì)峰的峰面積之和≤對照溶液主峰的面積,單個有關物質(zhì)峰的峰面積≤對照溶液主峰面積的40%。

        1.2.4 專屬性試驗 取配置好的對照品溶液50 mL,分為5 份,1 份用紫外燈(254 nm)照射1 d,2 份分別加入0.2 mL 的2 mol/L 鹽酸溶液和0.2 mL 的2 mol/L 氫氧化鈉,水浴加熱20 min,待其冷卻后加入氫氧化鈉溶液1 mol/L和鹽酸溶液1 mol/L,將pH值調(diào)節(jié)成中性。1份加入0.2 mL的3%過氧化氫溶液,水浴加熱20 min后冷卻,另外1份水浴加熱3 h后冷卻。量去上述處理后的溶液各10 μL,根據(jù)

        1.2.1色譜條件,對降解產(chǎn)物實施試驗。本色譜條件能滿足有關物質(zhì)檢查的系統(tǒng)適用性要求:經(jīng)氧化、酸、堿、光照、高溫條件破壞的溶液的色譜圖中均產(chǎn)生程度不一的有關物質(zhì)峰,均與主成分峰分離良好。

        1.2.5 線性回歸試驗 在100 mL 量瓶中加入0.012 32g 西咪替丁對照品,加入250∶680∶70比例的甲醇—水—乙腈溶解,稀釋成對照品溶液,其含有123.2 μg/mL 西咪替丁,取上述對照液20 mL、15 mL、10 mL、5 mL、2 mL、1 mL,分別用上述流動相稀釋、定容,獲取7個梯度不一的溶液,范圍4.928~123.2 μg/mL,各取10 μL,按照1.2.1色譜條件進樣,對色譜圖紀錄。線性回歸以峰面積A 對濃度C 作為條件檢測,線性關系良好,r=0.999 8,Y =31.841 3X-3.877 30。

        1.2.6 定量限、檢測限試驗 (1)定量限。精密稱取適量西咪替丁對照品,加250∶680∶70 比例的甲醇—水—乙腈,稀釋、溶解制成含5.136 μg/mL 西咪替丁的溶液,根據(jù)1.2.1 色譜條件取10 μL 進樣,定量限為5 136 ng,結果(S/N)為10∶1。(2)檢測限。精密稱取適量西咪替丁對照品,加250∶680∶70比例的甲醇—水—乙腈,稀釋、溶解制成含1.035 μg/mL 西咪替丁的溶液,根據(jù)1.2.1 色譜條件取10 μL 進樣,對色譜圖紀錄,檢測限為1 035 ng,結果(S/N)為2∶1。

        1.2.7 系統(tǒng)精密度、溶液的穩(wěn)定性試驗 取10 mL 1.2.3下獲取的對照品溶液,根據(jù)1.2.1 色譜條件實施6 次重復進樣,對液相色譜圖紀錄,RSD為0.4%,以峰面積計算,結果顯示精密度良好。取上述供試品溶液,室溫下放置,分別與0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h測定,有關物質(zhì)和主成分峰面積的RSD 分別為0.5%、0.3%,提示24 h 內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

        1.2.8 加樣回收率試驗 分別在25 mL量瓶中加入1.2.3下獲取的對照品溶液3 mL、2 mL、1 mL,分別加入1.2.3 制備的10 mL供試品溶液,加入250∶680∶70比例的甲醇—水—乙腈稀釋至刻度,根據(jù)1.2.1 色譜條件進樣10 μL,對色譜圖紀錄,結果顯示3 個濃度的回收率為100.2%、99.7%、99.8%,RSD 分別為0.3%、0.5%、0.4%,平均回收率為99.9%。

        2 討論

        西咪替丁能夠競爭性結合壁細胞上分布的H2 受體,抑制組胺,拮抗胃酸分泌,與其他H2 受體拮抗劑相比,抑酸作用較強,被廣泛應用于胃潰瘍、上消化道出血、十二指腸潰瘍等疾病治療[6-7]。西咪替丁還能調(diào)節(jié)機體免疫功能,使T 淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率提高,增強抗組胺作用,使毛細血管的通透性提高,減少前列腺素縮放,降低發(fā)熱反應所需的介質(zhì),起到降溫作用,能夠使病毒對皮膚的損傷減小,還能減輕因組胺所致的水腫、出血等癥狀[7-8]。另外,西咪替丁的主要吸收部位為消化道上端,藥物并未完全釋放,降低生物利用度。故準確檢測西咪替丁片含量及其有關物質(zhì)和含量對于臨床治療方案的制定至關重要。

        紫外-可見分光光度法、色譜-質(zhì)譜法、流動注射-抑制化學發(fā)光法等常用的藥物含量檢測方式,均存在一定局限性,如紫外-可見分光光度法敏感度低。色譜-質(zhì)譜法檢測設備昂貴,難以在基層醫(yī)院推廣。流動注射-抑制化學發(fā)光法操作繁瑣等[9-10]。HPLC 法是色譜法的一個重要分支,以液體為流動相,用高壓輸液系統(tǒng)將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的緩沖液、混合溶劑等流動相泵入裝有固定相的色譜柱,分離柱內(nèi)各成分后置入檢測器實施檢測,最終分析試樣,已成為工業(yè)、農(nóng)學、化學、醫(yī)學等學科領域中重要的分離分析技術[11-13]。HPLC 法系統(tǒng)的組成主要包括高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、色譜柱及檢測器,其中高壓輸液系統(tǒng)是由脫氣裝置、貯液罐、過濾器、高壓輸液泵及梯度洗脫裝置組成,貯液罐位置需高于泵體,維持良好輸液靜壓差,且使用過程中需密閉,避免蒸發(fā)所致流動相組成變化,且能阻止氣體進入。脫氣裝置則能夠幫助流動相使用前唾棄,避免進入系統(tǒng)低壓部分后逸出氣泡,從而確保柱分離效率,降低對檢測器靈敏度的影響。高壓輸液泵則為關鍵部件,能夠完成流動相輸送,此外進樣系統(tǒng)、色譜柱、檢測器均具有重要作用,多部件組成的高效液相色譜儀方可獲得選擇性好、分離效能高、分析速度快、適用范圍廣等特點,且兼具分離及分析功能,可實現(xiàn)在線檢測。本研究中,西咪替丁與有關物質(zhì)分離好,其與周圍的有關物質(zhì)峰分離度>9。濃度范圍在4.928~123.2 μg/mL,線性關系良好,r=0.999 8。加樣平均回收率為99.9%。測定西咪替丁檢測限與定量限分別為1.035 μg/mL、5.136 μg/mL,提示HPLC 法檢測敏感度高、專屬性強、結果準確,可用于檢測西咪替丁片的含量與有關物質(zhì)的測定。HPLC 法分析原理在于能夠改變流動相極性,使得樣品各組成在最佳條件下分離,且分離過程與其他色譜一樣,也需溶質(zhì)在固定相、流動相間進行多次連續(xù)交換,借助溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、吸附力、親和力或分子大小不同引起的排阻作用差來分離不同溶質(zhì)[15-16]。HPLC 法檢測具有以下幾點優(yōu)勢:分析速度快、載液流速快,一般分析一個樣本所需15~30 min,部分樣本可在5 min 內(nèi)完成,速度明顯高于經(jīng)典液體色譜法速度。分離效能高,可經(jīng)選擇流動相、固定相,以達到最佳分離效果,遠高于氣相色譜及工業(yè)精餾塔的分離效能[17]。紫外檢測器可達0.01 ng,進樣量在μL 數(shù)量級,敏感度較高??煞治?0%以上的有機化合物,尤其能夠分離大分子、高沸點、熱穩(wěn)定性差、強極性等化合物的分離,應用范圍廣。色譜柱可反復使用、樣品量少、容易回收。

        綜上所述,HPLC 法檢測具有快速、準確、操作簡便、專屬性強等優(yōu)點,可用于檢測西咪替丁片的含量與有關物質(zhì)的測定。

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