李雨蔚，徐潤(rùn)，侯維，蹇順海，陳筱莉，何欣蓉

1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，四川南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院病理教研室，四川南充 637000；3.成都市第二人民醫(yī)院，四川成都 610011

食管癌是人類(lèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)90%的病例為食管鱗狀細(xì)胞癌，由于食管癌起病隱匿，80%以上患者確診時(shí)已進(jìn)入中晚期，因此食管癌患者總體生存時(shí)間較短，5年生存率低，嚴(yán)重影響人類(lèi)的健康。TGF-β/Smad信號(hào)通路參與許多病理過(guò)程，在腫瘤中發(fā)揮著特別廣泛的作用［1-2］。因此調(diào)節(jié)TGF-β途徑對(duì)食管癌患者具有重要意義，TGF-β有三種亞型（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3）和三種相應(yīng)的TGF-β受體（TGF-βR1、TGF-βR2和TGF-βR3）。前兩種受體具有激酶活性，磷酸化并激活TGF-β/Smads途徑下游，而TGF-βR3沒(méi)有激酶活性。在TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中，TGF-β依次與TGF-βR2和TGF-βR1結(jié)合，形成異基因復(fù)合物。因此，TGFβR2與TGF-β結(jié)合，發(fā)揮關(guān)鍵作用，啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)TGFβR2信號(hào)異常，影響腫瘤的生物學(xué)特性和患者的生存。微小RNA(miRNA)是TGFβR2功能最重要的調(diào)節(jié)因子之一［3］。miR-181家族，包括miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d，是最早在造血細(xì)胞中特異表達(dá)的miRNA之一。人類(lèi)miR-181a和miR-181b基因聚集在一起，位于1號(hào)染色體(miR-181a-1和miR-181b-1)和9號(hào)染色體(miR-181a-2和miR-181b-2)上，研究發(fā)現(xiàn)miR-181a在口腔鱗狀細(xì)胞癌、高級(jí)別軟骨肉瘤、乳腺癌、胃癌、食管癌等癌中表達(dá)均異常［3-8］。利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase預(yù)測(cè)miR-181a的靶基因，其中包括TGFβR2，并且已有學(xué)者在胃癌中采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TGFβR2為miR-181a的靶基因，但在食管癌中miR-181a與TGFβR2的機(jī)制目前尚不清楚，本研究將檢測(cè)與分析miR-181a、TGFβR2在食管鱗狀細(xì)胞癌ECA109中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響，并初步探討可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司。新生牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司。青霉素—鏈霉素溶液購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。0.25%胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco。增強(qiáng)型CCK-8試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技有限公司、組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒購(gòu)自艾德萊生物。All-in-OneTM miRNA qRT-PCR DetectionKit購(gòu)自GeneCopoeia。mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific。Bestar SybrGreen qPCR mastermix購(gòu)自DBI Bioscieno； RT-PCR引物、 miR-181a mimics、 mimics NC、miR-181a inhibitor、inhibitor NC由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)。二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Forma Scientific公司）、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Thermo）、熒光定量PCR儀（德國(guó)Bio.Rad公司）、倒置顯微鏡（德國(guó)Leica）。

1.2 細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)

人正常食管上皮細(xì)胞株HEEC和人食管鱗癌細(xì)胞株ECA-109來(lái)源于川北醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)研究所。HEEC、ECA109均為貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%新生牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM/HIGH GLUCOSE完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組

按5×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度將ECA109接種于六孔板中培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞密度達(dá)40%～50%，按照Lipo6000TM試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分為五組：blank control組、miR-181a mimics轉(zhuǎn)染組、 mimic NC陰性對(duì)照組、miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染組、inhibitor NC陰性對(duì)照組。轉(zhuǎn)染6 h后用新鮮的完全培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 CCK8法檢測(cè)

按每孔8×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每個(gè)樣本重復(fù)5個(gè)復(fù)孔，于0、12 h、24 h、48 h各時(shí)間點(diǎn)每孔加入10μL的增強(qiáng)型CCK-8試劑，用加了完全培養(yǎng)基和10μL的增強(qiáng)型CCK-8試劑但沒(méi)有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在450 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。

1.5 qRT-PCR

總RNA的提取使用組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒提取空白對(duì)照組及轉(zhuǎn)染后ECA109中的總RNA，檢測(cè)RNA的純度及濃度后于-80℃保存（OD260/OD280比值在2.0～2.2之間）。逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR檢測(cè)miR-181a、TGFβR2mRNA、Smad2mRNA的表達(dá)量使用All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒、Thermo Scientific的mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將細(xì)胞中提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件分別為為37℃60 min、85℃5 min，65℃5 min、25℃5 min、42℃60 min、70℃5 min。將得到的cDNA稀釋后，按照All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒、Bestar SybrGreen qPCR mastermix說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)條件分別為95℃10 min，1個(gè)循環(huán)；95℃10sec、60℃20sec、72℃10sec，40個(gè)循環(huán)和95℃2 min，1個(gè)循環(huán)；95℃10sec、55℃30sec、72℃30sec，40個(gè)循環(huán)，以U6和GAPDH作為內(nèi)參，miR-181a、TGFβR2mRNA表達(dá)量用表示。miR-181a正向引物序列5'-GCGGTAACATTCAACGCTGTCG-3'，反向引物序列5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；TGFβR2正向引物序列 5'-GTGGCTGTATGGAGAAAGAATG-3'，反向引物序列5'-CAAGTCAGGATTGCTGGTGTT-3'；U6正向引物序列5'-CGCTTCGGCAGCACATATA-3'，反向引物序列5'-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；GAPDH 正向引物序列 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3'，反向引物序列5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'。

1.6 Western Blot

分別收集轉(zhuǎn)染4 d后的各組細(xì)胞于離心管中，PMSF裂解提取蛋白，采用Bradford蛋白定量試劑盒測(cè)蛋白的濃度，每孔取12μL蛋白質(zhì)行SDS-PAGE電泳（80 min 100 V），轉(zhuǎn)膜（80 min 0.2 A），5%脫脂牛奶封閉3 h，加入RabbitAnti-TGFβR2（1：300稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜后加入二抗羊抗兔IgG（1：5 000稀釋?zhuān)覝胤跤? h，采用特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，以GAPDH作為內(nèi)參，采用Image J軟件分析目的蛋白和內(nèi)參的光密度值，以目的蛋白和內(nèi)參的光密度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK8法檢測(cè)

采用CCK8法檢測(cè)ECA109細(xì)胞中各組在0 h、12 h、24 h、48 h的增殖情況。如表1展示了各組在0 h、12 h、24 h、48 h時(shí)的吸光度值，以s表示。圖1顯示，miR-181a mimics組與空白對(duì)照組、mimic NC組相比，在12 h、24 h、48 h吸光度值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），空白對(duì)照組與mimic NC組之間無(wú)明顯差異。miR-181a inhibitor組與空白對(duì)照組、inhibitor NC組相比，在12 h、24 h、48 h吸光度值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），空白對(duì)照組與inhibitor NC組之間無(wú)明顯差異。

圖1 CCK8法檢測(cè)ECA109五組細(xì)胞的增殖水平

表1 轉(zhuǎn)染后ECA109五組細(xì)胞增殖能力的比較(±s)

表1 轉(zhuǎn)染后ECA109五組細(xì)胞增殖能力的比較(±s)

組別0 h0.488 4±0.047 30.488 7±0.031 80.496 6±0.009 40.488 9±0.025 20.488 9±0.022 00.0560.994 12 h0.942 1±0.016 51.072 2±0.026 20.892 1±0.017 10.742 7±0.026 30.953 9±0.026 2108.5200 24 h1.198 5±0.068 91.483 2±0.051 21.121 9±0.055 10.962 5±0.026 51.214 4±0.023 061.3360 48 h1.635 3±0.058 12.124 3±0.050 51.604 6±0.021 51.384 5±0.048 41.621 9±0.088 689.2130 Blank control MiR-181a mimics Mimic NC MiR-181a Inhibitor Inhibitor NC F值P值

2.2 miR-181a在HEEC、ECA109細(xì)胞中的表達(dá)情況

如圖2所示，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，人正常食管上皮細(xì)胞株HEEC，人食管鱗癌細(xì)胞株ECA109中miR-181a的表達(dá)水平分別為（1.005±0.124）、（3.454±0.197），食管鱗癌細(xì)胞株中miR-181a的表達(dá)量明顯高于人正常食管上皮細(xì)胞株的表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 miR-181a在HEEC、ECA109細(xì)胞株中的表達(dá)情況

2.3 miR-181a在各轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)情況

如圖3a所示，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，ECA109細(xì)胞miR-181a mimics轉(zhuǎn)染組miR-181a的表達(dá)水平（33.525 3±1.089 7）明顯高于空白對(duì)照組（1.020 4±0.251 5）、mimic NC組（0.855 9±0.093 0），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；圖3b所示，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，ECA109細(xì)胞miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染組miR-181a的表達(dá)水平（0.022 1±0.007 6）明顯低于空白對(duì)照組（1.020 4±0.251 5）、inhibitor NC組（0.955 9±0.309 9），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

圖3b qRT-PCR檢測(cè)miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染后miR-181a表達(dá)

圖3a qRT-PCR檢測(cè)miR-181a mimics轉(zhuǎn)染后miR-181a表達(dá)

2.4 TGFβR2在各轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)情況

如圖4a所示，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，ECA109細(xì)胞miR-181a mimics轉(zhuǎn)染組TGFβR2mRNA的表達(dá)水平（0.466 5±0.037 7）明顯低于空白對(duì)照組（1.000 8±0.049 2）、mimic NC組（1.052 9±0.098 2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。圖4b所示，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，ECA109細(xì)胞miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染組TGFβR2mRNA的表達(dá)水平（1.606 7±0.062 8）明顯高于空白對(duì)照組（1.0080±0.049 2）、inhibitor NC組（1.120 7±0.104 8），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。如圖5、6所示，Western Blot結(jié)果顯示miR-181a mimics轉(zhuǎn)染組TGFβR2蛋白表達(dá)水平較陰性對(duì)照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染組TGFβR2蛋白表達(dá)水平較陰性對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4b WB檢測(cè)miR-181amimics轉(zhuǎn)染后TGFβR2蛋白表達(dá)

圖4a qRT-PCR檢測(cè)miR-181ainhibitor轉(zhuǎn)染后GFβR2mRNA表達(dá)

3 討論

圖5a WB檢測(cè)miR-181amimics轉(zhuǎn)染后TGFβR2蛋白表達(dá)

圖5b WB檢測(cè)miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染后TGFβR2蛋白表達(dá)

圖6a mimics轉(zhuǎn)染組與NC組TGFβR2蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖6b inhibitor轉(zhuǎn)染組與NC組TGFβR2蛋白相對(duì)表達(dá)量

食管癌是常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，在我國(guó)癌癥死亡原因中排名第四［9］。盡管有包括手術(shù)干預(yù)、化療和同時(shí)放化療在內(nèi)的多模式治療［10］，但治療效果仍不佳。因此，為了提高晚期食管癌患者的生存率，迫切需要在早期診斷和治療方面取得進(jìn)展。在TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，最重要的受體是TGFβR2，它與TGF-β結(jié)合并激活TGF-β信號(hào)級(jí)聯(lián)，miRNA是TGFβR2最重要的翻譯后調(diào)節(jié)因子之一。在本研究中采用qRT-PCR檢測(cè)miR-181a在食管癌細(xì)胞ECA109中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-181a在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于正常食管上皮細(xì)胞。為了進(jìn)一步研究miR-181a與TGFβR2的關(guān)系，本研究將miR-181a mimics、miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染入食管癌細(xì)胞ECA109，發(fā)現(xiàn)miR-181a mimics組食管癌細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，miR-181a inhibitor增殖能力降低。并通過(guò)qRT-PCR、Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn) miR-181a mimics轉(zhuǎn)染組TGFβR2mRNA及其蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組均明顯降低。miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染組TGFβR2mRNA及其蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組均明顯升高。以上結(jié)果表明miR-181a在食管癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演癌基因的作用，并通過(guò)影響TGFβR2來(lái)促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖能力。但本研究也存在以下不足之處：首先，本研究未研究TGFβR2表達(dá)量的改變是否會(huì)影響miR-181a的表達(dá)水平。其次，本研究?jī)H在體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)這一現(xiàn)象，今后需要收集更多臨床樣本，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以完善實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并深入探討食管癌中miR-181a、TGFβR2之間的調(diào)控機(jī)制。