黃澤偉 鄭毓英 劉雪燕 姜遠旭

肝缺血再灌注損傷是肝移植、肝部分切除術和失血性休克后急性肝臟損傷的重要因素[1]。肝缺血再灌注后不但導致肝臟損傷，而且導致肺、腎、腸、胰腺等遠隔器官損傷[2]。因此，有效降低肝缺血再灌注損傷的措施可能會提高患者術后的生存期。盡管過去對肝缺血再灌注損傷的病理生理有一定了解，但對其確切機制了解較少，也缺少有效的治療方法。目前研究認為，過度的氧化應激反應和炎癥反應共同導致肝細胞壞死和凋亡[3-4]。因此，抗炎和抗氧化在抗肝缺血再灌注損傷中尤為重要。Maresin 1（MaR1）是從二十二碳六烯酸中提取的一種新型促炎癥消退介質。近些年研究表明，MaR1通過抗炎、抗氧化作用減輕肺和腎缺血再灌注損傷[5-6]，且對四氯化碳、刀豆球蛋白A誘導的肝損傷有保護作用[7-8]。然而，MaR1對缺血再灌注誘導的肝損傷保護作用及其機制尚不完全清楚。本研究通過建立部分肝缺血再灌注損傷模型，探究MaR1是否通過抗炎及抗氧化作用減輕肝缺血再灌注損傷，并探討其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級Wistar大鼠24只，4～7周齡，體重200～220 g，購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2019-0035。

1.2 主要藥物、試劑和儀器 Maresin 1購自美國Cayman公司（批號：1268720-28-0）；抗磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抑制劑 LY2-94002購自德國 Merck公司（批號：154447-36-6）；TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號：H052-1、H002、H007-1-1、H009-1）；丙二醛（malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所（批號：A003-1-2、A006-2-1、A007-1-1、A001-1-2）；PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt/PKB）、磷酸化 Akt（p-Akt）、轉錄因子NF-E2 相關因子 2（transcription factor NF-E2-related factor 2,Nrf2）、血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）抗體購自美國CST公司（批號：4255S、17366S、4691S、13038S、12721S、21416S）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗購自美國CST公司（批號：32935S）；β-actin抗體購自美國CST公司（批號：4970S）。顯微鏡購自日本OLYMPUS公司（型號：CKX53），全自動生化分析儀中國邁瑞公司（型號：BS-380），低溫離心機購自中國瑞沃德公司（型號：M1324R），石蠟切片機購自中國瑞沃德公司（型號：S700A），酶標儀購自美國Bio-Rad公司（型號：1681130A），電泳儀購自美國Bio-Rad公司（型號：1645050）。

1.3 模型制作、分組及處理 所有大鼠實驗前均經歷至少一個晝夜循環(huán)，自由飲水。根據文獻報道的方法建立肝缺血再灌注模型[12]，主要步驟：腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉大鼠，腹部正中切口，暴露肝門（肝動脈、門靜脈、膽管），微血管鉗阻斷肝左葉、肝中葉血管，保留肝右葉和尾葉血流，阻斷血流60 min后，移除血管鉗開始再灌注，縫合切口，建立部分（70%）肝缺血再灌注損傷模型。大鼠按隨機數字表法分為假手術組（Sham組）、肝缺血再灌注損傷組（I/R組）、MaR1治療組（I/R+MaR1組）、I/R+MaR1+LY294002治療組（I/R+MaR1+LY294002組），每組6只。各組大鼠采用3%戊巴比妥鈉50 mg/kg進行麻醉，Sham組開腹關腹，不阻斷血流；參照文獻[13]，I/R+MaR1組在肝缺血再灌注前1 h腹腔注射4 mg/kg MaR1，I/R+MaR1+LY294002組在肝缺血再灌注前30 min腹腔注射LY294002 0.5 mg/kg，其余處理同I/R+MaR1組。再灌注6 h后各組大鼠采用3%戊巴比妥鈉50 mg/kg再次進行麻醉，分離右頸總動脈，置入套管針，取3 ml血液靜置20 min后，4℃、3 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，取血清凍存?zhèn)溆谩ｎi動脈放血后處死大鼠，立即開腹，取500 mg肝左葉組織凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 肝組織病理學檢查 肝組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，恒溫冷凍切片機切片（4 μm），HE染色，評估組織病理學變化。使用奧林巴斯光學顯微鏡（放大倍數為20倍）觀察切片，每個切片隨機選取6個視野進行肝損傷評估。根據Suzuki等[9]提出標準，依據充血、炎性和壞死的嚴重程度進行評分，0分為無，1分為極其輕微，2分為輕度，3分為中度，4分為嚴重，統(tǒng)計各組各項得分之和。

1.5 肝功能檢測 大鼠處死前取1 ml頸動脈血，室溫靜置20 min，4℃、3 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，取上清液，采用全自動生化分析儀立即檢測AST、ALT、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）水平，嚴格根據廠家說明書操作。

1.6 血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平的檢測 取冰凍的血清解凍，采用ELISA測定TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.7 肝組織MDA、GSH、CAT、SOD水平檢測 取100 mg肝組織解凍，準確稱重后，剪碎，置于組織勻漿器中，按1∶9的比例加入預冷0.9%氯化鈉注射液（1 g組織加入9 ml0.9%氯化鈉注射液），在0～4℃冰盒中研磨，制備10%組織勻漿液，4℃、3 000 r/min離心5 min，離心半徑10 cm，取上清液測定肝組織中MDA、GSH、CAT、SOD水平，嚴格按說明書操作。

1.8 肝組織p-PI3K、p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白表達的檢測 采用Western blot法。取100 mg肝組織，裂解緩沖液勻漿（16 000 r/min，離心15 min），收集上清液。采用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白水平。樣品加入上樣緩沖液，用10%或15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離。然后在250 mA電流下將條帶轉移到PVDF膜上，持續(xù)2 h。5%脫脂奶粉封閉1 h，封閉完畢后用PBS-T洗膜5次，5 min/次，然后加入抗PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Nrf2、HO-1一抗，在1%脫脂奶粉中孵育過夜。膜在TBS-T中洗滌10 min，加入辣根過氧化物酶（HRP）二抗，孵育1 h。二抗孵育結束后再次用TBS-T洗膜5次，5 min/次，洗膜后加入化學發(fā)光增強劑，自顯影。采用圖像分析處理系統(tǒng)（Image J軟件）對蛋白條帶掃描分析，測得的蛋白光密度值與β-actin光密度值的比值表示各蛋白的相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskai-WallisH檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠肝組織病理學檢查結果 Sham組大鼠肝組織細胞排列有序，細胞形態(tài)正常。與Sham組比較，I/R組肝組織出現嚴重的肝損傷，如細胞排列不規(guī)則、肝細胞變性、壞死、炎性細胞浸潤等，而MaR1治療明顯減輕I/R誘導的病理學變化，見圖1（插頁）。I/R組肝組織病理學評分為[3（3，4）]分，明顯高于Sham 組[0（0，1）]分（P＜0.05）；I/R+MaR1組肝組織病理學評分為[1.5（1，2）]分，較 I/R 組明顯降低（P＜0.05），而LY294002逆轉了MaR1的作用，I/R+MaR1+LY294002組肝組織病理學評分為[2.5（2，3）]分，高于I/R+MaR1組（P＜0.05）。

圖1 4組大鼠肝組織病理學改變圖（a：Sham組；b：I/R組；c：I/R+MAR1組；d：I/R+MAR1組+LY294002組;HE染色，×200）

2.2 4組大鼠血清AST、ALT、LDH水平的比較 與Sham組比較，I/R組血清AST、ALT、LDH水平均升高（均P＜0.05）；與I/R組比較，I/R+MaR1組AST、ALT、LDH水平均降低（均P＜0.05）；而LY294002逆轉了MaR1的作用，與I/R+MaR1組比較，I/R+MaR1+LY294002組AST、ALT、LDH水平均升高（均P＜0.05），見表1。

表1 4組大鼠血清AST、ALT、LDH水平的比較（U/L）

2.3 4組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平的比較 與Sham組比較，I/R組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均升高（均P＜0.05），而IL-10無明顯變化（P＞0.05）；與I/R組比較，I/R+MaR1組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低，IL-10水平升高（均P＜0.05）；而LY294002逆轉了MaR1的作用，與I/R+MaR1組比較，I/R+MaR1+LY294002組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均升高，IL-10水平降低（均P＜0.05），見表2。

表2 4組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平的比較（pg/ml）

2.4 4組大鼠肝組織MDA、GSH、CAT、SOD水平的比較 與Sham組比較，I/R組肝組織中MDA水平升高，而GSH、SOD、CAT水平均降低（均P＜0.05）；與I/R組比較，I/R+MaR1組MDA水平降低，而GSH、SOD、CAT水平均升高（均P＜0.05）；而LY294002逆轉了MaR1的作用，與I/R+MaR1組比較，I/R+MaR1+LY294002組MDA水平升高，而GSH、SOD、CAT水平均降低（均P＜0.05），見表3。

表3 4組大鼠肝組織MDA、GSH、CAT、SOD水平的比較

2.5 4組大鼠肝組織p-PI3K、p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白表達的比較 與Sham組比較，I/R組肝組織p-PI3K、p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白相對表達量均升高（均P＜0.05），與I/R組比較，I/R+MaR1組p-PI3K、p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白相對表達量進一步升高（均P＜0.05）；而LY294002逆轉了MaR1的作用，與I/R+MaR1組比較，I/R+MaR1+LY294002組p-PI3K、p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白相對表達量均降低（均P＜0.05），見表4和圖2。

表4 4組大鼠肝組織p-PI3K、p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白相對表達量的比較

圖2 4組大鼠肝組織p-PI3K、p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白表達的電泳圖

3 討論

臨床上進行肝臟手術時，往往會阻斷肝臟血流。遺憾的是，在缺血區(qū)域組織恢復血流灌注后，發(fā)生了更嚴重的損傷，即肝缺血再灌注損傷。本研究中通過夾閉肝左及肝中葉血管，然后恢復再灌注來建立肝部分缺血再灌注損傷。結果發(fā)現，在缺血1 h及恢復再灌注6 h后，大鼠血清ALT、AST、LDH明顯高于Sham組，表明肝功能障礙。此外，肝組織學的檢測也表明，缺血再灌注誘導明顯的肝組織炎性細胞浸潤及肝細胞壞死。這些研究結果說明本實驗成功誘導了肝缺血再灌注損傷模型。另外，本研究發(fā)現，MaR1治療降低血清中ALT、AST、LDH水平，且減輕缺血再灌注誘導的病理學改變。與此同時，MaR1治療明顯降低肝損傷評分。以上這些數據表明，MaR1治療減輕肝缺血再灌注誘導的損傷。

有研究表明，肝缺血再灌注后，激活的枯否細胞、巨噬細胞等釋放TNF-α、IL-1β等炎性細胞因子導致過度炎性反應，進而導致肝細胞損傷[10-11]。MaR1是巨噬細胞中由二十二碳六烯酸產生的一種介質。既往有研究表明，MaR1通過減輕中性粒細胞浸潤，抑制炎性細胞因子釋放而減輕炎性反應[12-13]。本研究結果顯示，MaR1治療顯著降低血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平，增加IL-10水平，表明MaR1減輕肝細胞損傷可能與其抑制炎性反應有關。除炎性反應外，肝缺血再灌注后中性粒細胞、巨噬細胞活化產生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）誘導的氧化反應在肝損傷中也起重要作用[14]。過量的ROS通過脂質過氧化導致蛋白質和DNA損傷，被認為是缺血再灌注損傷過程中細胞膜氧化損傷的主要原因。MDA可反應體內脂質過氧化水平，而活性自由基的清除主要是通過一系列抗氧化酶來實現的，如SOD、CAT、GSH等，以維持氧化反應和抗氧化反應的平衡。以往研究發(fā)現，MaR1減輕氧化應激導致的肝細胞損害[8]。本研究發(fā)現，MaR1治療顯著降低肝組織中MDA水平，提高SOD、CAT、GSH水平。以上研究表明，MaR1減輕肝缺血再灌注損傷除了與抑制缺血再灌注誘導的炎性反應有關外，也與其抑制氧化反應有關。然而，MaR1的抗炎、抗氧化作用部分被PI3K抑制劑逆轉，表明其作用是PI3K依賴的。

HO-1作為Ⅱ期抗氧化酶之一，在生理條件下，通過調控血紅素的分解，其代謝產物具有抗氧化和抗炎作用。研究發(fā)現，外源性誘導HO-1表達增加對肺、肝和腎缺血再灌注損傷具有保護作用[15]，提示在缺血再灌注損傷中，增加HO-1表達是減輕損傷的有效治療措施。有研究發(fā)現，MaR1通過上調HO-1表達而發(fā)揮抗炎、抗氧化及器官保護作用[5]。HO-1表達受多個上游分子的調控，其中，PI3K/Akt/Nfr2是調控HO-1表達的一條重要信號通路。首先，HO-1受Nrf2緊密調控，而PI3K/Akt信號通路參與激活Nrf2[16-17]。一旦被激活，Nrf2就與Keap1分離，轉位到細胞核與ARE結合，調控靶基因的表達，包括HO-1。既往研究發(fā)現，PI3K/Akt信號通路激活后，通過抑制炎癥和線粒體產生的ROS，同時促進抗凋亡作用，在肝臟缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用[18]。據報道，激活PI3K/Akt和Nrf2/HO-1通路減輕硫代乙酰胺誘導的肝毒性作用[17]，提示激活PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路可能成為治療肝缺血再灌注損傷的潛在靶點。研究表明，MaR1通過激活PI3K/Akt減輕神經炎性反應和認知功能障礙[19]。本研究發(fā)現，缺血再灌注誘導PI3K、Akt、Nfr2、HO-1表達增加，其原因為缺血再灌注后機體在啟動促炎反應的同時，也激發(fā)了抗炎反應系統(tǒng)，屬于一種保護機制。然而，本研究中I/R組誘發(fā)了明顯的炎性反應，表明這種保護機制不足以抵消缺血再灌注誘發(fā)的促炎性反應，從而表現出過度的炎性反應。值得注意的是，MaR1治療進一步增加PI3K、Akt、Nfr2、HO-1的表達，而給予PI3K抑制劑后，部分逆轉了MaR1的這些作用。以上研究結果提示：MaR1通過激活PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路減輕缺血再灌注導致的肝組織損傷。

綜上所述，MaR1減輕缺血再灌注誘導的炎性反應和氧化應激反應，減輕肝缺血再灌注損傷，且MaR1治療進一步上調 PI3K、Akt、Nfr2、HO-1蛋白表達，而MaR1的這些作用部分被PI3K抑制劑LY294002逆轉。MaR1通過激活PI3K/Akt/Nrf2/HO-1信號通路抑制肝缺血再灌注誘導的炎性反應和氧化應激反應，進而減輕肝缺血再灌注損傷。