李欣 張艷兵 房麗麗

膽道閉鎖（BA）目前仍然是小兒外科中最嚴重的肝膽系統(tǒng)疾病之一，且其治療效果不佳已達成共識。BA 累及肝內(nèi)外膽管，雖然肝門-空腸吻合術(shù)（Kasai 手術(shù)）可以恢復(fù)部分膽汁引流，但是肝內(nèi)膽汁淤積和肝纖維化的程度在術(shù)后可能會持續(xù)進展。肝移植技術(shù)的應(yīng)用對于BA 的治療具有重大意義，使得許多BA 晚期發(fā)生肝功能衰竭的BA 患兒通過肝移植手術(shù)獲得長期生存的機會。目前，Kasai 術(shù)后綜合治療和兒童肝移植的發(fā)展使得BA 術(shù)后10 年的總生存率已達到90%[1]。但新生兒發(fā)生BA 的發(fā)病機制尚不明確，不能在圍生期進行篩查或早期診斷，使得BA 在發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)出現(xiàn)不同程度膽汁淤積和肝纖維化。因此，探究BA 的發(fā)病機制對疾病的預(yù)防、早期診斷及治療具有重要意義。本文對BA 發(fā)病機制的最新研究進行闡述。

1 BA的相關(guān)基因

BA 是一種肝臟內(nèi)膽管異常狹窄、阻塞或完全缺失的新生兒膽管疾病。已有研究報道了許多可能導(dǎo)致BA 的病因，包括先天性、圍生期和后天性疾病[2]。目前發(fā)現(xiàn)多個基因與BA 相關(guān)。在一項評估m(xù)icroRNA-499 rs3746444 多態(tài)性與BA 風險的關(guān)聯(lián)及其與BA 臨床病理特征相關(guān)性的研究中，通過使用熒光標記探針在Rotor Gene Real Time PCR System（QIAGEN，GmbH）上進行實時聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）熒光檢測，對所有參與研究的BA 嬰兒及健康對照組的miR-499 單核苷酸多態(tài)性（SNP）（rs3746444 A>G）進行基因分型。發(fā)現(xiàn)miR-499 SNP 基因型與BA 的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，變異等位基因G 是BA 的主要等位基因[3]。此外EFEMP1 基因也可能是BA 患者新的易感基因，研究發(fā)現(xiàn)EFEMP1 轉(zhuǎn)錄物在膽管細胞和門靜脈成纖維細胞中具有更高的表達[4]。而肝臟和血清外泌體長鏈非編碼RNA H19（lncRNAH19）也通過影響膽管細胞參與BA 的病程，H19 水平升高導(dǎo)致高遷移率組AT-hook 2（HMGA2）的上調(diào)，增強膽道細胞增殖，H19 缺乏通過抑制膽汁酸誘導(dǎo)的S1PR2 和鞘氨醇激酶2（SphK2）的表達和激活來抑制膽管細胞增殖和肝纖維化[5]。Hes1 siRNA 抑制膽管上皮細胞成熟，導(dǎo)致膽管上皮細胞保持未成熟狀態(tài)，無法形成管狀結(jié)構(gòu)[6]。另一段長非編碼RNA（lncRNA）膜聯(lián)蛋白A2 假基因3（ANXA2P3）和膜聯(lián)蛋白A2（ANXA2）也被發(fā)現(xiàn)在BA 患者中表達水平增加，ANXA2P3 和ANXA2 的表達與肝細胞增殖、細胞周期進程及肝細胞凋亡密切相關(guān)，并且被認為可能是BA 患者的生物標志物[7]。

2 BA與病毒感染及炎癥反應(yīng)

病毒感染通常被認為是BA 發(fā)病機制的始動因素。最常涉及的病毒載體包括皰疹病毒科（巨細胞病毒和Epstein-Barr 病毒）以及呼腸孤病毒科（呼腸孤病毒和輪狀病毒）的成員[2]。在BA 和輪狀病毒誘導(dǎo)的BA 小鼠的肝臟中，JAG1 和Notch2 的表達顯著增加。抑制Notch 通路可改善膽管阻塞并延遲BA 誘導(dǎo)的死亡率。通過抑制Notch 通路，炎癥細胞因子[腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-8（IL-8）和白細胞介素-18（IL-18）]的血清水平降低。BA 肝臟中CK19、Sox9 和EpCAM 的表達顯著增加，Notch 通路通過促進肝祖細胞向膽管細胞分化而參與BA 的發(fā)病機制[8]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）是炎癥中的關(guān)鍵信號分子，BA 肝組織中的STAT3 和p-STAT3 表達降低。RNA-seq 分析顯示BA 中表達STAT3 的中性粒細胞數(shù)量減少，同時干擾素相關(guān)的抗病毒活性顯著增強。STAT3 減少，增強IL-8 和中性粒細胞化學引誘物（C-X-C 基序）配體1（CXCL1）表達并促進干擾素反應(yīng)性中性粒細胞的積累，導(dǎo)致BA 中的膽管上皮細胞損傷[9]。而miR-155 過表達促進主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ、MHCⅡ、趨化因子（CXC 基序）配體（CXCL）9、CXCL10、單核細胞趨化蛋白1 和IFN-γ 刺激后的CXCL1 的表達，激活JAK2/STAT3，從而增強促炎作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)BA 患者的肝臟炎癥小體基因的表達增加，使用經(jīng)過改造以滅活攜帶炎癥小體基因的小鼠，IL1R1 或NLRP3 的缺失、自然殺傷細胞的激活以及細胞因子和趨化因子的表達減少，從而防止了上皮損傷和膽管阻塞[11]。高遷移率族框1（HMGB1）作為炎癥的晚期介質(zhì)起著重要作用。和健康對照患者相比，從BA 患兒采集的血清中HMGB1 水平顯著升高。BA 患兒血清HMGB1 水平與γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶水平呈正相關(guān)，BA 肝活檢組織中HMGB1 信使核糖核酸和蛋白質(zhì)表達水平上調(diào)，血清HMGB1 水平與γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶水平的相關(guān)性可能為BA 的診斷提供新的標志物[12]。

3 BA與免疫反應(yīng)

越來越多的證據(jù)表明免疫反應(yīng)參與了BA 的發(fā)病機制[13]，在恒河猴輪狀病毒（RRV）誘導(dǎo)的新生BA 小鼠模型中，缺乏B 細胞的小鼠不會發(fā)生BA，并且缺乏B 細胞與T 細胞和巨噬細胞活化的喪失有關(guān)。來自BA 小鼠的B 細胞產(chǎn)生了多種與免疫激活相關(guān)的先天性和適應(yīng)性免疫細胞因子，B 細胞分泌的細胞因子可根據(jù)T 細胞活化標記分化簇的表達增加來激活T 細胞，增加巨噬細胞浸潤和膽道損傷[13]。BA 患者門脈中的淋巴細胞浸潤主要表現(xiàn)CD3、CD4和CD8T 細胞顯著升高，CD4+T 細胞活化已被證明在BA 中發(fā)揮重要作用，評估匯管區(qū)CD4+T 細胞亞群的浸潤水平的研究發(fā)現(xiàn)，BA 患者的肝臟浸潤性Th1、Th2、Th17 細胞顯著增加，并且與預(yù)后呈負相關(guān)[14-15]。在小鼠模型中，激活的CD4+淋巴細胞在病毒攻擊后第8 天開始出現(xiàn)在肝臟中，而先天免疫反應(yīng)正在減弱。血漿白細胞介素-17A（IL-17A）水平隨著Th17 淋巴細胞和髓樣樹突細胞的肝積累而上升。分化簇11c（CD11c）樹突狀細胞的靶向消耗減少了肝臟IL-17A 的產(chǎn)生并改善了肝內(nèi)膽管損傷。重組IL-17A 在體外誘導(dǎo)新生兒膽管細胞中趨化因子（C-C 基序）配體2 的表達，并且阻斷相應(yīng)的趨化因子（C-C 基序）受體2 減少了體內(nèi)炎癥巨噬細胞向肝臟的募集[16]。而巨噬細胞分泌的TNF-α 及其兩個受體TNFR1 和TNFR2 表達增加，減少了細胞凋亡和上皮損傷，抑制T 細胞、肝樹突狀細胞和NK 淋巴細胞對肝臟的浸潤，預(yù)防肝外膽管阻塞[17]。

4 BA與膽管增生

Hippo 信號通路參與BA 的發(fā)生發(fā)展，Yes 相關(guān)蛋白（YAP）是Hippo 信號通路的一種效應(yīng)子，YAP 表達促進了膽管細胞和肝細胞的增殖，與膽管增生、維持膽管細胞的特性至關(guān)重要。此外，被確定為YAP 靶基因的ANKRD1 在BA 肝臟中也高表達。YAP 和ANKRD1 在RRV 誘導(dǎo)的BA 小鼠模型中顯著上調(diào)，可能與BA 的膽管增生有關(guān)[18]。TGF-β 信號通路參與BA 的膽管變性過程，異常的轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）表達模式與BA期間正常導(dǎo)管板重塑過程中的發(fā)育停滯有關(guān)，并且可能是上皮-間充質(zhì)相互作用障礙的基礎(chǔ)，發(fā)育關(guān)鍵時期的TGF-β 信號傳導(dǎo)，尤其是TGF-βRⅡ，可以防止肝外膽道系統(tǒng)的喪失[19]。GATA6 是一種與膽道發(fā)育有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，BA 患者的肝細胞中GATA6 表達顯著上調(diào)。BA 肝臟中GATA6 的表達與已知的膽管細胞分化調(diào)節(jié)因子（JAGGED1、HNF1β 和HNF6）的表達相關(guān)，GATA6 是BA 中肝細胞-膽管細胞化生的新標志物和推定的驅(qū)動因素。使用細胞轉(zhuǎn)染模型，證明了GATA6 在HepG2 細胞或原代人肝細胞中的強制表達誘導(dǎo)基因表達模式向膽管細胞表型的轉(zhuǎn)變，表明GATA6 在BA 發(fā)病機制中的功能作用。GATA6 過表達誘導(dǎo)了幾個對早期膽管發(fā)育很重要的基因，包括HNF1、HNF6、JAG1和DKK1。GATA6 過表達后基因表達的變化很可能是逐漸發(fā)生的，經(jīng)過更長的培養(yǎng)時間，更多的膽管細胞譜系標志物可以上調(diào)[20]。

5 BA與肝纖維化

BA 的纖維化過程涉及膽管損傷和膽管細胞凋亡，膽管細胞通過增加纖維化細胞因子、TGF-β1和血小板衍生生長因子-BB（PDGF-BB）的表達來對損傷做出反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，BA 中纖維化的快速進展與轉(zhuǎn)錄因子SOX9 和肝祖細胞增殖顯著相關(guān)[21]。在BA 中表達干/ 祖細胞標志物PROMININ-1（PROM1）的上皮-間充質(zhì)肝祖細胞在膽道纖維化的發(fā)展區(qū)域內(nèi)經(jīng)歷擴增，并隨后分化為產(chǎn)生膠原蛋白的肌成纖維細胞，促炎性Toll 樣受體3（TLR3）激活部分通過TGF-β 通路激活誘導(dǎo)PROM1 和肝祖細胞的肌成纖維細胞分化，以促進BA 相關(guān)膽管纖維化[22-23]。研究觀察到調(diào)節(jié)性T 細胞缺乏以及BA 患者外周血和肝臟中Th1、Th2 和Th17 含量增加，Th1 細胞靠近活化的肝星狀細胞和BA 肝臟中的纖維化區(qū)域，通過IFN-γ/STAT1 途徑加速肝星狀細胞促纖維化標志物的增殖和分泌，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)沉積和纖維化增加[24]。在活化的肝星狀細胞中miR-19b 顯著下調(diào)，降低的α-平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原蛋白表達，并對肝星狀細胞活化產(chǎn)生抑制作用，miR-19b 水平與兒科終末期肝病評分呈負相關(guān)[25]。在肝星狀細胞中miR-145 的表達顯著下調(diào)，使內(nèi)收蛋白3（ADD3）的表達增加，導(dǎo)致BA中的肝纖維化[26]。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)自分泌運動因子（ATX）具有由溶血磷脂酸活性引起的促纖維化作用。BA 患者和對照的外周血白細胞和肝組織中ATX 表達和ATX 啟動子甲基化分析顯示，晚期BA 患者的ATX 啟動子甲基化水平低于早期BA 患者，ATX 表達顯著升高并與BA 患者的ATX 啟動子甲基化降低相關(guān)。ATX 的啟動子低甲基化和過度表達與BA 患者的黃疸狀態(tài)、肝功能障礙和肝臟僵硬呈負相關(guān)。因此，假設(shè)外周血中ATX 啟動子甲基化和ATX 表達可能作為反映術(shù)后BA 中肝纖維化進展的生物標志物。這些發(fā)現(xiàn)表明ATX 的啟動子低甲基化和過度表達可能在BA 肝纖維化的發(fā)病機制中發(fā)揮了促進作用[27]。

6 BA與膽汁酸

在BA 肝臟中實質(zhì)肝細胞（包括肝細胞和膽管細胞）之間的緊密連接和極性復(fù)合物受到嚴重破壞。緊密連接和極性復(fù)合物是在維持膽汁屏障和運輸方面發(fā)揮基本作用的結(jié)構(gòu)。屏障不完整導(dǎo)致膽汁腐蝕上皮和黏膜下組織，從而破壞管腔結(jié)構(gòu)，進一步加重膽汁淤積和肝損傷。研究發(fā)現(xiàn)BA 肝臟中膽管細胞和肝細胞的細胞連接和極性復(fù)合物的組裝存在顯著缺陷[28]。這種缺陷的特點是細胞連接蛋白（ZO1、β-catenin、E-cadherin 和claudin-3）的位置紊亂。Cdc42 及其活性形式Cdc42-GTP 在BA 肝臟中顯著減少，伴隨著上皮連接和細胞極性的破壞與肝細胞中細胞連接和極性復(fù)合物的組裝受損密切相關(guān)，并因膽汁酸腐蝕而加劇[28]。

miRNA 在生物學中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)BA 小鼠的先天細胞因子和miRNA 的mRNA 表達顯著增加，這些細胞因子和miRNA 與膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白/ 核受體（miRNA-22-5p、miRNA-34a-5p 和miRNA-222-3p）相結(jié)合，降低膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白和核受體的mRNA 表達。TNF-α 和IL-1β 增加了miRNA 34a-5p 和miRNA 222-3p 的表達，然后這些miRNA 降低了多種膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白和核受體的表達，膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白的喪失會通過膽汁酸滯留增加肝毒性[29]。當膽汁酸與腸上皮中的法尼醇X 受體結(jié)合時，會誘導(dǎo)成纖維細胞生長因子（FGF）19 的表達。然后，F(xiàn)GF19 由門靜脈流轉(zhuǎn)運，通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）途徑導(dǎo)致細胞色素P450、家族7、亞家族A、多肽1（CYP7A1）（膽汁酸生物合成的關(guān)鍵酶）的轉(zhuǎn)錄抑制。因此FGF19 在BA 肝細胞中增加且FGF19 通路不會抑制膽汁酸合成[30]。

7 BA與腸道微生物

腸道微生物組在宿主代謝、營養(yǎng)和免疫功能中發(fā)揮著重要作用，其多樣性和/或組成發(fā)生改變，稱為生態(tài)失調(diào)，在疾病狀態(tài)（包括肝臟疾病）中有所描述。成年期肝腸微生物組的探索主要集中在非酒精性肝病、肝硬化（主要是酒精或病毒性病因）和膽汁淤積性肝?。ㄈ缭l(fā)性硬化性膽管炎），微生物特征與疾病嚴重程度相關(guān)。BA 中腸道微生物群的研究僅限于基于培養(yǎng)的方法，但分子研究正在興起，雖然處于起步階段，但強調(diào)了腸桿菌科和鏈球菌的潛在致病作用，以及雙歧桿菌的潛在有益作用。細菌易位和腸道微生物組衍生代謝物的產(chǎn)生是肝病發(fā)病機制中的關(guān)鍵宿主微生物組機制途徑[31]。BA 在微生物組中表現(xiàn)出較低的多樣性和顯著的結(jié)構(gòu)分離。在微生物分類單元中的門水平上，變形桿菌數(shù)量增加，而擬桿菌數(shù)量在BA 中減少。在微生物分類單元中的屬水平上，鏈球菌和克雷伯氏菌等幾種潛在病原體在BA 中顯著增加，而雙歧桿菌和幾種產(chǎn)丁酸鹽細菌的數(shù)量下降。在Kasai 手術(shù)后，微生物組也受到干擾。BA 的微生物分類單元顯示出與肝功能的顯著相關(guān)性。此外，鏈球菌/擬桿菌的豐度比在區(qū)分BA 與健康對照方面顯示出巨大的作用。BA 中腸道膽汁酸顯著降低，梭菌與初級/次級膽汁酸的比例呈正相關(guān)。腸道微生物生態(tài)失調(diào)，可能由膽汁酸減少引起，與肝功能有關(guān)，對BA 具有良好的診斷潛力[32]。

8 總結(jié)

綜上所述，BA 的發(fā)病機制與多種基因有關(guān)，這些基因通過影響膽管細胞及肝細胞的增殖與凋亡參與BA 的病程。病毒感染被認為是BA 的始動環(huán)節(jié)，炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)通過多種炎癥細胞因子和免疫細胞因子導(dǎo)致膽管細胞損傷，多個信號通路影響膽管細胞增殖及變性。膽管細胞的損傷和增殖及炎癥反應(yīng)促進肝臟發(fā)生肝纖維化。膽汁酸腐蝕上皮和黏膜下組織，破壞管腔結(jié)構(gòu)，進一步加重膽汁淤積和肝損傷。腸道微生物也可能是BA 的潛在發(fā)病因素，對此仍需要進一步的研究，明確BA 的發(fā)病機制，為如何減少和避免BA 的發(fā)生提供新思路。