鄭睿 拜爭剛 胡潔玉 徐學(xué)海

(1甘肅省婦幼保健院耳鼻咽喉頭頸外科，甘肅 蘭州 730050；2南京理工大學(xué)循證健康研究中心)

我國華南地區(qū)是鼻咽癌的高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率約占全球鼻咽癌發(fā)病率的80%〔1〕；盡管手術(shù)、放療和化療等治療手段使患者5年總體生存率明顯改善，但還有部分發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移患者療效不佳〔2〕。目前，關(guān)于鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制并不完全清楚，但與包括微小RNA(miRNA)在內(nèi)的多種基因的調(diào)控密切相關(guān)〔3～5〕。近年來，有研究指出miR-485-5p在鼻咽癌中表達(dá)降低，其低表達(dá)與鼻咽癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切〔6〕；但是，miR-485-5p在鼻咽癌進(jìn)展中的調(diào)節(jié)機(jī)制仍不明確。本研究通過觀察miR-485-5p在鼻咽癌細(xì)胞系CNE2中的表達(dá)情況，分析miR-485-5p過表達(dá)對CNE2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 KSFM培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號：10724-011)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批號：11011-6123)；DMEM培養(yǎng)基(含青鏈霉素雙抗)、胰蛋白酶和脂質(zhì)體2000(北京索萊寶科技有限公司，批號：12100、T8150、L7800)；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司，批號：15596026、160097)；SYBR Premix Ex Taq實時熒光定量PCR試劑盒(大連TAKARA公司，批號：RR420A)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，批號：RG027)；miR-485-5p mimics及其陰性對照(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，批號：B05001、B04001)；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)檢測試劑盒(上海貝博生物科技公司，批號：BB-4101)；兔抗人E-鈣黏蛋白單克隆抗體、N-鈣黏蛋白多克隆抗體、波形蛋白多克隆抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(美國Abcam公司，批號：ab70129、ab76134、ab137321、ab181602)；兔抗人CDC28蛋白激酶調(diào)節(jié)亞基(CKS)1B多克隆抗體(美國Abnova公司，批號：PAB26892)。實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司，型號：QuantStudio5)；酶標(biāo)儀(雷杜生命科學(xué)股份有限公司，型號：RT-6100)；顯微鏡(日本奧林巴斯公司，型號：Olympus DP50)；流式細(xì)胞儀、全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(美國BD公司，型號：FACSCalibur、Gel Doc EZ)。

1.2細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng) 人永生化鼻咽上皮細(xì)胞系NP69和人鼻咽癌細(xì)胞系CNE2來自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。NP69細(xì)胞采用無血清KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)，CNE2采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，兩種細(xì)胞均在條件為飽和濕度、5%CO2和37℃的美國Thermo 371型細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.3實時熒光定量PCR檢測miR-485-5p表達(dá) 采用Trizol法從NP69細(xì)胞、CNE2細(xì)胞提取總RNA后，使用分光光度計檢測RNA樣品的濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄后，參照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書的操作步驟在熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR，其中每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。以U6作為內(nèi)參，通過2-△△Ct法計算miR-485-5p表達(dá)量。miR-485-5p上游引物：5′-AGAGGCTGGCCGTGATGAATTC-3′，下游引物：5′-CTCGATTCGTCACTCACA-3′；U6上游引物：5′-CAGCGTTAGCTACGAGACTGC-3′，下游引物：5′-AGTGTCAGATCAAGTACTGC-3′。

1.4分組及轉(zhuǎn)染 實驗分為Con組(正常培養(yǎng))、NC組(轉(zhuǎn)染mimics陰性對照)和mimics組(轉(zhuǎn)染miR-485-5p mimics)。待CNE2細(xì)胞培養(yǎng)至70%融合度時，依據(jù)脂質(zhì)體2000的操作步驟將miR-485-5p mimics及其陰性對照轉(zhuǎn)染至CNE2細(xì)胞中，Con組正常培養(yǎng)CNE2細(xì)胞；2 d后，收集各組細(xì)胞，采用實時熒光定量PCR檢測miR-485-5p表達(dá)水平來評價是否轉(zhuǎn)染成功。

1.5噻唑藍(lán)法檢測增殖活性 在96孔細(xì)胞板上接種CNE2細(xì)胞后，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)至70%融合度時，根據(jù)1.4中分組并轉(zhuǎn)染處理；在轉(zhuǎn)染至所需時間(1、2、3、4 d)時，棄培養(yǎng)基，每孔加入20 μl噻唑藍(lán)(5 g/L)；4 h后，添加二甲基亞砜150 μl，充分混勻。利用酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔的光密度(OD)值。

1.6Transwell小室檢測侵襲和遷移 轉(zhuǎn)染2 d后使用無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105個/ml。在以Matrige基質(zhì)膠包被(侵襲)或未包被(遷移)的Transwell上室中添加100 μl細(xì)胞懸液，下室添加600 μl含血清的培養(yǎng)基；培養(yǎng)1 d后，取出小室；吸去上室液體，并用棉簽擦去基質(zhì)膠后，以4%多聚甲醛固定、0.1%結(jié)晶紫染色各15 min；采用Olympus DP50型顯微鏡觀察穿膜細(xì)胞數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染2 d后收集各組CNE2細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min棄上清后，以500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞；先后加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，充分混勻后，置于避光條件下反應(yīng)15 min；在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.8Western印跡檢測細(xì)胞中E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白和CKS1B蛋白表達(dá) 收集培養(yǎng)2 d后的Con組、NC組和mimics組CNE2細(xì)胞，通過使用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，蛋白定量后(考馬斯亮藍(lán)法)，將蛋白樣品按照每泳道60 μg上樣至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上后，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h；以稀釋的一抗〔E-鈣黏蛋白(1∶500)、N-鈣黏蛋白(1∶200)、波形蛋白(1∶1 000)、CKS1B(1∶800)和GAPDH(1∶1 000)〕4℃孵育過夜后，Tris緩沖鹽水(TBS緩沖液)洗膜3次后，加入稀釋的二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h；曝光顯影后，采用全自動凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析目的條帶灰度值，并以GAPDH為內(nèi)參計算上述蛋白的相對表達(dá)水平。

1.9雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-485-5p和CKS1B的靶向關(guān)系 將CKS1B 3′UTR中miR-485-5p結(jié)合位點序列和突變型序列分別克隆至pmirGLO載體上，并記為CKS1B-WT和CKS1B-MUT載體質(zhì)粒；將以上載體分別與miR-485-5p mimics及其陰性對照共轉(zhuǎn)染至CNE2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染的具體操作按脂質(zhì)體2000說明書進(jìn)行，2 d后參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-485-5p在鼻咽癌CNE2細(xì)胞中呈低表達(dá)而轉(zhuǎn)染后升高 miR-485-5p在人鼻咽癌細(xì)胞系CNE2中表達(dá)水平(0.36±0.02)較人永生化鼻咽上皮細(xì)胞系NP69(0.98±0.06)明顯降低(t=29.409，P<0.05)。與Con組(0.97±0.05)、NC組(0.95±0.06)比較，mimics組CNE2細(xì)胞中miR-485-5p表達(dá)水平明顯升高(16.75±3.18，P<0.05)。

2.2miR-485-5p過表達(dá)抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖 與Con組比較，NC組細(xì)胞增殖活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與Con組、NC組比較，mimics組在轉(zhuǎn)染2、3、4 d時細(xì)胞增殖活力明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖活力(OD值)比較

2.3miR-485-5p過表達(dá)抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞侵襲和遷移 與Con組、NC組比較，mimics組細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯降低(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 Transwell小室實驗檢測各組CNE2細(xì)胞侵襲和遷移(結(jié)晶紫染色，×200)

表2 各組細(xì)胞侵襲和遷移能力比較個)

2.4miR-485-5p過表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌CNE2細(xì)胞凋亡 與Con組〔(7.32±0.45)%〕、NC組〔(6.86±0.52)%〕比較，mimics組細(xì)胞凋亡率明顯升高〔(19.57±2.13)%，P<0.05〕；NC組與Con組細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測各組CNE2細(xì)胞凋亡

2.5miR-485-5p過表達(dá)抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 與Con組比較，NC組CNE2細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與Con組、NC組比較，mimics組CNE2細(xì)胞中E-鈣黏蛋白表達(dá)水平明顯升高，而N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 各組E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)

表3 各組CNE2細(xì)胞中E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)水平比較

2.6CKS1B是miR-485-5p的靶基因 TargetScanHuman軟件預(yù)測到CKS1B 3′UTR序列中存在能夠與miR-485-5p互補的核苷酸位點。見圖4。與NC+CKS1B-WT組(1.02±0.09)比較，mimics+CKS1B-WT組細(xì)胞熒光素酶活性明顯降低(0.33±0.05，P<0.05)；但NC+CKS1B-MUT組和mimics+CKS1B-MUT組細(xì)胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(0.99±0.06、0.95±0.06，P>0.05)。Western印跡檢測Con組、NC組和mimics組細(xì)胞中CKS1B蛋白表達(dá)水平分別為0.51±0.03，0.49±0.03，0.28±0.02，3組間CKS1B蛋白表達(dá)水平存在明顯差異(F=199.227，P<0.05)；但mimics組細(xì)胞中CKS1B蛋白表達(dá)水平較NC組、Con組均明顯降低(P<0.05)而NC組細(xì)胞中CKS1B蛋白表達(dá)水平與Con組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

圖4 miR-485-5p與CKS1B 3′UTR互補結(jié)合位點

圖5 Western印跡檢測miR-485-5p對CKS1B蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

研究表明，在鼻咽癌中，大量miRNAs異常表達(dá)，其可能通過調(diào)控惡性生物學(xué)行為影響著鼻咽癌發(fā)生發(fā)展〔7,8〕。Wang等〔9〕指出，miR-1178-3p在鼻咽癌組織中高表達(dá)，可通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲加速鼻咽癌進(jìn)展，其機(jī)制與靶向下調(diào)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(STK)4有關(guān)；Li等〔10〕發(fā)現(xiàn)，miR-141-3p在鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可通過靶向調(diào)控非轉(zhuǎn)移性細(xì)胞蛋白(NME)1促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。除了miR-1178-3p和miR-141-3p等在鼻咽癌中發(fā)揮著致癌作用外，還有部分miRNAs扮演著抑癌基因的角色。Zhu等〔11〕指出，miR-342在鼻咽癌中呈現(xiàn)低表達(dá)，且其表達(dá)水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，體外細(xì)胞實驗上調(diào)miR-342表達(dá)后可通過靶向調(diào)控E盒結(jié)合鋅指蛋白(ZEB)1抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲；王菲等〔12〕還發(fā)現(xiàn)，miR-342過表達(dá)可通過抑制核因子(NF)-κB信號通路激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Cui等〔13〕研究指出，miR-143在鼻咽癌組織中表達(dá)下調(diào)，可通過靶向調(diào)控成蛋白樣亞家族(FMNL)1抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。隨著研究的深入，越多越多miRNAs被證實在鼻咽癌中發(fā)揮作用，然而仍有一些miRNAs的功能未被研究。miR-485-5p是一個通過調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為而發(fā)揮抑癌作用的miRNA。miR-485-5p可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡，同時提高化療敏感性〔14〕。Pan等〔15〕在結(jié)直腸癌中指出，miR-485-5p是一種重要的預(yù)后標(biāo)志物，可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡發(fā)揮著腫瘤抑制因子的作用。周小娟等〔6〕指出，miR-485-5p在鼻咽癌中異常低表達(dá)，但其在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制并不清楚。本研究提示，在鼻咽癌中，miR-485-5p可通過影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)揮著抑癌基因的作用。

CDC28蛋白激酶調(diào)節(jié)亞基(CKS)1B是高度保守的CKS1家族成員，位于1q21染色體上，在細(xì)胞周期過程中可通過與周期蛋白依賴性激酶結(jié)合調(diào)控細(xì)胞分裂〔16〕，與非小細(xì)胞肺癌和多發(fā)性骨髓瘤等腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔17,18〕。Zeng等〔19〕報道指出，CKS1B在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中異常高表達(dá)，而沉默其表達(dá)可通過抑制有絲分裂原活化蛋白激酶(MEK)/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號通路活化抑制細(xì)胞增殖、侵襲、遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Shrestha等〔20〕在胃癌中發(fā)現(xiàn)，miR-204抑制癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制與其靶向調(diào)控CKS1B表達(dá)有關(guān)。Lee等〔21〕發(fā)現(xiàn)，CKS1B在鼻咽癌中異常高表達(dá)，且其表達(dá)水平與患者局部無復(fù)發(fā)生存率、無轉(zhuǎn)移生存率和特異性生存率降低有關(guān)。再次證明了miR-485-5p靶向負(fù)調(diào)控CKS1B表達(dá)。提示，miR-485-5p可能通過靶向調(diào)控CKS1B影響鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為，進(jìn)而發(fā)揮抑癌作用。

綜上，本研究在體外細(xì)胞實驗中初步闡述了miR-485-5p可抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡；并首次揭示了miR-485-5p的抑癌作用可能與其靶向調(diào)控CKS1B表達(dá)有關(guān)。后續(xù)將以此作為一個理論基礎(chǔ)開展體內(nèi)實驗，以期為miR-485-5p作為候選靶點參與鼻咽癌基因治療提供一定的參考依據(jù)。