謝舟穎，袁一超，熊友香，孫巧儀，朱新悅，張紀平，朱志紅（浙江中醫(yī)藥大學，杭州 311402）

微囊泡是一種膜性胞外細胞器，是由被激活細胞的細胞膜產生的異質囊泡，其直徑通常在100～1000 nm[1-3]。微囊泡在人體內分布較廣泛，多種細胞都具有分泌微囊泡的生理功能，且在出血、炎癥刺激等特定情況下也會形成微囊泡[4]。釋放到循環(huán)系統(tǒng)中的微囊泡具有調節(jié)凝血和血管功能的作用，可以影響細胞凋亡和分化、刺激炎癥因子釋放[5]。此外，微囊泡可以充當細胞間信使，將不同物質從親本細胞轉移到靶細胞。因此，微囊泡逐漸成為實現(xiàn)體內藥物靶向轉運的載體。本文通過查閱近年來國內外相關文獻，歸納微囊泡分離及純化的方式和在疾病進程中的階段性作用，以期為微囊泡的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 資料來源

1.1 檢索方法

檢索PubMed、中國期刊全文數(shù)據庫（CNKI）2006年至2022年3月的相關文獻。在PubMed數(shù)據庫檢索中輸入“Microvesicle，Cancer，Isolation and Identification”，單詞之間以“AND”形式檢索，在中文期刊全文數(shù)據庫中輸入主題詞“微囊泡、癌癥、分離與純化”以“并且”形式關聯(lián)選擇模糊查詢進行檢索。主要選擇內容與微囊泡治療癌癥有關的文章，同一領域文獻則選擇近期發(fā)表在權威雜志的文章。

1.2 資料篩選

納入標準：文獻所述內容與分離提取微囊泡及微囊泡在癌癥等疾病中的應用密切相關。

排除標準：內容較舊或者重復的文獻。

1.3 資料的提取與文獻質量評價

通過計算機檢索，初檢得到文獻128篇，其中英文104篇，中文24篇。通過閱讀摘要進行初篩，共保留68篇文獻進一步分析。

2 微囊泡的特點

微囊泡是由兩親性分子形成的多腔室雙分子層球形結構[6]，內含蛋白質、脂質、核酸等生物活性物質，其表面含有的特殊蛋白質標志物是其鑒定分離的基礎[7]。其次，微囊泡的來源眾多，不同來源的微囊泡在不同疾病中發(fā)揮的作用亦不同[4]。Diamant等[8]研究表明外周動脈疾病患者體內大量存在的血小板源性的微囊泡能加快疾病進程，因而病理性微囊泡成為動脈血管疾病治療的新突破口；張戎等[9]發(fā)現(xiàn)骨髓間充質干細胞來源的微囊泡可促使干細胞重新恢復成骨分化能力和免疫調節(jié)能力，可用于治療骨質疏松；尚政軍[10]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞來源的微囊泡能加快口腔鱗狀細胞癌的病情發(fā)展，為此類疾病的治療提供了新的思路。

微囊泡較好的生物相容性與細胞間信使作用，為藥物體內的有效運輸提供了新的可能性[3]。此外，微囊泡的成分會在機體發(fā)生疾病時產生相應變化，有助于時刻監(jiān)測疾病進程，實現(xiàn)診療一體化[2]。余自力[11]以人體液來源的微囊泡為載體，將具有抗腫瘤作用的siRNA載入其中得到了較好的腫瘤靶向治療效果。

3 微囊泡的形成和分泌

微囊泡由細胞表面起泡向外出芽和分裂釋放而得，質膜的脂質和蛋白質組成以及Ca2＋水平方面的分子重排、核內體分選復合體機制均是參與微囊泡釋放過程的重要因素[12]。如細胞內Ca2＋增加引起質膜不對稱磷脂分布改變，導致肌動蛋白細胞骨架維持解聚促進微囊泡脫落[13]；小GTPaseADP-核糖基化因子6（ARF6）能通過酶機制引起放線肌球蛋白收縮以釋放微囊泡[14]。多數(shù)真核細胞在生理和病理狀態(tài)下都會釋放微囊泡，腫瘤細胞的致癌信號和獨特的腫瘤微環(huán)境（缺氧、酸度）均為微囊泡分泌提供了良好的條件[15]。

4 微囊泡的獲取、分離與純化

4.1 微囊泡的獲取

正常情況下，機體細胞單位時間內產生微囊泡較少，當研究需要大量微囊泡時需對細胞進行特殊處理，現(xiàn)階段的主要處理方式有細胞饑餓法、紫外線照射法或放射法[3]。

4.1.1 細胞饑餓法 細胞饑餓法即在培養(yǎng)細胞時，選用無血清或低血清培養(yǎng)基減少細胞可獲取的營養(yǎng)物質迫使細胞處于饑餓狀態(tài)，從而短時間內分泌大量微囊泡。細胞饑餓法簡單易操作，適用于初級實驗或者預實驗，但因每種細胞對饑餓的耐受力不同，需進行預實驗以準確掌握饑餓時間，保證細胞存活的同時獲得最多數(shù)量的微囊泡。姚嘉等[16]運用細胞饑餓法獲得了人臍帶間充質干細胞分泌的微囊泡。

4.1.2 紫外線照射法 紫外線照射法是通過適量紫外照射對細胞進行預處理，使其產生大量微囊泡。該法操作簡單，紫外線照射劑量是關鍵，紫外線照射劑量過低則產生微囊泡數(shù)量不夠，過高則易導致細胞死亡。該法適用于初級實驗和需求量、準確度都較高的實驗。劉娟等[17]用中長波紫外線輻射誘導皮膚成纖維細胞產生微囊泡，結果表明紫外線輻射后生成的微囊泡可導致人皮膚成纖維細胞形態(tài)發(fā)生改變，倒置顯微鏡下出現(xiàn)較多的細胞碎片，細胞體積變大，過度伸展，并使細胞增殖率降低。

4.1.3 放射法 放射法是用射線照射細胞使其大量分泌微囊泡。射線殺傷力較強，極易使細胞死亡，導致實驗失敗，故多數(shù)情況下并不采用放射法。

4.2 微囊泡的分離與純化

微囊泡大量產生之后，需對其進行分離與純化。目前可用差速離心法、免疫親和捕獲技術、微流體技術等對微囊泡進行分離[18]。

4.2.1 差速離心法 差速離心法利用離心力將不同直徑的微囊泡分開，是最常用的分離提取微囊泡的方法。其優(yōu)勢在于操作簡單、成本低廉；缺點在于純度不夠高。Chen等[19]在提取人神經干細胞來源微囊泡時，采用超速離心法多次離心提純微囊泡，結果表明超速離心法可獲得粒徑為20～200 nm的微囊泡，且獲得的人神經干細胞來源微囊泡可以促進神經細胞的修復和再生。

4.2.2 免疫親和捕獲技術 免疫親和捕獲技術是使用和微囊泡表面特異性標志物相對應抗體的磁珠與微囊泡共同培養(yǎng)，使抗原與抗體結合形成沉淀，從而將微囊泡吸附出來。該法一般應用于復雜生物流體或者小體積液體微囊泡。Zhang等[20]利用此技術成功純化得到可作為藥物載體且被葉酸修飾的微囊泡。

4.2.3 微流體技術 微流體技術是知曉目標粒子直徑后，利用儀器控制流體速度、障礙顆粒物尺寸及對流控制粒子，分流出接近、小于或大于閾值直徑的三種粒子，使得到的微囊泡純度更高。Santana等[21]基于微流體技術，利用三種直徑不同的微球成功分離出微囊泡。Santana等[21]首先通過細胞饑餓法誘導產生微囊泡，隨后將離心分離的微囊泡上清液通過0.22 μm Steriflip過濾器過濾，利用過濾器中熒光聚戊二烯微球的三種直徑（51 nm、190 nm和2.01 μm）來分離出不同大小的微囊泡。

截至目前，由于微囊泡體積小、密度低造成其分離難度大，想要得到純凈的微囊泡則必須將其與其余膜結構區(qū)分開來，難度更高，為得到較為純凈的微囊泡，一些新技術，例如利用折射不同波長的納米探針實現(xiàn)對囊泡的特異性生物檢測與分離、利用軟光刻方法制備微流控芯片并用恒壓注射泵制備大小均勻的微囊泡等技術應運而生[22]。

4.3 微囊泡的表征

4.3.1 電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡是用于微囊泡表征和可視化的常規(guī)方法之一，運用電子束穿過微囊泡可得到直觀的圖像，但一般測量前需對微囊泡進行固定、脫水等處理，這會對微囊泡造成損害，且電鏡僅可用于微囊泡形態(tài)、直徑的測定，不可測定其濃度。冷凍電鏡（cryo-EM）能區(qū)分微囊泡和非泡狀顆粒，獲得更詳細的微囊結構信息，如Garaeva等[23]運用cryo-EM對天然葡萄柚來源的微囊泡進行表征，獲得了粒徑、脂質雙分子層厚度及形態(tài)等信息。并且cryo-EM能減少預處理從而有效避免微囊泡形態(tài)變化及損傷。低溫電子斷層掃描可進一步建立微囊泡三維圖像，驗證其球形形態(tài)[24]。

4.3.2 納米粒子跟蹤分析（NTA）和電阻脈沖傳感（RSP） NTA可通過追蹤懸浮粒子的布朗運動估計粒子的平均尺寸與濃度，操作簡單迅速，檢測過程幾乎對微囊泡無影響，也可通過熒光檢測微囊泡上的抗原組成。Dlugolecka等[25]運用熒光NTA檢測非小細胞肺癌患者支氣管肺灌洗液來源的微囊泡相關蛋白獲得了其濃度、大小、分布及表面表型，但對于如血漿等復雜生物流體，此法檢測靈敏度降低。大囊泡可能掩蓋小囊泡，熒光強度不夠則無法被檢測，這些都會降低檢測結果的準確性。

RSP是一種基于Coulter原理測定懸浮液中微囊泡大小與濃度的方法，測量前須除去大顆粒和蛋白質防止其堵塞裝置孔道，運用廣泛，但其檢測重現(xiàn)性有待提高。Cimorelli等[26]已證實微流控RSP對65～75 nm生物流體中微囊泡有較好的測量重現(xiàn)性，并以此建立了一個準確且可重復的操作程序以檢測微囊泡濃度和粒徑分布。

NTA和RSP是最常用于估計粒子大小和濃度的兩種方法，但無法區(qū)分微囊泡和非微囊泡顆粒。

4.3.3 流式細胞術（FC） FC可用于確定單個微囊泡的細胞來源，對其進行高分辨率和定性分析，提供濃度、表型等相關信息，但微囊泡光散射信號微弱，小微囊泡攜抗原少，免疫熒光測量存在一定誤差且重現(xiàn)性差，大多傳統(tǒng)流式細胞儀對直徑＜500 nm的微囊泡靈敏度不夠[27]。Pospichalova等[28]研究表明，通過蛋白質和脂質特異性染料或第一抗體標記微囊泡能提高FC檢測靈敏度，實現(xiàn)對微囊泡進行常規(guī)定量分析和表征。成像流式細胞術（IFC）結合了傳統(tǒng)流式細胞儀和顯微鏡的優(yōu)點，能獲取高質量的多光譜圖像，對單個微囊泡的檢測準確度更高，Ofir-Birin等[29]通過對瘧原蟲來源微囊泡內蛋白質、RNA和脂質進行熒光標記，加以IFC實時追蹤，能直觀地監(jiān)測瘧疾患者免疫細胞對微囊泡的攝取及攝取后微囊泡運載物質的分布，為探究微囊泡內化過程提供了又一強有力的方法。

4.3.4 抗體特異性酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）和蛋白免疫印記分析 納米到微米級微囊泡表達特異性抗體，ELISA通過與抗體相連的酶產生的檢測信號，檢測和定量測定特定細胞來源的微囊泡，但微囊的異質性和亞型限制了此法對微囊泡總濃度的測定[30]。Ma等[31]建立高親和力磷脂酰絲氨酸結合劑TIM4-ELISA系統(tǒng)，運用多種抗體提高檢測微囊泡的靈敏度成功鑒定出一種微囊泡分泌抑制劑和三種微囊泡分泌激活劑。

蛋白免疫印記分析用于確認微囊泡主要標記物（Alix或CD63）和微囊泡的蛋白質的存在。Sung等[32]運用蛋白質印跡法對脊柱硬膜外脂肪間充質干細胞細胞外囊泡進行表征，以外體融合蛋白flotillin 2、CD81等微囊泡標志物作為分析指標。

Dong等[33]利用尺寸排阻分離和光子晶體納米結構結合CD63配體研制了一種集成芯片，可靈敏定量測定微囊泡。

4.3.5 其他 其他方法還有動態(tài)光散射、原子力顯微鏡、熒光激活細胞分選等，以上方法各有利弊，故微囊泡的表征常采用多種方法，從而實現(xiàn)對微囊泡進行精確全面的分析識別、對微囊泡亞群進行分類以及對具有功能效應的特征進行深入研究。

5 微囊泡在腫瘤疾病中的作用

微囊泡具有較好的生物相容性且表面易修飾，可將靶向基團通過 “自然嵌合”等方式與之結合，使其具有靶向性[34-35]。此外，微囊泡可通過調節(jié)分子和信號通路，參與腫瘤發(fā)展，可用于各類癌癥早期的診斷、監(jiān)測及預后[36]。微囊泡作為細胞間信號傳導的通路，其數(shù)量的變化與疾病的產生密切相關[37-38]。

5.1 肝癌

肝癌細胞通常表現(xiàn)為耐藥性強、易復發(fā)，且多數(shù)患者確診即為晚期，因此確定一個合適的肝癌早期診斷指標顯得尤為重要。考慮到無論是正常細胞還是病變細胞，都通過釋放微囊泡與其他細胞產生聯(lián)系。Hsu等[39]對肝癌細胞分泌的微囊泡中的M2型丙酮酸激酶（PKM2）進行檢測，發(fā)現(xiàn)肝癌患者血漿微囊泡中PKM2明顯升高，可作為肝癌早期診斷標志。而吳丁[40]提出的石墨烯場效應晶體管生物傳感器大幅提高了微囊泡的檢測靈敏度，提高了其在臨床應用的可能性。

肝癌的轉移擴散是導致患者病情惡化的重要原因，肝癌分泌的微囊泡與其癌癥的發(fā)展密切相關，可將其作為潛在的治療靶點。He等[41]研究表明上皮細胞來源的微囊泡作為CRISPR/Cas9的載體可治療肝癌，且進一步研究表明肝癌細胞來源的微囊泡可以介導肝癌細胞對索拉非尼的耐藥[42]，提示這類微囊泡可能不能作為肝癌治療中抗腫瘤藥物傳遞的載體。Kogure等[43]提出肝癌細胞來源的微囊泡與肝癌細胞增殖有所關聯(lián)，肝癌細胞分泌的微囊泡通過介導 miRNA 的轉移來激活相關信號通路并調節(jié)TAK1 的表達，從而增強肝癌細胞增殖能力。Fang等[44]發(fā)現(xiàn)肝癌細胞分泌的微囊泡含有miR-103可在破壞內皮細胞的同時加劇肝癌細胞擴散，因此，若能抑制肝癌細胞分泌微囊泡可對肝癌病情產生極大緩解。

5.2 肺癌

肺癌是全球病死率最高的癌癥，肺癌死亡的人數(shù)占所有癌癥死亡人數(shù)的18.4%[45]。Kanazawa等[46]經研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者中血小板微囊泡及單核細胞微囊泡數(shù)量高于健康人，故認為血小板微囊泡濃度可作為非小細胞肺癌的進展指標。Tseng等[47]發(fā)現(xiàn)貧血小板血漿中的組織因子陽性微囊泡可預示肺癌向遠處轉移，可作為檢測肺癌擴散的指標。

肺癌患者血小板來源的微囊泡在促進A549細胞增殖的同時可加強促血管生成基因的表達，加快肺癌的發(fā)展。Janowska-Wieczorek等[48]給小鼠靜脈注射其血小板來源的微囊泡后發(fā)現(xiàn)人肺癌細胞系A549遷移性明顯增強，進一步證明微囊泡在腫瘤遷移和血管生成中發(fā)揮重要作用。在肺癌預后研究中，通過測定107例非小細胞肺癌患者血小板微囊泡和內皮細胞微囊泡的數(shù)量及循環(huán)總微囊泡數(shù)量，表明微囊泡基線水平與肺癌預后息息相關，基線水平高則表示預后良好[49-50]。

5.3 卵巢癌

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，是婦科惡性腫瘤病死率最高的疾病[51]。研究表明在卵巢癌患者血液中微囊泡數(shù)量明顯上升，可成為臨床“體液檢查”的理想選擇[52]。Cicek等[53]發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者血清中分離出來的微囊泡包含特定的miRNA，可以用于惡性腫瘤的早期檢測的標志。Barnabas等[54]在Q-Exactive質譜儀上對微囊泡樣品進行數(shù)據分析，并成功構建一個9個蛋白質的分類器，經驗證能正確識別所有卵巢癌患者Ⅰ期病變，其實驗結果為微囊泡能成為早期癌癥診斷依據提供有力證據。

Mancilla等[55]通過研究漿液性卵巢癌小鼠模型，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可影響腫瘤細胞釋放微囊泡數(shù)量及微囊泡的組成，導致微囊泡誘導的腫瘤細胞侵襲和遷移明顯減少，有望成為新的治療卵巢癌的途徑。在治療過程中耐藥性是卵巢癌治療失敗的主要原因之一。多個實驗結果表明，腫瘤細胞能釋放大量含各種蛋白酶、mRNA和信號分子的微囊泡，在腫瘤發(fā)展過程中起到重大作用，最終可導致細胞耐藥[56-57]。同時Jorfi等[58]研究表明，腫瘤細胞利用微囊泡排出抗腫瘤藥物，產生耐藥性。

5.4 乳腺癌

乳腺癌在全球女性癌癥中的發(fā)病率為24.2%，位居女性癌癥的首位，其中52.9%患者來自發(fā)展中國家。秉持著早發(fā)現(xiàn)早治療的原則，Kosaka等[59]通過研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清中微囊泡數(shù)量明顯高于常人，有望作為臨床診斷的標志。

在治療過程中，朱鏈[34]利用葉酸與生物素雙修飾的微囊泡，負載紫杉醇和Bcl-2siRNA，實驗結果表明對乳腺癌細胞有較強殺傷效果。Risha等[60]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞分泌微囊泡中的癌癥治療靶點活性高于非癌性細胞微囊泡。Chulpanova等[61]從IL2過表達間充質干細胞中分離的微囊泡可激活Cd8T用于殺死三陰性乳腺癌細胞。在化療過程中，汪林軍等[62]研究發(fā)現(xiàn)血漿微泡中的mRNA可能是預測乳腺癌患者化療療效的潛在標志物，有望通過檢測血漿微泡中的mRNA及時調整化療方案。Park等[63]發(fā)現(xiàn)載有CXCL12 特異性 miRNA的微囊泡，可減少乳腺癌細胞增殖，抑制乳腺癌的進一步發(fā)展。Menck等[57]通過研究表明乳腺癌細胞分泌的微囊泡含有大量細胞外基質金屬蛋白酶誘導劑，可加劇腫瘤細胞發(fā)展。Menck等[14]在隨后研究中發(fā)現(xiàn)在轉移性乳腺癌患者血液中的微囊泡也存在類似現(xiàn)象，這說明乳腺癌細胞能通過分泌微囊泡擴散，為臨床抑制乳腺癌提供了潛在途徑。

6 其他

6.1 微囊泡在肺部疾病中的運用

通過檢測不同來源微囊泡的數(shù)量及其攜帶的標志物可診斷肺纖維化的發(fā)生及判斷肺栓塞的程度[64-65]。研究發(fā)現(xiàn)，微囊泡對哮喘、肺動脈高壓、肺癌等疾病也起到一定的治療作用[66-68]。肺部疾病的預后檢查中常以不同來源微囊泡及其攜帶的生物標志物變化情況為依據判斷慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸窘迫綜合征康復患者的康復情況[69]。

6.2 微囊泡在心血管疾病中的運用

微囊泡隨著血液循環(huán)與眾多細胞接觸且影響受體細胞的表型，所以細胞源性微囊泡在心血管疾病的預測、發(fā)生和進展中是一個重要標志物[70]。微循環(huán)系統(tǒng)內的微囊泡與內皮細胞的比值可作為心血管功能障礙的生物標志物和動脈粥樣硬化的提示，并且利用微囊泡特異性可區(qū)分不同階段和不同發(fā)展程度的心血管疾病[71]。在治療中，微囊泡可改善血脂異常、高血壓，抑制心肌細胞的凋亡[72]。與此同時微囊泡可作為高膽固醇血癥患者動脈粥樣硬化加速和預后檢測的標準[73]。

6.3 微囊泡在組織修復及再生中的運用

不同類型細胞分泌的微囊泡，通過介導不同因子在組織修復中發(fā)揮不同作用。

由滑膜或脂肪來源的間充質干細胞分泌的微囊泡，通過介導不同因子實現(xiàn)患骨關節(jié)炎后軟骨的再生，有望改善類風濕關節(jié)炎等[74-75]。自然殺傷細胞、血小板分泌的微囊泡則會抑制內皮細胞的生長及遷移，成為組織修復類疾病康復的阻礙[76-77]。T細胞來源微囊泡，可改變血管內皮功能和屏障通透性，加劇組織炎癥，同時也為治療提供了新的思路[78]。通過檢測已完成異基因造血細胞患者循環(huán)微囊泡的數(shù)量，及時發(fā)現(xiàn)患者是否存在明顯血管損傷或凝血現(xiàn)象，以便及早治療[79]。

6.4 神經細胞及神經系統(tǒng)

神經細胞分泌的微囊泡在神經系統(tǒng)疾病的修復與治療中發(fā)揮重要作用。研究表明胚胎干細胞衍生的神經干細胞分泌的微囊泡，可使受損坐骨神經再生[19]。實驗證明，人神經干細胞分泌的微囊泡對經谷氨酸誘導受損的大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤PC12細胞有修復作用[80]。臨床上成人神經系統(tǒng)難以再生，但有實驗表明人神經干細胞可促進大鼠神經元軸突的增長，進一步研究可以分析神經干細胞分泌的微囊泡能否促進神經元軸突的增長，可為微囊泡臨床應用打下了基礎[81]。

7 總結與展望

微囊泡作為新型天然藥物傳遞載體，具有較高的生物相容性、較強的穩(wěn)定性和有限的免疫原性[82]及細胞毒性，與傳統(tǒng)的合成給藥載體相比能更安全有效地應用在臨床。微囊泡滲透到組織中時，可提高藥物的靶向性；作為生物標志物，通過檢測血液中不同來源的微囊泡能對癌癥等疾病的診斷、治療以及疾病進程的判斷起到良好的輔助作用[83-84]。目前將微囊泡廣泛運用在臨床上的限制在于難以實現(xiàn)大規(guī)模生產和標準化鑒定、表征和定量，效能低而成本高[85-86]；無修飾的微囊泡藥物裝載效率低，現(xiàn)有的裝載方法[82]有待優(yōu)化創(chuàng)新，建立標準化的微囊泡分離純化方法及開發(fā)臨床級微囊泡制備方法也是未來微囊泡研究的重難點；微囊泡在外周血中清除速率較快也是限制其應用的一大因素[87]，且微囊泡在部分疾病的作用研究依舊停留在動物實驗階段[88]。未來攻克的關鍵就在于如何提高性質穩(wěn)定的微囊泡的提取效率、拓寬微囊泡的來源并加快微囊泡應用于臨床的腳步，從而為患者提供更加精準安全的治療方案，使微囊泡成為療效更好、治療范圍更廣的藥物載體。

總之，真正將微囊泡應用于臨床還面臨著諸多挑戰(zhàn)和困難，但其本身具有合成類藥物載體無可比擬的優(yōu)勢，這決定了只要攻克其應用的限制因素，微囊泡必然會在生物醫(yī)藥學領域大放光彩，成為一項全新、先進、高效的遞藥和治療手段。