楊帥，郭梅*，王文重，魏琪，董學(xué)志，毛彥芝，閔凡祥，王玲

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，黑龍江哈爾濱150086；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所，黑龍江哈爾濱150086）

立枯絲核菌（Rhizoctonia solaniKühn）是一種在全球范圍內(nèi)均有分布的土壤習(xí)居菌，其侵染寄主廣泛、腐生能力強(qiáng)且土壤中存活時(shí)間長(zhǎng)，被認(rèn)為是最具破壞性的土傳病原之一。該病原菌最早由法國(guó)人Kühn于1858年[1]發(fā)現(xiàn)，此后美國(guó)、澳大利亞、南非等國(guó)也分別進(jìn)行了報(bào)道。在中國(guó)最早的報(bào)道是在20世紀(jì)初期，但因當(dāng)時(shí)危害并不嚴(yán)重而未引起人們的關(guān)注[2]。在立枯絲核菌的研究方面，因其種內(nèi)和種間存在著豐富的遺傳多樣性而被認(rèn)定為是一個(gè)遺傳差異較大的復(fù)合種。此后，以Schultz[3]提出的菌絲融合概念和Parmeter等[4]提出的種內(nèi)融合群分類法為基礎(chǔ)，日本學(xué)者生越明[5]建立的融合群分類法成為國(guó)際公認(rèn)的分類標(biāo)準(zhǔn)。隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的深入，目前國(guó)際公認(rèn)的已知融合群類型已有14種，分別被命名為AG-1～AG-13及AG-BI[6,7]。此外，根據(jù)融合群內(nèi)的融合頻率、寄主范圍、培養(yǎng)性狀、致病性及生化和遺傳特性等差異，一些融合群還可以進(jìn)一步被劃分為不同的亞群。如根據(jù)寄主的不同，AG-3融合群還被分為AG-3PT（馬鈴薯型）、AG-3TB（煙草型）和AG-3TM（番茄型）[8]；而根據(jù)致病性，AG-1可以被分為IA、IB和IC三個(gè)亞群。

馬鈴薯是中國(guó)的第四大糧食作物，具有耐旱、耐貧瘠、廣適性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。由立枯絲核菌引起的馬鈴薯潰瘍病和黑痣病是馬鈴薯生產(chǎn)上極具威脅的一種土傳病害[9,10]。該病能在馬鈴薯生育期持續(xù)造成危害，如苗期危害幼芽引起生長(zhǎng)點(diǎn)壞死從而導(dǎo)致氣生塊莖的產(chǎn)生；危害地下莖基部形成褐色梭型條斑導(dǎo)致地上部植株出現(xiàn)萎蔫等癥狀。同時(shí)其菌絲在薯塊表皮還可以形成黑色菌核，造成馬鈴薯塊莖表面出現(xiàn)裂口、粗皮、黑痣等癥狀，嚴(yán)重影響了種薯的品質(zhì)和商品性，進(jìn)而造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[11]。

黑龍江省地處中國(guó)東北部，不僅地理位置優(yōu)越而且兼具得天獨(dú)厚的冷涼氣候，是中國(guó)重要的馬鈴薯種薯及商品薯主產(chǎn)區(qū)之一[12]。然而，近年來(lái)隨著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，由于缺乏輪作、種薯調(diào)運(yùn)不當(dāng)?shù)仍?，造成黑龍江省馬鈴薯黑痣病發(fā)生日趨嚴(yán)重，一般年份可達(dá)10%～30%，重癥地塊發(fā)病率高達(dá)70%～80%，嚴(yán)重影響了馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)[13]。本研究采用分子生物學(xué)方法，系統(tǒng)分析了近十年來(lái)黑龍江省馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)黑痣病菌融合群類型變化情況，以期更好地了解黑龍江省黑痣病菌融合群組成、分布及變化動(dòng)態(tài)，進(jìn)而為制定科學(xué)、精準(zhǔn)的黑痣病防治策略提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試馬鈴薯黑痣病樣品分別于2012～2021年采自黑龍江省10個(gè)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的21個(gè)馬鈴薯種植區(qū)，具體見(jiàn)圖1。田間采集樣品經(jīng)常規(guī)組織分離法[14]分離后，獲得純化立枯絲核菌菌株，經(jīng)PDA平板活化后，移入試管PDA斜面，4℃保存、備用。

圖1 黑龍江省馬鈴薯黑痣病樣品地理分布Figure 1 Geographical distribution of potato black scurf samples in Heilongjiang Province

1.2 菌株基因組DNA的提取

黑痣病菌經(jīng)分離、純化后，采用商業(yè)化基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。提取DNA后利用微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度，取OD260/OD280比值在1.8～2.0的DNA用于后續(xù)PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。

1.3 融合群類型測(cè)定

根據(jù)White等[15]報(bào)道的ITS序列分析法進(jìn)行融合群測(cè)定。采用通用引物（ITS4和ITS5）對(duì)菌株樣品的ITS1-5.8S-ITS2區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)利用特異性引物AG-2-1-F/R和Rs1F2/AG-3PR2對(duì)AG-2-1和AG-3PT進(jìn)行輔助驗(yàn)證[16,17]，引物見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件及體系按照康為世紀(jì)生物科技有限公司的2xEs Taq MasterMix產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳后，利用凝膠成像儀在紫外光下檢測(cè)并拍照。

表1 融合群測(cè)定引物Table 1 Primers for detection of anastomosis group

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯黑痣病菌樣品采集及分離

2012～2021年在黑龍江省哈爾濱、齊齊哈爾、綏化、牡丹江、雙鴨山、佳木斯、伊春、鶴崗、黑河和大興安嶺10個(gè)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)共采集分離了482份馬鈴薯黑痣病菌菌株樣品，具體信息如表2所示。

表2 2012～2021年黑龍江省黑痣病菌樣品采集信息Table 2 Information of potato black scurf isolates collected from 2012 to 2021 in Heilongjiang Province

2.2 黑龍江省馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)致病菌融合群類型鑒定

對(duì)采自黑龍江省10個(gè)主產(chǎn)區(qū)的482份致病立枯絲核菌樣品完成分離純化后，采用商業(yè)化基因組DNA提取試劑盒提取每個(gè)樣品的總DNA，并進(jìn)行純度檢測(cè)。微量分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果表明，所提DNA樣品的OD260/OD280比值均介于1.8～2.0。電泳結(jié)果如圖2所示，均為單一條帶，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 黑龍江省馬鈴薯黑痣病樣品基因組DNA檢測(cè)電泳圖（部分樣品）Figure 2 gDNA extracted from potato black scurf isolates in Heilongjiang Province(partial samples)

利用ITS區(qū)通用引物進(jìn)行融合群鑒定，經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得約700 bp的ITS1-5.8S-ITS2區(qū)域目的片段，部分樣品電泳見(jiàn)圖3。經(jīng)BLAST序列比對(duì)后，482份菌株隸屬5個(gè)融合群，其中，344個(gè)菌株屬于AG-3，出現(xiàn)頻率為71.37%；70個(gè)菌株屬于AG-5，出現(xiàn)頻率為14.52%；32個(gè)菌株屬于AG-2，出現(xiàn)頻率為6.64%；34個(gè)菌株屬于AG-4，出現(xiàn)頻率為7.05%；2個(gè)菌株屬于AG-1，出現(xiàn)頻率為0.42%；無(wú)其他融合群出現(xiàn)（表3）。其中，AG-2融合群中包括AG-2-1、AG-2-2IIIB和AG-2-2IV三個(gè)融合亞群，出現(xiàn)頻率分別為50.00%、6.25%和43.75%；AG-4融合群中只鑒定到AG-4-HGI和AG-4-HGII兩個(gè)融合亞群類型，出現(xiàn)頻率分別為70.59%和29.41%，未有AG-4-HGIII出現(xiàn)（表4）。同時(shí)，AG-2-1和AG-3PT經(jīng)特異性引物AG-2-1-F/R和Rs1F2/AG-3PR2進(jìn)行輔助驗(yàn)證，PCR擴(kuò)增分別可以獲得480和474 bp陽(yáng)性目的片段（圖4）。

表3 黑龍江省馬鈴薯立枯絲核菌融合群類型及分布Table 3 Anastomosis group and distribution of R.solani isolates collected in Heilongjiang Province

表4 馬鈴薯立枯絲核菌AG-2和AG-4融合亞群的鑒定及分布Table 4 Anastomosis subgroup and distribution of R.solani AG-2 and AG-4

圖3 ITS引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖（部分樣品）Figure 3 Agarose gel electrophoresis of PCR products amplified by ITS primers(partial samples)

圖4 AG-2-1和AG-3PT特異性引物檢測(cè)電泳圖Figure 4 Agarose gel electrophoresis of AG-2-1和AG-3PT amplified by specific primers

從黑龍江省馬鈴薯種植區(qū)域分布來(lái)看，在全省10個(gè)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)AG-3融合群均有發(fā)生，且所占比例均很高，因此，AG-3是馬鈴薯致病立枯絲核菌的優(yōu)勢(shì)融合群。從致病融合群的豐富度來(lái)看，哈爾濱、齊齊哈爾、綏化3個(gè)地區(qū)的融合群類型較為豐富，除了AG-3外，還有AG-1、AG-2、AG-4和AG-5多種融合群，說(shuō)明黑龍江省西部地區(qū)的馬鈴薯黑痣病菌群體遺傳多樣性較為復(fù)雜。與之相對(duì)比，黑龍江省東部地區(qū)融合群類型相對(duì)單一，其中牡丹江和黑河地區(qū)均有少量AG-5融合群發(fā)生，佳木斯和鶴崗則偶有AG-2融合群出現(xiàn)，其他地區(qū)僅有AG-3融合群（圖5）。

圖5 黑龍江省馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)黑痣病菌融合群類型組成及分布Figure 5 Type and distribution of anastomosis group of black scurf isolates collected in main potato growing regions of Heilongjiang Province

3 討論

鑒于立枯絲核菌種內(nèi)及種間遺傳多樣性豐富，因此該菌常被界定為一個(gè)遺傳差異較大的復(fù)合種[17]。自1936年Schultz[3]首次提出立枯絲核菌菌絲融合群的概念后，由日本學(xué)者生越明[5]建立了得到國(guó)際公認(rèn)的融合群鑒定方法。傳統(tǒng)的菌絲融合群是將2個(gè)待測(cè)菌株進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)后，利用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲的生長(zhǎng)和交疊現(xiàn)象。由于菌絲融合法只能劃分不同融合群，但不能很好的反映其種內(nèi)及種間的變異關(guān)系，因此隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，能夠在分子水平上反映遺傳變化的rDNA-ITS序列分析法，成為研究立枯絲核菌遺傳多樣性的重要手段。

馬鈴薯黑痣病是馬鈴薯生產(chǎn)上最具威脅的土傳病害之一。國(guó)內(nèi)外研究均表明AG-3融合群是引起馬鈴薯黑痣病的優(yōu)勢(shì)融合群類型[18]。黑龍江省作為中國(guó)東北部主要的種薯和商品薯生產(chǎn)基地，近年來(lái)馬鈴薯黑痣病的發(fā)生呈逐年增加且日趨嚴(yán)重的趨勢(shì)，田間發(fā)病率在大發(fā)生年份可達(dá)70%以上。關(guān)于黑龍江省馬鈴薯黑痣病融合群的相關(guān)研究起步較晚，其中田曉燕等[19]、李曉妮等[20]雖然均有關(guān)于黑龍江省黑痣病菌融合群類型的報(bào)道，但由于樣品數(shù)量和采集地點(diǎn)相對(duì)較少，因此并不能很好的反映出黑龍江省的病原特點(diǎn)。本研究系統(tǒng)梳理了10年來(lái)黑龍江省馬鈴薯黑痣病菌的融合群類型組成及分布情況，綜合樣品數(shù)量、出現(xiàn)頻率以及地域分布情況，不僅充分說(shuō)明了AG-3依然是黑龍江省馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)優(yōu)勢(shì)致病融合群類型，也清晰的反映出AG-5融合群已經(jīng)和AG-4融合群一樣成為了危害黑龍江省馬鈴薯的次優(yōu)勢(shì)菌群。同時(shí)，本次調(diào)查還發(fā)現(xiàn)了AG-1-IB、AG-2-2IIIB、AG-2-2IV三個(gè)融合亞群，這也是分別在黑龍江省的首次發(fā)現(xiàn)。此外，在AG-4融合群中僅鑒定出AG-4-HGI和AG-4-HGII兩個(gè)融合亞群，未獲得AG-4-HGIII，這一結(jié)果與李曉妮等[20]的研究結(jié)果相一致，但Yang等[21]在黑龍江省39份樣品中分離出AG-4-HGIII，說(shuō)明黑龍江省馬鈴薯黑痣病菌融合群類型較為復(fù)雜，融合群的豐富度與樣品的來(lái)源密切相關(guān)。牟明等[22]對(duì)黑龍江省馬鈴薯黑痣病融合群的鑒定中，發(fā)現(xiàn)了AG-1-IA、AG-1-IC、AG-6、AG-8四個(gè)融合群類型，也再次證明對(duì)不同區(qū)域馬鈴薯黑痣病菌融合群類型的監(jiān)測(cè)十分必要。