吳成亮 蘇占營 江旺航 辜敏

在經(jīng)濟生活水平提高的同時不孕不育發(fā)生率逐漸升高，為滿足患者生育需求，輔助生殖技術(shù)日益精進[1]，順利妊娠常需要多個周期完成，因此保有多個胚胎方便多次完成，在第一個周期移植完成后剩余的胚胎需進行冷凍保存[2]，而胚胎經(jīng)過冷凍和解凍之后，其周圍的透明帶硬度上升，不利于著床[3]，因此需要進行輔助孵化。輔助孵化是以人工干預(yù)的方式幫助胚胎從透明帶中孵出、在子宮著床[4-5]，其方法多樣，有化學(xué)法、機械切割法、激光法[6]，其中激光輔助孵化因其快速、定位準確而在臨床廣泛應(yīng)用[7]。傳統(tǒng)激光法采用1 480 nm 的激光光束將透明帶削薄或打小孔輔助孵化，采用削薄的方式能明顯薄化透明帶外層結(jié)構(gòu)[8]，但難以改變其內(nèi)層組織，而采用打孔的方式則難以獲得理想的透明帶寬度，不利于胚胎植入，或可造成胚胎嵌頓、雙胎等情況發(fā)生，增加試管嬰兒風(fēng)險[9]。因此本研究在傳統(tǒng)激光鐳射孵化術(shù)的基礎(chǔ)上進行改良，使激光能量精準地聚焦在透明帶上并打洞，擴大透明帶激光打孔面積，產(chǎn)生出理想大小的洞口，從而提高胚胎發(fā)育潛能，幫助胚胎孵出著床，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020 年1-12 月在九江市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心施行冷凍胚胎復(fù)蘇移植周期移植的184 例不孕女性。納入標準：（1）年齡≥18 歲；（2）不孕時間≥1 年，符合文獻[10]《不孕癥診斷指南》中的診斷標準。排除標準：（1）存在家族遺傳??；（2）生殖系統(tǒng)發(fā)育不全或畸形；（3）嚴重精神疾病，無法配合。按單雙數(shù)法分為改良組（n=92）和傳統(tǒng)組（n=92）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，入組人員簽署研究知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 促排-取卵-取精-體外受精-胚胎移植（1）促排：不孕女性口服藥物等方式以控制性超排卵獲得一定數(shù)量卵子。（2）取卵：行陰道超聲介導(dǎo)下取卵術(shù)獲得卵子。（3）取精：男方通過手淫或睪丸穿刺取精的方式獲得精子。（4）體外受精及胚胎培養(yǎng)：使用體外受精-胚胎移植技術(shù)體外受精；使用瑞士Vitrolife 輔助生殖培養(yǎng)液進行體外胚胎培養(yǎng)。根據(jù)Gardner 評分標準將囊胚分期[11]。（5）胚胎移植：胚胎體外的發(fā)育天數(shù)第3 天（D3）選擇1～2 枚胚胎進行移植，剩余的胚胎經(jīng)不孕女性及其配偶許可后冷凍保存或繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)育天數(shù)第5 天（D5）或第6 天（D6）形成囊胚后冷凍保存。

子宮內(nèi)膜準備，（1）自然周期：月經(jīng)≥10 d，卵泡直徑≥14 mm，子宮內(nèi)膜≥7 mm，排卵第5 天進行凍融囊胚移植；（2）激素替代周期：月經(jīng)第3 天起口服雌激素，15 d 后超聲檢測子宮內(nèi)膜≥7 mm，注射孕激素，6 d 后進行凍融囊胚移植。

1.2.2 胚胎冷凍保存 激光法人工皺縮胚胎，基本完全皺縮后采用日本加藤VT101 玻璃化冷凍試劑盒行玻璃化冷凍；室溫轉(zhuǎn)移胚胎至平衡液，根據(jù)胚胎發(fā)育時期平衡3～8 min，后續(xù)將胚胎轉(zhuǎn)移至玻璃化液并在60 s 內(nèi)裝載至日本加藤Cryotop 冷凍載桿然后液氮冷凍。

1.2.3 冷凍胚胎解凍復(fù)蘇 采用日本加藤VT102 玻璃化解凍試劑盒復(fù)蘇胚胎：37 ℃水浴解凍液，冷凍胚胎的載桿依次投入解凍液WS1、2、3、4 中停留1、3、5、5 min，然后轉(zhuǎn)入瑞典Vitrolife 系列囊胚培養(yǎng)液G2 培養(yǎng)；解凍胚胎以細胞數(shù)≥50%總細胞數(shù)為胚胎復(fù)蘇標準。

1.2.4 改良激光鐳射孵化 改良組胚胎從解凍液取出即行改良激光鐳射孵化術(shù)：使用非接觸式激光顯微操作系統(tǒng)RI，將激光靶心對準卵周間隙寬處連續(xù)發(fā)射激光，以削除包含冷凍前激光皺縮時透明帶開孔處25%的透明帶、中心部位完全穿破透明帶為目的，控制操作時間在60 s 內(nèi)；后續(xù)使用瑞典Vitrolife 系列囊胚培養(yǎng)液G2 洗滌并移入囊胚培養(yǎng)液培養(yǎng)2～3 h 直至移植。移植后第1 天起給予孕激素黃體支持至第14 天驗血人絨毛膜促性腺激素，以第28 天超聲下可見孕囊為臨床妊娠。

1.2.5 傳統(tǒng)激光輔助孵化術(shù) 傳統(tǒng)的激光法是指采用激光光束將透明帶削薄或者打小孔，以起到輔助孵化的作用。

1.3 觀察指標及判定標準（1）比較兩組胚胎復(fù)蘇率。D3 期胚胎卵裂球≥50% 存活，D5 及D6期囊胚、囊胚腔擴張，判定為復(fù)蘇成功，胚胎復(fù)蘇率=復(fù)蘇成功胚胎數(shù)/ 移植胚胎總數(shù)×100%。（2）比較兩組臨床妊娠率。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/總周期數(shù)×100%。（3）比較兩組胚胎植入率。胚胎植入率=超聲可見孕囊數(shù)/移植胚胎總數(shù)×100%。（4）比較兩組早期流產(chǎn)率，胚胎移植后12 周內(nèi)胚胎發(fā)育停止判定為早期流產(chǎn)，早期流產(chǎn)率=早期流產(chǎn)周期數(shù)/總周期數(shù)×100%。（5）比較兩組異位妊娠率，將孕囊著床于子宮外及子宮內(nèi)外同時妊娠的妊娠判定為異位妊娠，異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠總周期數(shù)×100%。（6）比較兩組活產(chǎn)率，活產(chǎn)率=活產(chǎn)分娩周期數(shù)/總周期數(shù)×100%。（7）比較兩組胎兒生長發(fā)育情況，使用超聲檢查胎兒生長發(fā)育情況，記錄畸形發(fā)生情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 本研究所有資料采用SPSS 24.0軟件包分析，其中計量資料以（）表示，兩組比較用t 檢驗，三組比較用單因素方差分析；計數(shù)資料以（%）表示，比較用χ2檢驗或Fisher 精確檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 兩組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 不同孵化術(shù)胚胎移植指標比較 改良組進行195 個周期，孵化胚胎共計336 枚，其中D3 期胚胎193 枚，108 個周期；D5 期囊胚102 枚，62 個周期；D6 期囊胚41 枚，25 個周期。對照組進行197 個周期，孵化胚胎共計349 枚，其中D3 期胚胎182 枚，103 個周期；D5 期囊胚120 枚，76 個周期；D6 期囊胚47 枚，18 個周期。兩組胎兒均無生長發(fā)育異常。兩組移植日內(nèi)膜厚度、胚胎移植數(shù)量、內(nèi)膜準備方案、移植胚胎發(fā)育階段比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。改良組胚胎復(fù)蘇率、胚胎植入率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率均高于傳統(tǒng)組，早期流產(chǎn)率、異位妊娠率均低于傳統(tǒng)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2、3。

表2 不同孵化術(shù)移植日內(nèi)膜厚度及胚胎移植數(shù)量比較（）

表2 不同孵化術(shù)移植日內(nèi)膜厚度及胚胎移植數(shù)量比較（）

表3 不同孵化術(shù)基線資料及胚胎移植指標比較（%）

表3（續(xù)）

2.3 改良組不同胚齡胚胎移植指標比較 改良組D3 亞組、D5 亞組、D6 亞組移植日內(nèi)膜厚度、胚胎移植數(shù)量、內(nèi)膜準備方案比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。三組異位妊娠率均為0，三組胚胎復(fù)蘇率均為100%。D3 亞組、D5 亞組、D6 亞組胚胎植入率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。D5 亞組胚胎植入率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率均高于D3 亞組，早期流產(chǎn)率低于D3 亞組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.834、5.796、5.664、6.630，P<0.05）。D3、D6 兩亞組所有胚胎移植指標比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表4、5。

表4 改良組移植日內(nèi)膜厚度及胚胎移植數(shù)量比較（）

表4 改良組移植日內(nèi)膜厚度及胚胎移植數(shù)量比較（）

表5 改良組不同胚齡基線資料及胚胎移植指標比較（%）

表5（續(xù)）

3 討論

自1978 年世界首例試管嬰兒在英國誕生，人類輔助生殖技術(shù)得到了空前發(fā)展[12]，到目前為止應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)仍為體外受精-胚胎移植技術(shù)，此法通過取卵、取精、體外受精、胚胎培養(yǎng)、胚胎移植過程輔助生殖，成功率能夠達到40%以上，但目前仍然存在較高的植入失敗率，部分失敗原因來自胚胎培養(yǎng)，但更多的原因集中于胚胎無法從透明帶中孵出[13]。

透明帶是以糖蛋白為主要成分，存在于卵母細胞及早期胚胎周圍的組織，其具有保護卵子、保護胚胎的作用[14]，胚胎發(fā)育為囊胚后使得透明帶破裂，然后在子宮著床[15]，然而在體外受精-胚胎移植周期中胚胎凍融會造成透明帶糖蛋白發(fā)生變性，導(dǎo)致透明帶硬化，影響胚胎的孵出[16]。激光輔助孵化技術(shù)是一種輔助胚胎從透明帶膜中孵化的技術(shù)，具有操作簡單、控制精確、安全可靠等優(yōu)勢[17]。有研究表示對卵裂期胚胎解凍后行激光輔助孵化可以顯著提高凍融周期的臨床妊娠率和凍融胚胎的植入率[18]，此外在Jwa 等[19]研究中顯示激光輔助孵化技術(shù)具有較高安全性，不會提高先天畸形的風(fēng)險。

激光輔助孵化技術(shù)采用對透明帶進行薄化或者打小孔的方法，以提高胚胎的孵出和種植能力[20]。但是用激光削薄方法行輔助孵化僅將透明帶外層結(jié)構(gòu)薄化，內(nèi)層結(jié)構(gòu)仍然完整，并不能有效幫助胚胎孵出和種植，另外發(fā)現(xiàn)采用激光打小孔進行輔助孵化，透明帶寬度不夠不能提高種植率，而且寬度過小易導(dǎo)致胚胎嵌頓，易導(dǎo)致雙胎，增加了試管嬰兒雙胎風(fēng)險[21]。因此激光輔助孵化適宜深度和寬度對提高種植率和減低輔助生殖并發(fā)癥是至關(guān)重要的[22]。本項課題研究將傳統(tǒng)的激光輔助孵化進行改良，在解凍第二步立即行改良激光鐳射孵化術(shù)，選取卵周間隙相對較大或碎片較多的區(qū)域，在非接觸式激光顯微操作系統(tǒng)下將激光對準透明帶連續(xù)發(fā)射削除25%以上透明帶中心完全穿破透明帶。結(jié)果顯示，改良組胚胎復(fù)蘇率、臨床妊娠率、胚胎植入率、活產(chǎn)率均高于傳統(tǒng)組，早期流產(chǎn)率、異位妊娠率均低于傳統(tǒng)組（P<0.05），分析是因為經(jīng)改良激光鐳射孵化術(shù)在進行孵化時，處理的范圍更大，更符合胚胎著床的生理過程，同時切除透明帶的部位更大，而且因為在細胞仍處于皺縮期時開始激光孵化，從而避免孵出中產(chǎn)生嵌頓，而且采用非接觸式系統(tǒng)，可以避免因為直接接觸透明帶內(nèi)細胞造成的熱損傷。此外，本研究改良組根據(jù)胚胎在體外的發(fā)育天數(shù)分為D3 亞組、D5 亞組、D6 亞組比較其移植情況，D5 亞組胚胎植入率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率均高于D3 亞組，早期流產(chǎn)率低于D3 亞組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。D3、D6 兩亞組所有胚胎移植指標比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。說明不同發(fā)育階段的胚胎妊娠結(jié)局有所差異，D5 囊胚較發(fā)育早期胚胎能獲得更好的妊娠結(jié)局，這提醒在有較多胚胎的患者中，應(yīng)優(yōu)先培養(yǎng)至囊胚冷凍以避免妊娠失敗。

綜上所述，改良激光鐳射孵化術(shù)能有效輔助凍融胚胎孵化，提高其胚胎復(fù)蘇率，有助于獲得較好妊娠結(jié)局。