王慧 楊淼 任慧敏 趙婷婷 韓樹池 韓寶華

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北 張家口 075000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一類以不完全可逆氣流受限為特征的呼吸系統(tǒng)疾病，發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，臨床上主要使用支氣管舒張劑及糖皮質(zhì)激素進(jìn)行治療，但病程中會(huì)出現(xiàn)急性加重反復(fù)發(fā)作、氣道狹窄進(jìn)行性加重，最終發(fā)展為呼吸衰竭、甚至死亡〔1，2〕。氣道內(nèi)炎癥、氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的異常激活與氣道狹窄、氣道上皮損害的發(fā)生密切相關(guān)，是目前研究COPD發(fā)病機(jī)制及防治手段的主要靶點(diǎn)。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是體內(nèi)廣泛存在的絲蘇氨酸蛋白激酶，胰島素抵抗、炎癥、氧化應(yīng)激、缺血缺氧等病理因素能夠刺激AMPK磷酸化為p-AMPK，p-AMPK能夠起到抗感染、抗氧化應(yīng)激、抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等作用，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)組織和臟器的保護(hù)。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，COPD小鼠肺組織中p-AMPK的表達(dá)增加，使用AMPK的激動(dòng)劑能夠減輕COPD小鼠肺組織的炎癥、氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激〔3，4〕。因此，AMPK是近些年受到越來越多關(guān)注的COPD治療靶點(diǎn)。二甲雙胍是臨床上治療糖尿病的常用藥物，多項(xiàng)基礎(chǔ)研究證實(shí)，二甲雙胍通過激活A(yù)MPK發(fā)揮抑制肝糖原輸出、增加骨骼肌攝取葡萄糖的作用。有研究在呼吸系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了二甲雙胍的治療價(jià)值，王曄等〔5〕證實(shí)二甲雙胍抑制肺纖維化的作用與激活A(yù)MPK有關(guān)，Wu等〔6〕證實(shí)二甲雙胍激活A(yù)MPK在急性肺損傷過程中起保護(hù)作用，周秋華等〔7〕發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能夠降低糖尿病合并COPD患者急性發(fā)作的發(fā)生率。但二甲雙胍治療COPD是否直接改善肺組織病理改變、是否通過激活A(yù)MPK通路發(fā)揮COPD的治療作用尚不清楚，二甲雙胍發(fā)揮治療作用的機(jī)制也未闡明。本研究以野生型(WT)小鼠和肺AMPK特異性敲除小鼠為對(duì)象，探討二甲雙胍調(diào)控AMPK通路對(duì)穩(wěn)定期COPD小鼠的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 WT C57BL/6J小鼠購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，生產(chǎn)許可SCXK(滬)2018-0006；Sftpc-Cre小鼠(遺傳背景C57BL/6J)、AMPKFLOX/+小鼠(遺傳背景C57BL/6J)購自上海南方模式生物科技公司。

1.2試劑與儀器 二甲雙胍購自Sigma公司，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自上海歌凡生物，RIPA蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司，AMPK、p-AMPK、核因子(NF)-κB、核因子E2相關(guān)因子(Nrf)2、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-12一抗，腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8檢測試劑盒購自上海西唐公司，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自南京檢測研究所。長40 cm、寬25 cm、高20 cm自制薰煙箱，正置顯微鏡為Nikon公司，電泳系統(tǒng)及成像系統(tǒng)為上海天能公司。

1.3肺特異性AMPK基因敲除小鼠的獲取 Sftpc-Cre小鼠與AMPKFLOX/+小鼠同籠，獲得AMPK+/+Cre+、AMPKFLOX /+Cre+、AMPKFLOX/FLOXCre+的后代小鼠，剪取尾巴末端約0.5cm，采用基因組DNA提取試劑盒提取DNA，采用北京唯德生物科技有限公司提供的引物對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物為一條帶的即為AMPKFLOX/FLOXCre+小鼠，肺內(nèi)特異性表達(dá)的Cre酶可以剪切AMPK兩個(gè)loxP位點(diǎn)間的序列，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)AMPK基因的肺特異性敲除。

1.4動(dòng)物分組、造模及給藥 野生型C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為AMPK-WT組、AMPK-WT+COPD組、AMPK-WT+COPD+二甲雙胍組，肺AMPK特異性敲除小鼠隨機(jī)分為AMPK-敲除(KO)組、AMPK-KO+COPD組、AMPK-KO+COPD+二甲雙胍組，每組8只。采用香煙煙霧吸入法制備COPD模型，方法如下：將小鼠放入自制薰煙箱，每周一至周五進(jìn)行煙霧吸入，2次/d、上午9點(diǎn)開始煙霧吸入、下午3點(diǎn)開始煙霧吸入，每次使用2支香煙，兩支香煙煙霧吸入間隔10 min，整個(gè)煙霧吸入持續(xù)12 w。二甲雙胍干預(yù)方法如下：COPD造模第7周起，在上午香煙煙霧吸入前1 h給予200 mg/kg二甲雙胍腹腔注射，1次/d，連續(xù)給藥6 w。

1.5標(biāo)本收集 末次煙霧吸入后24 h處死小鼠，做頸部切開暴露氣管，插入灌流針并用1 ml磷酸鹽緩沖液進(jìn)行肺泡灌洗，連續(xù)3次，收集肺泡灌洗液(BALF)，4℃、1 500 r/min離心10 min后收集上清，-80℃保存；解剖肺組織，左肺組織用4%多聚甲醛固定后制作蠟塊，右肺組織用液氮冷凍后放入-80℃保存。

1.6肺組織病理改變的檢測 取肺組織的蠟塊，制作病理切片后采用HE染色試劑盒進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察肺組織病理改變，測量肺泡平均截距(MLI)。

1.7肺組織中p-AMPK、NF-κB、Nrf2、CHOP、Caspase-12檢測 取適量液氮冷凍的肺組織，加入RIPA裂解液勻漿，提取肺組織中的蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白含量，取含有20 μg蛋白的樣本加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，進(jìn)行電泳后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1 h，AMPK、p-AMPK、NF-κB、Nrf2、CHOP、Caspase-12一抗4℃孵育PVDF膜過夜。次日，辣根過氧化物酶(HRP)二抗室溫孵育PVDF膜1 h，最后在凝膠成像儀中顯影得到蛋白條帶，根據(jù)條帶灰度值計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.8BALF中TNF-α、IL-6、IL-8、MDA、SOD的檢測 取BALF標(biāo)本，采用試劑盒檢測TNF-α、IL-6、IL-8、MDA、SOD的含量，均按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組體重比較 造模第3周起，AMPK-WT+COPD組體重明顯低于AMPK-WT組，AMPK-KO+COPD組體重明顯低于AMPK-WT+COPD組(P<0.05)；造模第10周起，AMPK-WT+COPD+二甲雙胍組體重明顯高于AMPK-WT+COPD組，AMPK-KO+COPD+二甲雙胍組體重明顯低于AMPK-WT+COPD+二甲雙胍組(P<0.05)；AMPK-WT組與AMPK-KO組體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組體重比較

2.2各組肺組織病理改變 與AMPK-WT組比較，AMPK-WT+COPD組小鼠肺間質(zhì)內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤、支氣管管腔狹窄，MLI明顯增加(P<0.05)；與AMPK-WT+COPD組比較，AMPK-WT+COPD+二甲雙胍組肺間質(zhì)內(nèi)少量炎癥細(xì)胞浸潤、未見明顯支氣管管腔狹窄，MLI明顯降低(P<0.05)；與AMPK-WT+COPD+二甲雙胍組比較，AMPK-KO+COPD+二甲雙胍組肺間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤增加、支氣管管腔狹窄，MLI明顯增加(P<0.05)；與AMPK-WT+COPD組比較，AMPK-KO+COPD組小鼠肺間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤及支氣管管腔狹窄均加重，MLI明顯增加(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 各組肺組織病理改變(HE染色，×400)

2.3各組肺組織中p-AMPK表達(dá)比較 與AMPK-WT組(1.00±0.0.19)比較，AMPK-WT+COPD組肺組織中p-AMPK的表達(dá)水平(1.73±0.20)明顯增加(P<0.05)；與AMPK-WT+COPD組比較，AMPK-WT+COPD+二甲雙胍組肺組織中p-AMPK的表達(dá)水平(2.78±0.42)明顯增加(P<0.05)。AMPK-KO組、AMPK-KO+COPD組、AMPK-KO+COPD+二甲雙胍組小鼠肺組織中均不表達(dá)AMPK及p-AMPK。見圖2。

2.4各組AMPK通路下游炎癥反應(yīng)比較 與AMPK-WT組比較，AMPK-WT+COPD組肺組織中NF-κB表達(dá)水平及BALF中TNF-α、IL-6、IL-8的含量均明顯增加(P<0.05)；與AMPK-WT+COPD組比較，AMPK-WT+COPD+二甲雙胍組肺組織中NF-κB表達(dá)水平及BALF中TNF-α、IL-6、IL-8的含量均明顯降低(P<0.05)；與AMPK-WT+COPD+二甲雙胍組比較，AMPK-KO+COPD+二甲雙胍組肺組織中NF-κB表達(dá)水平及BALF中TNF-α、IL-6、IL-8的含量均明顯增加(P<0.05)；與AMPK-WT+COPD組比較，AMPK-KO+COPD組肺組織中NF-κB表達(dá)水平及BALF中TNF-α、IL-6、IL-8含量均明顯增加(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組肺組織MLI、BALF中NF-κB表達(dá)及TNF-α、IL-6、IL-8含量比較

1～6：AMPK-WT組、AMPK-WT+COPD組、AMPK-WT+COPD+二甲雙胍組、AMPK-KO組、AMPK-KO+COPD組、AMPK-KO+COPD+二甲雙胍組；下圖同圖2 各組肺組織中p-AMPK、AMPK、NF-κB表達(dá)

2.5各組AMPK通路下游氧化應(yīng)激反應(yīng)比較 與AMPK-WT組比較，AMPK-WT+COPD組肺組織中Nrf2表達(dá)水平及BALF中SOD含量均明顯降低，BALF中MDA含量明顯增加(P<0.05)；與AMPK-WT+COPD組比較，AMPK-WT+COPD+二甲雙胍組肺組織中Nrf2表達(dá)水平及BALF中SOD含量均明顯增加，BALF中MDA含量明顯降低(P<0.05)；與AMPK-WT+COPD+二甲雙胍組比較，AMPK-KO+COPD+二甲雙胍組肺組織中Nrf2表達(dá)水平及BALF中SOD含量均明顯降低，BALF中MDA含量明顯增加(P<0.05)；與AMPK-WT+COPD組比較，AMPK-KO+COPD組肺組織中Nrf2表達(dá)水平及BALF中SOD含量均明顯降低，BALF中MDA含量明顯增加(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 各組肺組織中Nrf2的蛋白條帶

表3 各組肺組織Nrf2、CHOP、Caspase-12表達(dá)和BALF中MDA、SOD含量比較

2.6各組肺組織中AMPK通路下游內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激比較 與AMPK-WT組比較，AMPK-WT+COPD組肺組織中CHOP、Caspase-12表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)；與AMPK-WT+COPD組比較，AMPK-WT+COPD+二甲雙胍組肺組織中CHOP、Caspase-12表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與AMPK-WT+COPD+二甲雙胍組比較，AMPK-KO+COPD+二甲雙胍組肺組織中CHOP、Caspase-12表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)；與AMPK-WT+COPD組比較，AMPK-KO+COPD組肺組織中CHOP、Caspase-12表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)。見表3、圖4。

圖4 各組肺組織中CHOP、Caspase-12表達(dá)

3 討 論

COPD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，氣流受限及氣道重塑不完全可逆，目前臨床治療以對(duì)癥為主，尚缺乏能夠糾正氣流受限及氣道重塑的有效藥物。有臨床研究報(bào)道，二甲雙胍治療糖尿病合并COPD能夠改善預(yù)后、降低急性發(fā)作發(fā)生率并提高遠(yuǎn)期生存率〔7〕。香煙煙霧吸入是目前建立COPD動(dòng)物模型的常用方法，本研究結(jié)果表明二甲雙胍對(duì)COPD具有治療價(jià)值。

二甲雙胍目前主要用于糖尿病治療，能夠激活A(yù)MPK通路并調(diào)節(jié)能量代謝、增加胰島素敏感性〔8,9〕。外界炎癥、氧化應(yīng)激、缺血缺氧等病理因素刺激AMPK發(fā)生磷酸化后能夠發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等作用，是機(jī)體自我保護(hù)的重要代償機(jī)制〔10,11〕。多項(xiàng)COPD的研究證實(shí)，COPD小鼠肺組織中p-AMPK的表達(dá)增多且AMPK激活劑能夠減輕COPD的病理改變〔3,4，12〕，表明AMPK的激活在COPD發(fā)病中起保護(hù)作用。本研究提示二甲雙胍改善COPD病理改變的作用可能與激活A(yù)MPK有關(guān)。

為了驗(yàn)證AMPK在COPD發(fā)病及二甲雙胍治療COPD中的作用，本研究采用LoxP-Cre技術(shù)對(duì)肺AMPK進(jìn)行了特異性敲除，結(jié)果表明AMPK在COPD發(fā)病中起保護(hù)作用，敲除AMPK會(huì)使COPD的病理改變加重。在AMPK敲除小鼠建立COPD的過程中給予二甲雙胍干預(yù)，肺組織的病理改變有所改善，但是這一改善作用與二甲雙胍用于野生型COPD小鼠治療比較明顯減弱，即敲除AMPK削弱了二甲雙胍改善COPD病理改變的作用，表明二甲雙胍改善COPD病理改變的作用與激活A(yù)MPK有關(guān)。

AMPK發(fā)生磷酸化后抗感染作用與抑制NF-κB通路及下游TNF-α、IL-6、IL-8細(xì)胞因子的生成有關(guān)〔13，14〕，抗氧化應(yīng)激作用與增強(qiáng)Nrf2通路、增加抗氧化酶SOD生成有關(guān)〔3，15〕，抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用與抑制CHOP通路及下游Caspase-3表達(dá)有關(guān)〔4，12〕。炎癥、氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在COPD的發(fā)病中起重要作用，既往其他研究〔16～18〕及本研究均表明二甲雙胍在COPD的治療中發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用，與其激活A(yù)MPK的作用吻合。在敲除AMPK后，COPD小鼠肺組織中NF-κB、Nrf2、CHOP通路表達(dá)異常加劇，二甲雙胍抑制COPD小鼠炎癥、氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用發(fā)生逆轉(zhuǎn)。綜上，二甲雙胍治療香煙煙霧吸入誘導(dǎo)COPD小鼠能夠改善肺組織病理改變并抑制肺組織炎癥、氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；AMPK在COPD發(fā)病及二甲雙胍治療COPD中起重要作用，特異性敲除肺AMPK后COPD小鼠肺組織病理改變及炎癥、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激均加重，二甲雙胍治療作用減弱或消失。