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        巨大戟醇甲基丁烯酸酯有關(guān)物質(zhì)的合成

        2022-09-14 03:00:48李彥赟孫傳騰
        天津藥學(xué) 2022年4期
        關(guān)鍵詞:酸酯硅基丁烯

        李彥赟,楊 昱,孫傳騰,吳 瀟

        (天津市中藥質(zhì)量控制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津中新藥業(yè)研究院有限公司,天津 300457)

        巨大戟醇甲基丁烯酸酯(ingenol mebutate,ingenol-3-angelate,巨大戟醇-3-當(dāng)歸酸酯,1)是從南歐大戟中分離得到的二萜類化合物,由丹麥利奧制藥開發(fā)為治療日光性角化病的外用凝膠劑,商品名為Picato?,2012年獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市[1],隨后在歐洲、澳大利亞、加拿大、韓國等30多個(gè)國家和地區(qū)上市。藥理研究表明,巨大戟醇甲基丁烯酸酯通過化療作用及免疫治療作用的雙重機(jī)制發(fā)揮治療日光性角化病的作用[2]:一方面迅速誘導(dǎo)畸變的角質(zhì)細(xì)胞壞死,另一方面誘導(dǎo)定向病損區(qū)的免疫應(yīng)答,通過嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴的細(xì)胞毒作用(ADCC)進(jìn)一步殺死異常細(xì)胞,因而可以在較短的治療周期中起到殺傷畸變細(xì)胞的作用。與其他用于治療日光性角化病的皮膚外用制劑(咪喹莫特、雙氯芬酸鈉等)相比,巨大戟醇甲基丁烯酸酯僅需用藥2~3 d即可,具有用藥周期短、患者依從性好的特點(diǎn)[3-4]。因其獨(dú)特的作用機(jī)制和顯著的臨床療效,入選國家藥品審評(píng)中心(CDE)《首批專利權(quán)到期、終止、無效且尚無仿制申請(qǐng)的藥品清單》且居于首位。大量臨床試驗(yàn)及案例報(bào)道顯示,巨大戟醇甲基丁烯酸酯對(duì)基底細(xì)胞癌、跖疣、尖銳濕疣、鮑恩病、黑色素瘤等與人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染、紫外線損傷相關(guān)的皮膚病具有良好改善作用,為近年來皮膚病研究領(lǐng)域的熱門藥物之一[5-9]。

        本文以巨大戟醇為起始物料,對(duì)巨大戟醇甲基丁烯酸酯的2個(gè)主要有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行合成,為其原料藥與制劑的質(zhì)量控制提供對(duì)照品合成方法。

        1 雜質(zhì)來源及合成路線

        巨大戟醇甲基丁烯酸酯為巨大戟醇的3位羥基當(dāng)歸?;纬傻孽ィ?-O-當(dāng)歸?;薮箨迹?,由于巨大戟醇結(jié)構(gòu)中4位、5位及20位均有游離羥基,故在貯存過程中會(huì)生成酯交換產(chǎn)物,酯交換產(chǎn)物5-O-當(dāng)歸酰基巨大戟醇(2,雜質(zhì)A,巨大戟醇-5-當(dāng)歸酸酯)、20-O-當(dāng)歸?;薮箨迹?,雜質(zhì)B,巨大戟醇-20-當(dāng)歸酸酯)含量也是原料藥及凝膠劑的關(guān)鍵質(zhì)量控制指標(biāo)(結(jié)構(gòu)見圖1),原研藥巨大戟醇甲基丁烯酸酯凝膠劑通過添加緩沖液控制pH值及低溫冷藏保存的方式控制兩種酯交換產(chǎn)物的生成[10-11]。

        圖1 巨大戟醇甲基丁烯酸酯及有關(guān)物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)

        雜質(zhì)A和雜質(zhì)B均無合成路線研究報(bào)道,市面上也沒有雜質(zhì)對(duì)照品銷售。利奧制藥生產(chǎn)巨大戟醇甲基丁烯酸酯凝膠劑所用的原料藥為從南歐大戟(Euphorbia peplus)的地上部分分離純化而獲得[12],其含量僅為0.000 11%。由于從南歐大戟中未分離到酯交換產(chǎn)物5-O-當(dāng)歸酰基巨大戟醇和20-O-當(dāng)歸?;薮箨迹兴幍碾s質(zhì)相關(guān)研究是將原料藥制備成溶液,經(jīng)長時(shí)間放置后分離獲得酯交換產(chǎn)物。該方法效率低,特定雜質(zhì)的收率不受控。

        巨大戟醇甲基丁烯酸酯的母核為經(jīng)典的二萜類化合物巨大戟醇(ingenol),此類化合物多以羧酸酯的形式廣泛存在于大戟屬植物中,簡單易得,其中千金子中含量高達(dá)0.07%,為市售巨大戟醇的主要來源[13]。本文以巨大戟醇為原料,利用選擇性保護(hù)基團(tuán)對(duì)3位、20位的羥基進(jìn)行保護(hù),將5位羥基當(dāng)歸酰化反應(yīng)后再脫去保護(hù)基,合成雜質(zhì)A。由于20位羥基的反應(yīng)活性強(qiáng)于其他游離羥基,可利用低溫反應(yīng)在20位進(jìn)行選擇性酯化,合成雜質(zhì)B。2種雜質(zhì)的合成路線見圖2和圖3。

        圖2 5-O-當(dāng)歸?;薮箨迹?,雜質(zhì)A)的合成路線

        圖3 20-O-當(dāng)歸?;薮箨迹?,雜質(zhì)B)的合成路線

        2 儀器與試劑

        2.1 儀器Waters e2695高效液相色譜儀(美國沃特世科技有限公司);Bruker AvanceⅡ400 MHz核磁共振儀(德國布魯克公司);BUCHI R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀[步琦實(shí)驗(yàn)室設(shè)備貿(mào)易(上海)有限公司];ACQUITY UPLC H-Class Quattro Micro API三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀(美國沃特世科技有限公司);METTLER TOLEDO MS105電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

        2.2 試劑 巨大戟醇(含量:98%,南京春秋生物工程有限公司,批號(hào)JDJC21900102);咪唑(批號(hào)LOA0Q79)、叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl,批號(hào)LB70Q66)、三乙基氯硅烷(TESCl,批號(hào)L160P47)購自北京百靈威科技有限公司;雙三甲基硅基胺基鋰(LiHMDS,批號(hào)SHBJ0605)購自sigma-aldrich公司;當(dāng)歸酸酐(批號(hào)GGB7K-UA)購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司(TCI);其他常規(guī)試劑均采購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

        3 合成方法

        3.1 20 -O-叔丁基二甲基硅基巨大戟醇(20-OTBDMS-ingenol,中間體1)的合成 稱取44.80 mg巨大戟醇(ingenol)至10 ml茄形瓶中,用2 ml無水二氯甲烷溶解,冰鹽浴控制溫度約-8℃,依次加入31.56 mg叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)、32.00 mg咪唑,攪拌反應(yīng)40 min,TLC檢測[石油醚-丙酮(3∶1)]反應(yīng)完全。加6 ml水?dāng)嚢?,用相同體積的乙酸乙酯萃取3次,乙酸乙酯層合并后減壓濃縮至干,經(jīng)快速硅膠柱色譜純化,洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯(3∶1),得到53.60 mg無色固體,利用核磁共振波譜法確證結(jié)構(gòu)為20-O-叔丁基二甲基硅基巨大戟醇(中間體1),收率為90%。

        1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ:5.98(1H,brd,J=4.2 Hz),5.89(1H,d,J=1.2 Hz),4.49(1H,d,J=4.4 Hz),4.31(1H,d,J=4.4 Hz),4.25-4.10(3H,m),4.04(1H,s),3.84(1H,d,J=4.2 Hz),2.76(1H,d,J=4.6 Hz),2.49-2.40(1H,m),2.26-2.36(1H,m),1.84(3H,d,J=1.0 Hz),1.79-1.70(1H,m),1.66(1H,s),1.11(3H,s),1.05(3H,s),0.95(3H,d,J=7.2 Hz),0.88(9H,s),0.74-0.63(1H,m),0.07(6H,d,J=2.1 Hz)。13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:206.8,139.5,138.4,129.4,127.6,84.5,80.7,76.3,72.3,68.2,43.9,39.5,31.0,28.6,25.9(3C),24.1,23.4,23.2,18.2,17.3,15.7,15.6,-5.1,-5.3。

        3.2 3 -O-三乙基硅基-20-O-叔丁基二甲基硅基巨大戟醇(3-O-TES-20-O-TBDMS-ingenol,中間體2)的合成 向10 ml茄形瓶中依次加入45.20 mg中間體1和57.60 mg咪唑,用2 ml無水二氯甲烷溶解,加入88 μl三乙基氯硅烷(TESCl),室溫?cái)嚢璺磻?yīng)40 min,TLC檢測[(石油醚-丙酮(20∶1)]反應(yīng)完全。加水6 ml攪拌,用相同體積的乙酸乙酯萃取3次,有機(jī)相合并后減壓濃縮至干,經(jīng)快速硅膠柱色譜純化,洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯(20∶1),得到41.20 mg無色固體,利用核磁共振波譜法確證結(jié)構(gòu)為3-O-三乙基硅基-20-O-叔丁基二甲基硅基巨大戟醇(中間體2),收率為73%。

        1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ:5.98(1H,brd,J=3.0 Hz),5.88(1H,d,J=1.4 Hz),4.51(1H,s),4.24(1H,d,J=13.0 Hz),4.11(1H,d,J=13.0 Hz),4.08-4.01(1H,m),3.82(1H,d,J=1.0 Hz),3.68(1H,d,J=9.8 Hz),3.15(1H,d,J=9.8 Hz),2.44-2.32(1H,m),2.24-2.16(1H,m),1.80(3H,d,J=1.0 Hz),1.79-1.68(1H,m),1.13(3H,s),1.05(3H,s),0.98(9H,t,J=8.0 Hz),0.96-0.86(12H,m),0.79(7H,q,J=7.8 Hz),0.04(6H,d,J=5.6 Hz)。13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:207.7,140.5,138.8,130.1,124.5,84.4,81.7,74.8,72.6,66.2,43.9,38.8,31.2,28.8,26.0(3C),23.8,23.7,23.4,18.4,17.7,16.1,15.7,6.9(3C),5.3(3C),-5.0,-5.2。

        3.3 3 -O-三乙基硅基-5-O-當(dāng)歸?;?20-O-叔丁基二甲基硅基巨大戟醇(3-O-TES-5-O-angeloyl-20-O-TBDMS-ingenol,中間體3)的合成 稱取40.9 mg中間體2至10 ml茄形瓶中,用橡膠塞密封,用3 ml無水四氫呋喃溶解后,氬氣保護(hù)條件下依次加入214 μl雙三甲基硅基胺基鋰(LiHMDS)和38 μl當(dāng)歸酸酐,冰鹽?。?10℃)低溫?cái)嚢? h,TLC檢測[石油醚-丙酮(20∶1)]反應(yīng)完全。加水9 ml攪拌,用相同體積的乙醚萃取3次,有機(jī)相合并后減壓濃縮至干,經(jīng)快速硅膠柱色譜純化,洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯(50∶1),得到31.3 mg無色固體,利用核磁共振波譜法確證結(jié)構(gòu)為3-O-三乙基硅基-5-O-當(dāng)歸?;?20-O-叔丁基二甲基硅基巨大戟醇(中間體3),收率為67%。

        1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ:6.13(2H,brs),5.95(1H,s),5.42(1H,s),4.20(1H,d,J=11.4 Hz),3.97(1H,s),3.81(1H,d,J=3.3 Hz),2.53-2.40(1H,m),2.2 4-2.15(1H,m),2.01(3H,d,J=7.0 Hz),1.94(3H,s),1.79(3H,s),1.14(3H,s),1.06(3H,s),0.97-0.86(12H,m),0.84(9H,s),0.67-0.55(6H,m),-0.01(6H,d,J=4.3 Hz)。13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:207.6,166.9,139.8,138.9,138.1,130.4,127.6,124.6,85.2,80.9,74.1,73.1,64.8,43.9,38.3,31.3,28.8,26.1(3C),23.9,23.8,23.5,20.7,18.5,18.1,16.2,16.1,15.9,6.9(3C),5.2(3C),-5.2,-5.3。

        3.4 5 -O-當(dāng)歸?;薮箨迹s質(zhì)A)的合成 稱取30.1 mg中間體3至10 ml茄形瓶中,用3 ml甲醇溶液溶解后,加入6 mol/L鹽酸80 μl,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)45 min,TLC檢測[石油醚-丙酮(3∶1)]反應(yīng)完全。加水9 ml攪拌,用相同體積的乙醚萃取3次,有機(jī)相合并后減壓濃縮至干,經(jīng)快速硅膠柱色譜純化,洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯(2∶1),得到10.3 mg無色固體,利用質(zhì)譜及核磁共振波譜法確證結(jié)構(gòu)為5-O-當(dāng)歸?;薮箨迹s質(zhì)A),收率為52.4%,經(jīng)HPLC檢測純度為99.19%[面積歸一化法:色譜柱Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為水(A)-乙腈(B);洗脫梯度(0~12 min,40% B;12~50 min,40%B→60%B);流速1.0 ml/min;檢測波長210 nm;柱溫30℃;進(jìn)樣量10 μl;保留時(shí)間20.8 min]。

        1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ:6.18(1H,d,J=4.7 Hz),6.13(1H,d,J=7.2 Hz),5.81(1H,s),5.39(1H,s),4.36-4.28(1H,m),3.95(2H,q,J=12.8 Hz),3.88-3.75(2H,m),3.03(1H,d,J=5.6 Hz),2.53(1H,t,J=6.0 Hz),2.39(1H,brs),2.16(2H,s),1.99(3H,d,J=7.2 Hz),1.93(3H,s),1.81(3H,s),1.14(3H,s),1.04(3H,s),0.98(3H,d,J=6.6 Hz),0.70(1H,q,J=7.6 Hz)。13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:207.5,168.1,139.9,139.6,138.6,129.3,128.3,127.2,85.5,79.3,75.3,74.0,65.3,44.0,38.4,31.9,28.7,24.1,23.7,23.5,20.7,18.4,16.0,15.7,15.1。ESI-MS m/z:475.3[M+HCOO]-,429.2[M-H]-。

        3.5 20 -O-當(dāng)歸?;薮箨迹s質(zhì)B)的合成 稱取102.16 mg巨大戟醇(ingenol)至25 ml茄形瓶中,加入無水碳酸鈉150.71 mg,依次加入5 ml無水乙腈、當(dāng)歸酸酐300 μl,冰鹽浴控制溫度約-8℃,攪拌反應(yīng)24 h。加水15 ml攪拌,用相同體積的乙酸乙酯萃取3次,有機(jī)相合并后減壓濃縮至干,經(jīng)快速硅膠柱色譜純化,洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯(2∶1),得到27.5 mg無色固體,利用質(zhì)譜及核磁共振波譜法確證結(jié)構(gòu)為20-O-當(dāng)歸酰基巨大戟醇(雜質(zhì)B),收率為22%,經(jīng)HPLC檢測純度為99.84%(面積歸一化法,色譜條件同雜質(zhì)A,保留時(shí)間25.0 min)。

        1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ:6.14-6.02(2H,m),5.93(1H,d,J=1.2 Hz),4.78(1H,d,J=13.0 Hz),4.61(1H,d,J=13.0 Hz),4.41(1H,s),4.18-4.05(2H,m),3.68(1H,d,J=10.0 Hz),3.12(1H,d,J=6.5 Hz),2.77(1H,brs),2.40-2.20(2H,m),1.93(3H,d,J=7.2 Hz),1.87(3H,s),1.83(3H,s),1.11(3H,s),1.06(3H,s),0.96(3H,d,J=7.2 Hz),0.69(1H,q,J=8.6 Hz)。13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:206.7,168.3,138.9,138.3,137.0,130.1,128.4,127.9,84.5,80.8,74.0,72.7,66.3,44.2,39.9,31.1,28.6,24.1,23.3,23.2,20.7,17.4,15.9,15.6,15.5。ESI-MS m/z:475.2[M+HCOO]-,429.2[M-H]-。

        4 討論

        藥物合成工藝中引入的雜質(zhì)、原料藥降解產(chǎn)物等有關(guān)物質(zhì)會(huì)對(duì)藥品質(zhì)量與療效產(chǎn)生較大影響,毒性雜質(zhì)甚至對(duì)人體健康有害或產(chǎn)生其他不良反應(yīng),因此,化學(xué)原料藥及制劑中有關(guān)物質(zhì)的研究與控制是確保用藥安全有效的重要工作。本文首次報(bào)道了巨大戟醇甲基丁烯酸酯的2個(gè)酯交換產(chǎn)物5-O-當(dāng)歸?;薮箨己?0-O-當(dāng)歸?;薮箨迹s質(zhì)A和雜質(zhì)B)的合成方法,利用核磁共振波譜(1H-NMR、13C-NMR)及質(zhì)譜(MS)確證了雜質(zhì)及中間體的結(jié)構(gòu);HPLC檢測結(jié)果顯示,經(jīng)純化后兩個(gè)目標(biāo)雜質(zhì)的純度其達(dá)到99%以上,可以作為巨大戟醇甲基丁烯酸酯原料藥及凝膠劑有關(guān)物質(zhì)研究的對(duì)照品。

        雜質(zhì)的合成起始物料選擇了來源廣泛、方便易得的經(jīng)典二萜類天然產(chǎn)物巨大戟醇,其結(jié)構(gòu)中共含有4個(gè)游離羥基,其中20位的伯醇羥基反應(yīng)活性最強(qiáng),3位及5位的仲醇羥基次之,4位叔醇羥基反應(yīng)活性最弱,故20-O-當(dāng)歸酰基巨大戟醇(雜質(zhì)B)可在低溫條件下直接一步?;磻?yīng)獲得,但由于選擇性不高,會(huì)生成3-O-當(dāng)歸?;薮箨肌?,20-O-二當(dāng)歸?;薮箨嫉雀碑a(chǎn)物,雜質(zhì)B的收率為22%。5-O-當(dāng)歸酰基巨大戟醇(雜質(zhì)A)合成過程中則利用不同保護(hù)基依次對(duì)20位、3位的羥基進(jìn)行了選擇性保護(hù),當(dāng)歸?;磻?yīng)后兩種保護(hù)基可在酸性條件下同步脫去。

        本文所述巨大戟醇甲基丁烯酸酯有關(guān)物質(zhì)的合成方法簡單易行,中間體及目標(biāo)產(chǎn)物分離純化簡便,產(chǎn)物純度高,為2種雜質(zhì)的大量制備及巨大戟醇甲基丁烯酸酯產(chǎn)品的有關(guān)物質(zhì)研究、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究和雜質(zhì)限度控制奠定了基礎(chǔ)。

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