王苑菲 王榆雅 陳宗存 王毅 賴舒暢 符茂雄

(1海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科， 海南 ?？?570100；2海南省人民醫(yī)院藥學(xué)部)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致終末期腎病的主要原因〔1〕。高血糖可引起活性氧大量產(chǎn)生，引起氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷，影響腎小球?yàn)V過(guò)功能，這是DN發(fā)生發(fā)展的重要組成部分〔2〕。因此，抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡和炎癥對(duì)DN防治意義重大。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類(lèi)具有mRNA結(jié)構(gòu)特征、蛋白編碼能力缺失的內(nèi)源性RNA，其通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)在包括DN在內(nèi)的多種糖尿病中發(fā)揮作用〔3,4〕。鋅指結(jié)構(gòu)反義轉(zhuǎn)錄本(ZFAS)1是一種新型lncRNA，研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中ZFAS1表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)ZFAS1可提高軟骨細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞凋亡〔5〕。過(guò)表達(dá)ZFAS1還可減輕糖氧剝奪/再灌注誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞炎癥損傷、氧化損傷和細(xì)胞凋亡，是缺血再灌注腦損傷的潛在治療靶點(diǎn)〔6〕。生物信息學(xué)分析顯示miR-34b-5p與ZFAS1之間存在相互作用。既往研究表明，過(guò)表達(dá)miR-34b-5p可改善高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，改善細(xì)胞凋亡〔7〕。因此，本研究旨在探討ZFAS1靶向miR-34b-5p在預(yù)防高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人腎小管上皮細(xì)胞HK-2購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；DMEM培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；ZFAS1過(guò)表達(dá)載體(pcDNA-ZFAS1)、空載體(pcDNA)、miR-34b-5p抑制物(anti-miR-34b-5p)及其陰性對(duì)照(anti-miR-NC)、miR-34b-5p模擬物(miR-34b-5p mimics)及其陰性對(duì)照(miR-NC)、熒光素酶報(bào)告載體由廣州瑞博生物公司提供；LipofectamineTM2000、Trizol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒購(gòu)于大連TAKARA生物公司；白細(xì)胞介素(IL)-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒、腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA檢測(cè)試劑盒、兔抗B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體、兔抗Bcl相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、山羊抗兔二抗購(gòu)于上海艾博抗公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(AnnexinV-FITC)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海貝博生物公司。

1.2模型構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)分組 復(fù)蘇HK-2細(xì)胞后，用葡萄糖含量分別為5.5、25.0 mmol/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞48 h，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)ZFAS1和miR-34b-5p表達(dá)水平。隨后將HK-2細(xì)胞分為對(duì)照(Con)組：HK-2細(xì)胞以葡萄糖含量為5.5 mmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；高糖(HG)組：HK-2細(xì)胞以葡萄糖含量為25.0 mmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)〔8〕；HG+pcDNA組：轉(zhuǎn)染pcDNA后進(jìn)行高糖處理；HG+pcDNA-ZFAS1組：轉(zhuǎn)染pcDNA-ZFAS1后進(jìn)行高糖處理；HG+anti-miR-NC組：轉(zhuǎn)染anti-miR-NC后進(jìn)行高糖處理；HG+anti-miR-34b-5p組：轉(zhuǎn)染anti-miR-34b-5p后進(jìn)行高糖處理；HG+pcDNA-ZFAS1+miR-NC組：共轉(zhuǎn)染pcDNA-ZFAS1和miR-NC后進(jìn)行高糖處理；HG+pcDNA-ZFAS1+miR-34b-5p組：共轉(zhuǎn)染pcDNA-ZFAS1、miR-34b-5p mimics后進(jìn)行高糖處理。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)嚴(yán)格遵照LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3RT-qPCR檢測(cè)ZFAS1和miR-34b-5p表達(dá)水平 收集各組HK-2細(xì)胞，Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定其A260/A280值在1.8～2.0之間后，利用cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取2 μl的cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。ZFAS1上游引物5′-ACGTGCAGACATCTACAACCT-3′；下游引物5′-TACTTCCAACACCCGCAT-3′；miR-34b-5p上游引物5′-GGGTAGGCAGTGTCATTAGC-3′，下游引物5′-AACAACCAACACAACCCAAC-3′；GAPDH上游引物5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′，下游引物5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。2-ΔΔCt法計(jì)算ZFAS1(內(nèi)參為GAPDH)和miR-34b-5p(內(nèi)參為U6)相對(duì)表達(dá)水平。

1.4檢測(cè)培養(yǎng)液上清中IL-6和TNF-α含量 收集各組HK-2細(xì)胞，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液上清，按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)培養(yǎng)液中IL-6和TNF-α含量。取100 μl待檢測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加入反應(yīng)孔內(nèi)，取100 μl稀釋液加入空白對(duì)照孔內(nèi)，以空白對(duì)照孔調(diào)零后，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度值，參照標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算IL-6和TNF-α含量。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 胰酶消化后，收集各組HK-2細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸、洗滌細(xì)胞一次。加入300 μl的1×結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5 μl的Annexin V-FITC進(jìn)行標(biāo)記，室溫避光反應(yīng)15 min，加入5 μl的碘化丙啶(PI)染色，補(bǔ)加200 μl的1×結(jié)合緩沖液，混勻后上機(jī)檢測(cè)。

1.6Western印跡檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá) 取各組HK-2細(xì)胞，放射免疫沉淀分析法(RIPA)提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取適量的蛋白樣品與等體積的上樣緩沖液混合，沸水浴3 min變性后，按照每加樣孔30 μg進(jìn)行上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離細(xì)胞蛋白后，將其轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。將PVDF膜與5%的脫脂奶粉37℃孵育結(jié)合2 h，用一抗溶液37℃孵育膜2 h，再用二抗溶液37℃孵育膜1 h。利用化學(xué)發(fā)光試劑顯色后，以GAPDH為內(nèi)參，對(duì)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。

1.7雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將含有miR-34b-5p結(jié)合位點(diǎn)的野生型(WT)ZFAS1序列或含有miR-34b-5p結(jié)合位點(diǎn)的ZFAS1突變(MUT)序列插入pGL3載體，構(gòu)建WT-ZFAS1、MUT-ZFAS1熒光素酶報(bào)告載體。將WT-ZFAS1、MUT-ZFAS1分別與miR-34b-5p mimics或miR-34b-5p共轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞，48 h后熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1lncRNA ZFAS1和miR-34b-5p在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷中的表達(dá) 與Con組比較，HG組HK-2細(xì)胞中ZFAS1表達(dá)顯著降低，miR-34b-5p表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 lncRNA ZFAS1和miR-34b-5p在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷中的表達(dá)

2.2lncRNA ZFAS1過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 與Con組比較，HG組HK-2細(xì)胞中ZFAS1表達(dá)顯著降低，培養(yǎng)液中IL-6和TNF-α水平顯著升高(均P<0.05)；與HG+pcDNA組比較，HG+pcDNA-ZFAS1組HK-2細(xì)胞中ZFAS1表達(dá)顯著升高，培養(yǎng)液中IL-6和TNF-α水平顯著降低(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 lncRNA ZFAS1過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響

2.3lncRNA ZFAS1過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響 與Con組比較，HG組HK-2細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低；與HG+pcDNA組比較，HG+pcDNA-ZFAS1組HK-2細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖1、圖2。

表3 對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響

2.4抑制miR-34b-5p表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的影響 與HG+anti-miR-NC組比較，HG+anti-miR-34b-5p組HK-2細(xì)胞miR-34b-5p表達(dá)水平顯著降低，凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高，培養(yǎng)液中IL-6和TNF-α水平顯著降低(均P<0.001)。見(jiàn)圖3、表4、圖4。

1～4：Con組，HG組，HG+pcDNA組，HG+pcDNA-ZFAS1組圖1 Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

圖2 lncRNA ZFAS1過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響

1～2：HG+anti-miR-NC組,HG+anti-miR-34b-5p組圖3 Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表4 抑制miR-34b-5p表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的影響

圖4 抑制miR-34b-5p表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響

2.5lncRNA ZFAS1靶向調(diào)控miR-34b-5p的表達(dá) miR-34b-5p與lncRNA ZFAS1之間存在互補(bǔ)結(jié)合序列，見(jiàn)圖5。miR-34b-5p mimics和WT-ZFAS1共轉(zhuǎn)染組HK-2細(xì)胞的熒光素酶活性較miR-NC和WT-ZFAS1共轉(zhuǎn)染組顯著降低(P<0.001)；而miR-34b-5p mimics和MUT-ZFAS1共轉(zhuǎn)染組HK-2細(xì)胞的熒光素酶活性相較于miR-NC和MUT-ZFAS1共轉(zhuǎn)染組無(wú)顯著變化，見(jiàn)表5。pcDNA-ZFAS1組HK-2細(xì)胞miR-34b-5p表達(dá)水平(0.46±0.04)較pcDNA組(1.00±0.05)顯著降低；si-ZFAS1組HK-2細(xì)胞miR-34b-5p表達(dá)水平(2.37±0.24)較si-NC組顯著升高(0.99±0.03，P<0.05)。

圖5 lncRNA ZFAS1的序列中含有與miR-34b-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

2.6miR-34b-5p過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了lncRNA ZFAS1過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的作用 與HG+pcDNA-ZFAS1+miR-NC組比較，HG+pcDNA-ZFAS1+miR-34b-5p組HK-2細(xì)胞miR-34b-5p表達(dá)水平顯著升高，凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，培養(yǎng)液中IL-6和TNF-α水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖6、圖7、表6。

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

1，2：HG+pcDNA-ZFAS1+miR-NC組，HG+pcDNA-ZFAS1+miR-34b-5p組圖6 Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

圖7 miR-34b-5p過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了lncRNA ZFAS1過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的作用

表6 miR-34b-5p過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了lncRNA ZFAS1過(guò)表達(dá)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的作用

3 討 論

糖尿病患者長(zhǎng)期高血糖刺激誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷和凋亡是促進(jìn)DN發(fā)生的主要因素〔2〕。因此，有效抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷和凋亡的作用對(duì)減緩DN發(fā)展、開(kāi)發(fā)新的治療策略具有重要意義。

lncRNA作為細(xì)胞生長(zhǎng)和機(jī)體發(fā)育的重要參與者，牛磺酸上調(diào)基因(TUG)1〔3〕、HOXA遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)錄本(Hottip)〔9〕、肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(MALAT)1〔10〕等多種lncRNA已被證實(shí)與DN進(jìn)展有關(guān)。提示，lncRNA可能是DN治療的潛在靶點(diǎn)。ZFAS1是一種高度保守的lncRNA，其異常表達(dá)與多種癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)〔11,12〕。近年研究顯示，創(chuàng)傷性腦損傷小鼠海馬、缺血再灌注腦損傷患者中ZFAS1表達(dá)改變，上調(diào)ZFAS1表達(dá)具有抗炎抗凋亡作用〔6,13〕。本研究結(jié)果提示ZFAS1表達(dá)下調(diào)可能與DN腎小管上皮細(xì)胞損傷有關(guān)。在高血糖刺激下炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α等分泌增多，可直接損傷腎小管上皮細(xì)胞〔14〕。此外，高血糖刺激還可誘導(dǎo)活性氧生成并促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡〔15〕。本研究顯示，轉(zhuǎn)染ZFAS1過(guò)表達(dá)載體上調(diào)ZFAS1表達(dá)可減輕高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡，抑制IL-6、TNF-α分泌。Bcl-2作為一種抗凋亡基因，其主要生理功能是抑制細(xì)胞凋亡，然而B(niǎo)ax則促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔16〕。本研究顯示，上調(diào)ZFAS1表達(dá)還可減輕高糖誘導(dǎo)對(duì)Bcl-2和Bax表達(dá)的影響。以上研究說(shuō)明過(guò)表達(dá)ZFAS1可減輕高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

miR-34b-5p隸屬于miR-34家族，已被證實(shí)與多種炎癥性疾病相關(guān)。如急性移植物抗宿主病、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中miR-34b-5p表達(dá)水平顯著升高〔17,18〕。miR-34b-5p在急性肺損傷小鼠模型中亦呈表達(dá)上調(diào)，抑制miR-34b-5p表達(dá)可減輕肺部炎癥反應(yīng)，減少肺泡上皮細(xì)胞凋亡，改善急性肺損傷〔19,20〕。本研究顯示，高糖刺激可升高HK-2細(xì)胞miR-34b-5p表達(dá)水平，抑制miR-34b-5p表達(dá)可減輕高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，與Lv等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)基本吻合。進(jìn)一步研究證實(shí)，ZFAS1對(duì)miR-34b-5p具有靶向負(fù)調(diào)控作用。此外，本研究顯示過(guò)表達(dá)miR-34b-5p還可逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)ZFAS1對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡、炎性因子分泌及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。提示ZFAS1通過(guò)靶向調(diào)控miR-34b-5p影響高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡，減輕細(xì)胞炎癥反應(yīng)。