李穎，謝瑩瑩，鄭金鳳，張悅，趙勇，劉楊，蔣赟（1.湖南省藥品檢驗檢測研究院，長沙 410001；2.湖南省藥品審查核驗中心，長沙 410001；3.國家藥品監(jiān)督管理局藥用輔料工程技術(shù)研究重點實驗室，長沙 410001）

尿素又稱碳酰胺、脲，為藥輔同源類，是臨床上應(yīng)用較早的強效利尿脫水藥。本品具有抗菌，使蛋白質(zhì)溶解、變性，增加蛋白質(zhì)水合、皮膚通透性等作用，可用作透皮促進劑和助溶劑[1-2]。尿素對熱不穩(wěn)定，加熱至150～160℃將脫氨成縮二脲，若迅速加熱將脫氨而三聚成六元環(huán)化合物三聚氰酸。尿素在《中國藥典》（ChP2020）、歐洲藥典（EP10.0）、美國藥典（USP2021）及日本藥典（JP17）中均有收載[3-7]，其中USP2021對縮二脲雜質(zhì)、其他單個雜質(zhì)及總雜量進行了控制，EP10.0采用與標(biāo)準(zhǔn)縮二脲溶液制成的對照液進行顏色比對對縮二脲雜質(zhì)進行了控制，而目前ChP2020并未對其有關(guān)物質(zhì)進行控制。本研究通過高效液相色譜建立有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，為藥輔同源尿素的質(zhì)量研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀（島津公司）；e2695高效液相色譜儀（Waters公司）；MS105DU 電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 試藥

尿素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100288-201903，純度：99.8%）；縮二脲（麥克林，批號：C10871148，純度：98%）；三聚氰酸（麥克林，批號：C10691090，純度：98%）；縮三脲（上海旭東海普南通藥業(yè)有限公司，批號：190601，純度：99.0%）；乙腈（Merck公司，批號：JA079030，色譜級）；尿素樣品信息見表1；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge Amide（4.6 mm×250 mm，3.5 μm）；流動相：乙腈-水（94∶6）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：195 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 系統(tǒng)適用性溶液 精密稱取縮二脲、縮三脲、三聚氰酸和尿素對照品適量，用75%乙腈溶解并稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.005、0.005、0.005（約相當(dāng)于0.1%的濃度）和5.0 mg·mL－1的混合對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取供試品適量，加75%乙腈溶解并稀釋制成每1 mL中含5 mg的溶液，即得。

2.2.3 對照溶液 取“2.2.2”項下供試品溶液，加75%乙腈溶解并稀釋制成每1 mL中含50 μg的溶液，即得。

2.2.4 雜質(zhì)混合對照品溶液 精密稱取縮二脲對照品約50 mg，置100 mL量瓶中，加75%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液（1）；精密稱取三聚氰酸對照品約50 mg，置100 mL量瓶中，加75%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液（2）；精密稱取縮三脲對照品約10 mg，置50 mL量瓶中，加75%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液（3）。精密量取上述對照品儲備液（1）～（3）適量，用75%乙腈稀釋制成含縮二脲、縮三脲及三聚氰酸為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg·mL－1的系列溶液①～⑥，待用。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗 取“2.2”項下系統(tǒng)適用性溶液、供試品溶液、對照溶液、雜質(zhì)混合對照品溶液及空白溶液分別進樣，典型色譜圖見圖1。

圖1 HPLC典型色譜圖Fig 1 Typical chromatogram of HPLC

2.3.2 專屬性試驗 精密稱取本品（N1）0.25 g 6份，置50 mL量瓶中，分別進行以下處理：

① 未破壞：按“2.2.2”項下方法處理；② 酸破壞：加1 mol·L－1鹽酸溶液2 mL，搖勻，室溫放置24 h，用1 mol·L－1氫氧化鈉溶液中和，加75%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得；③堿破壞：加1 mol·L－1氫氧化鈉溶液2 mL，搖勻，室溫放置24 h，用1 mol·L－1鹽酸溶液中和，加75%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得；④氧化破壞：加30%雙氧水2 mL，室溫放置20 h，加75%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得；⑤高溫破壞：加75%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，放于120℃的烤箱中，加熱8 h，即得；⑥加75%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，放于（4500±500）lx光照強度下48 h （光照破壞），即得。以上樣品按“2.1”項下色譜條件測定。結(jié)果表明，經(jīng)酸、堿、氧化、高溫、光照破壞條件破壞后，氧化破壞試驗中新增1個雜質(zhì)峰，按面積歸一化法計算，總雜質(zhì)增加6.7%；高溫破壞試驗中縮二脲顯著增加，按面積歸一化法計算，總雜質(zhì)增加2.75%，且各降解產(chǎn)物均能與主峰完全分離，均符合要求，見圖2。

圖2 專屬性試驗HPLC圖譜Fig 2 HPLC chromatogram of specificity test

2.3.3 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2.4”項下的系列溶液①～⑥各10 μL注入液相色譜儀，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg·mL－1），以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，結(jié)果各組分的回歸方程分別為：y縮二脲＝2.365×105x－66.91，r2＝1.000；y縮三脲＝3.165×105x－484.6，r2＝1.000；y三聚氰酸＝1.393×105x＋307.6，r2＝0.9995?？s二 脲 在0.4966～19.8665 μg·mL－1，縮 三 脲在0.5375～21.5028 μg·mL－1，三聚氰酸在0.5842～23.3710 μg·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.4 檢出限和定量限 精密量取“2.2.4”項下各對照品儲備液適量，分別逐級稀釋，精密量取10 μL，進樣測定。設(shè)定量限S/N＝10，檢出限S/N＝3，結(jié)果縮二脲、縮三脲、三聚氰酸的定量限分別為0.020、0.0036、0.032 μg·mL－1；檢出限分別為0.0061、0.0011、0.0098 μg·mL－1。

2.3.5 精密度試驗 取“2.2.4”項下溶液①，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，結(jié)果縮二脲、縮三脲、三聚氰酸的峰面積RSD分別為0.24%、0.11%、0.58%（n＝6），說明本儀器的進樣精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗 取樣品N1 1.0 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.3”項下方法制備6份對照溶液，另取“2.2.4”項下溶液④，作為對照品溶液。取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，縮二脲、縮三脲和三聚氰酸按外標(biāo)法以峰面積計算，其他雜質(zhì)按自身對照法計算，結(jié)果縮二脲、縮三脲含量的RSD分別為1.5%、1.2%，未檢出三聚氰酸和其他單個雜質(zhì)，說明本方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取同一加樣回收試驗的溶液，分別在0、2、4、8、12 h進樣測定，記錄各共有色譜峰峰面積，結(jié)果縮二脲、縮三脲、三聚氰酸峰面積RSD分別為0.18%、0.23%、3.2%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.8 回收試驗 取樣品（N1，縮二脲含量為0.0305%，縮三脲含量為0.0055%，三聚氰酸未檢出），分別精密加入“2.2.4”項下對照品儲備液①0.5 mL、對照品儲備液②0.5 mL、對照品儲備液③1.25 mL，按“2.2.2”項下方法平行制備6份溶液。另取溶液④作為對照品溶液。取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算回收率。結(jié)果縮二脲的回收率為100.1%（RSD＝1.4%）；縮三脲的回收率為100.3%（RSD＝0.44%）；三聚氰酸的回收率為86.59%（RSD＝3.3%）（n＝6）。

2.3.9 耐用性試驗 取“2.2.1”項下系統(tǒng)適用性試驗溶液及“2.3.6”項下重復(fù)性試驗溶液，在“2.1”項色譜條件下，通過改變有機相的初始比 例（±30%）、柱 溫（±5℃）、流 速（±0.2 mL·min－1）以及更換不同品牌的液相色譜儀（島津LC-20A和Waterse2695）來考察耐用性，觀察各組分之間的分離情況以及有關(guān)物質(zhì)含量的變化。結(jié)果系統(tǒng)適用性試驗溶液在各個條件下各組分之間均能達到基線分離，重復(fù)性試驗溶液中的有關(guān)物質(zhì)含量無明顯變化，表明方法的耐用性良好。

2.4 樣品含量測定

取20批尿素樣品，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液、對照溶液和對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算雜質(zhì)含量，結(jié)果見表1。

表1 樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果(%)Tab 1 Related substances of samples (%)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

尿素合成過程中易發(fā)生脫氨縮合或聚合反應(yīng)生成縮二脲、縮三脲和三聚氰酸等副產(chǎn)物[8-9]，在國內(nèi)外藥典中，僅USP2021收載了有關(guān)物質(zhì)項，且單獨控制了縮二脲單雜；EP10.0僅對“縮二脲”進行了控制。用二極管陣列檢測器（PDA）進行全波長掃描分析，縮二脲、縮三脲、三聚氰酸、尿素及破壞后形成新雜質(zhì)的最大吸收波長都在195 nm附近，綜合考慮，選用195 nm作為尿素有關(guān)物質(zhì)的檢測波長。

3.2 流動相的選擇

USP2021中采用甲酸溶液（1 mL甲酸→1000 mL水）-乙腈梯度洗脫流動相體系，使用該體系進行操作時，因均在梯度上出峰，重現(xiàn)性不佳；另有文獻報道采用乙腈-水（88∶12）作為流動相[10-13]體系，經(jīng)預(yù)試驗，各色譜峰分離效果不佳。課題組研究發(fā)現(xiàn)，采用乙腈-水（94∶6）作為流動相體系時，尿素及其特定雜質(zhì)色譜峰峰形較好，且各組分間分離效果最佳，故最終選用乙腈-水（94∶6）體系。

3.3 計算方法考察

USP2021中對縮二脲采用特定雜質(zhì)對照品按外標(biāo)法計算，其他單個雜質(zhì)采用尿素對照品按外標(biāo)法計算。本研究對收集到的20批樣品，以縮二脲、縮三脲、三聚氰酸為特定雜質(zhì)，分別采用外標(biāo)法和自身對照法（按校正因子計算）計算，結(jié)果顯示外標(biāo)法計算縮二脲結(jié)果高于自身對照法，縮三脲低于自身對照法，三聚氰酸高于自身對照法。在相同色譜條件下，尿素、縮二脲、縮三脲、三聚氰酸的響應(yīng)相差較大（尿素/縮二脲＝0.144；尿素/縮三脲＝0.108；尿素/三聚氰酸＝0.246），用自身對照法計算結(jié)果偏差較大，結(jié)果不準(zhǔn)確。為更好地控制本品的質(zhì)量，建議縮二脲、縮三脲、三聚氰酸采用外標(biāo)法進行定量，其他未知雜質(zhì)采用自身對照法進行計算。

4 小結(jié)

本研究建立了高效液相色譜測定尿素的有關(guān)物質(zhì)方法，方法學(xué)考察表明該方法結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，主成分與各個雜質(zhì)分離度較好，能準(zhǔn)確測定特定雜質(zhì)縮二脲、縮三脲、三聚氰酸的含量，為藥用輔料尿素質(zhì)量控制提供依據(jù)。樣品測定結(jié)果顯示，20批樣品均檢出縮二脲和縮三脲，5批樣品檢出三聚氰酸。其中縮二脲含量相對較高，有4批樣品中縮二脲的含量均已超出了USP2021中對縮二脲的控制限度（不得過0.1%），應(yīng)加強質(zhì)量控制。