劉澤清，宋秀蘭

(太原理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太原 030600)

聚羥基脂肪酸酯(PHA)作為一種生態(tài)塑料，具有與傳統(tǒng)石油基塑料相似的物化特征，同時(shí)易被微生物降解[1]，可作為傳統(tǒng)塑料的替代品。PHA具有優(yōu)越的熱加工性、生物降解性和生物相容性，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)設(shè)備、電子、建筑、汽車、包裝和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[2]。

PHA是一種微生物聚酯，在許多原核生物中以胞內(nèi)顆粒的形式積累[3]，主要用作貯藏材料應(yīng)對(duì)外部碳源不足。這些微生物在碳源充足但營養(yǎng)條件受到限制的條件下(如氮限制、磷限制、溶解氧限制等)合成PHA。2021年3月，我國明確把碳中和納入生態(tài)文明建設(shè)整體布局，而PHA的生產(chǎn)有利于實(shí)現(xiàn)碳中和的目標(biāo)。為了降低成本，企業(yè)通常選擇廢棄物(如油脂、甘油、木質(zhì)纖維素、糖蜜等)直接或發(fā)酵作為碳源，這一過程既可以實(shí)現(xiàn)廢物利用，又可以減少甲烷的排放。然后，利用篩選出的產(chǎn)PHA細(xì)菌攝取碳源合成PHA；最后提純富集出PHA。而PHA生產(chǎn)成本至少是傳統(tǒng)塑料如聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)或聚乳酸(PLA)的3倍[4]，故推動(dòng)PHA的深入研究刻不容緩，這對(duì)構(gòu)建環(huán)境友好型社會(huì)有重要意義。

1 聚羥基脂肪酸酯(PHA)的特征

PHA主要由單體羥基脂肪酸(HA)聚合而成[5]，根據(jù)其單體中碳原子的數(shù)目，可分為短鏈PHA(Scl-PHA)、中鏈PHA(Mcl-PHA)和長鏈PHA(Lcl-PHA)。短鏈PHA的單體有3～5個(gè)碳原子，包括3-羥基丁酸鹽(3HB)和3-羥基戊酸鹽(3HV)等；中鏈PHA的單體有6～14個(gè)碳原子，包括3-羥基辛酸鹽(3HO)、3-羥基壬酸鹽(3HN)和3-羥基己酸鹽(3HHx)等；長鏈PHA的單體則具有15個(gè)以上的碳原子。短鏈PHA具有較好的晶體力學(xué)性能，但脆性大。中鏈PHA在零下也不會(huì)變脆，可作為優(yōu)異的彈性材料和生物橡膠，但其熔化溫度大多接近室溫[6]。根據(jù)PHA的單體是否均一，可將PHA分為均聚物和共聚物[7]。對(duì)于當(dāng)前已知的PHA聚合物，只有PHB和PHV屬于均聚物，其他均屬于共聚物，如3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯共聚物(PHBV)。研究表明，與均聚物相比，共聚物表現(xiàn)出更優(yōu)異的性能[8]，故當(dāng)前共聚物的研究受到越來越多的關(guān)注。

生物體內(nèi)積累的PHA顆粒，稱為碳小體[9]，一般呈現(xiàn)出高度折疊的顆粒形狀，由PHA(97.7%)、蛋白質(zhì)(1.8%)和磷脂(0.5%)組成[10]。PHA顆粒由兩層物質(zhì)組成，內(nèi)層是疏水性的聚酯核，外層是親水親脂的兩親層，兩親層為內(nèi)層疏水性聚酯核在水性細(xì)胞質(zhì)環(huán)境中提供增溶作用[11]。PHA顆粒的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 PHA顆粒的結(jié)構(gòu)[11]Fig.1 Structure of PHA particles

2 有機(jī)廢料合成PHA

總體來說，有三種方式可以合成PHA：酶催化、轉(zhuǎn)基因植物合成和微生物發(fā)酵[12]。工業(yè)生產(chǎn)PHA主要是應(yīng)用天然或者基因重組菌株進(jìn)行生產(chǎn)，其優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)品純度高，提純便利，但需要?jiǎng)?chuàng)建一個(gè)單一菌種環(huán)境，而這一過程造價(jià)昂貴且難以控制[1]。由此，混菌生產(chǎn)PHA工藝進(jìn)入了研究者的視野。微生物生產(chǎn)PHA成本的50%來源于菌種的碳源[13]，碳源還影響細(xì)胞生長、細(xì)胞代謝的潛能以及聚合物的產(chǎn)量、產(chǎn)率、分子量、品質(zhì)和組成[14]。碳源的選擇被視為PHA商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的主要影響參數(shù)和瓶頸。

2.1 剩余污泥發(fā)酵液作為碳源

污水處理廠每天都會(huì)產(chǎn)生大量剩余活性污泥——作為污水凈化的副產(chǎn)物，而剩余污泥中含有碳水化合物、蛋白質(zhì)等有機(jī)物。如果能將剩余污泥資源化利用，不光可以降低污水廠處理成本，還能促進(jìn)廢物回收。剩余污泥發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生大量揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，這些VFA可以用作合成PHA的碳源。通常，剩余污泥應(yīng)用于混菌三段式PHA生產(chǎn)工藝，見圖2。除了VFA外，污泥發(fā)酵液中還有一部分非VFA物質(zhì)——溶解性有機(jī)物(DOM，包括碳水化合物和蛋白質(zhì))和營養(yǎng)元素(包括氮和磷)。細(xì)菌對(duì)DOM攝取速度低于VFA，同時(shí)，過量的DOM會(huì)抑制產(chǎn)PHA細(xì)菌的富集和PHA的合成，但DOM也可以作為碳源合成PHA，且能夠促進(jìn)污泥的穩(wěn)定[15]，因此發(fā)酵液中DOM需要達(dá)到一個(gè)平衡濃度。污泥發(fā)酵液中過量的氮、磷則會(huì)破壞PHA的生產(chǎn)條件，有研究發(fā)現(xiàn)[16]，當(dāng)磷濃度從 127.60 mg/L 限制到 1.35 mg/L 時(shí)，胞內(nèi)PHA質(zhì)量含量從23%增加到51%，表明較低的磷濃度將促進(jìn)PHA積累。高磷濃度有利于蛋白質(zhì)合成，而降低磷濃度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成減少，從而增加PHA的產(chǎn)量。污泥與生活廢物共發(fā)酵液比單獨(dú)污泥發(fā)酵液產(chǎn)生更多的VFA，能夠有效降低DOM比例，Valentino等[17]在中試規(guī)模上將城市固體廢物與污泥共發(fā)酵(市政廢物體積占比30%～35%，污泥體積占比70%～75%，42 ℃)，得到的發(fā)酵液VFA占SCOD為(75±9)%，SCOD/N/P為100/4.4/0.5。在分批試驗(yàn)中，混菌能夠積累高達(dá)46%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的PHA。污泥堿性發(fā)酵同樣可以改善發(fā)酵液性能，Liu等[18]在pH 10條件下發(fā)酵污泥，得到的發(fā)酵液VFA占比達(dá)到(61.8±3.1)%，在添加少量氮磷情況下進(jìn)行PHA積累試驗(yàn)，PHA含量達(dá)細(xì)胞干重60.3%，回收的多聚物中單體比例(按質(zhì)量計(jì))為98.3% HB和1.7% HV。此外，發(fā)酵液中VFA成分(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸)比例也會(huì)影響PHA的產(chǎn)率和單體組成，進(jìn)而影響PHA的性能。一般認(rèn)為，偶數(shù)碳VFA用來生產(chǎn)HB單體，而奇數(shù)碳VFA用來生產(chǎn)HV單體[19]。而HV單體的加入可以改善PHA性能，如降低熔點(diǎn)和提高延展性。HAO等[20]發(fā)現(xiàn)戊酸占VFA比例52.05%的發(fā)酵液可以用來生產(chǎn)HV和3-羥基-2-甲基戊酸鹽(3H2MV)單體占比更高的PHA多聚物，且產(chǎn)PHA細(xì)菌富集反應(yīng)器中，PHA最大含量為42.31%，HB、HV、3H2MV占比達(dá)到68.4，23.7，7.9 mmol C%?，F(xiàn)在的研究大多在發(fā)酵液使用前除氮、磷，并在PHA合成達(dá)到最高時(shí)(碳充盈階段結(jié)束)排放掉上清液以排除溶解性有機(jī)物的影響，但這不可避免地增加了工藝的成本與復(fù)雜性。未來的研究可著眼于調(diào)整發(fā)酵策略，如調(diào)整pH或投加藥劑，降低發(fā)酵液中非VFA物質(zhì)比例，改變VFA成分占比，并且有必要確定發(fā)酵液中非VFA物質(zhì)水解機(jī)制。

圖2 混菌三段式合成PHA工藝Fig.2 Mixed bacteria three-stage synthesis of PHA process

2.2 廢棄油脂作為碳源

油脂相比其他傳統(tǒng)碳源(如葡萄糖等)具有價(jià)格低廉和PHA產(chǎn)量高的優(yōu)勢[12]。中國社會(huì)每年產(chǎn)生廢油脂超過1 000萬t。當(dāng)下，純菌利用廢棄植物油或廢棄動(dòng)物脂肪作為碳源合成PHA的研究較多。油在煎炸的過程中會(huì)經(jīng)歷許多化學(xué)反應(yīng)，例如在較高溫度下水解、熱氧化和聚合，因此不需要任何預(yù)處理就可以用于PHA生產(chǎn)[21]。有研究表明[13]，將 0.1%(v/v)吐溫80(Tween-80)表面活性劑添加到1%(v/v)廢棄食用油(植物油)可提高菌株細(xì)胞干重，副球菌(Paracoccus) LL1菌株可在96 h內(nèi)生產(chǎn)1.0 mg/L的PHBV共聚物，同時(shí)合成0.89 mg/L的類胡蘿卜素副產(chǎn)品，緩解了PHA生產(chǎn)成本壓力。但是，很多產(chǎn)PHA細(xì)菌無法直接攝取動(dòng)物脂肪。對(duì)于這個(gè)問題，Romanelli等[22]將斯圖茲里假單胞菌(Pseudomonasstutzeri) BT3菌株的lipC和lipH基因共表達(dá)到嗜酸菌(Delftiaacidovorans) DSM39菌株上，重組菌株可直接攝取動(dòng)物屠宰場豬油脂合成PHA。合成的多聚物細(xì)胞干重占比達(dá)到43%。Riedel等[23]則在野生型Ralstoniaeutropha菌株基礎(chǔ)上進(jìn)行基因改造。原菌株在脂肪底物中產(chǎn)生每細(xì)胞干重79%～82%(w/w)的PHB，而重組細(xì)菌可以合成聚(羥基丁酸酯-羥基己酸酯)[P(HB-co-HHx)]，其產(chǎn)量達(dá)到每細(xì)胞干重的45%～72%，HHx含量達(dá)到16%～27%。這種共聚物比均聚物PHB性能優(yōu)異，更適合于商業(yè)生產(chǎn)。

混菌利用廢棄油脂可以應(yīng)用三階段工藝合成PHA。油脂用作碳源的優(yōu)勢在于不需要第一階段的發(fā)酵單元，油脂可在第二階段(產(chǎn)PHA菌富集)和第三階段(PHA合成)水解。Ghosh等[24]研究表明，來自煉油廠的活性污泥有利用含油廢水合成PHA的能力。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在碳充盈階段微生物積累40%～70%的PHA，而在碳匱乏階段PHA用于微生物的代謝，最終PHA的合成率在0.38～0.89 mg PHA/mg COD 之間。也有研究發(fā)現(xiàn)，與純菌合成PHA類似，混菌不光可以利用油脂生產(chǎn)PHA，還可以同時(shí)生產(chǎn)增值產(chǎn)品，如三酰甘油(TAG)。Argiz等[25]利用罐頭工業(yè)生產(chǎn)的殘余油為碳源生產(chǎn)PHA和TAG。試驗(yàn)在序批式反應(yīng)器(SBR)中進(jìn)行產(chǎn)PHA菌的富集，在分批補(bǔ)料反應(yīng)器(FBR)進(jìn)行聚合物的合成。在分批補(bǔ)料應(yīng)器中，將碳源和氮源分批供給，即只在碳匱乏階段供給氮源，使PHA最大產(chǎn)量達(dá)到細(xì)胞干重82.3%。該研究證明了混菌也可以具有利用油脂合成PHA并同時(shí)生產(chǎn)另外一種增值產(chǎn)品的潛力。但油脂作為混菌碳源的弱勢在于微生物攝取速率低，由此產(chǎn)PHA菌的富集時(shí)間被延長，Ghosh等[24]的好氧顆粒反應(yīng)器(AGR)在42 d才開始穩(wěn)定，而Argiz等[25]的SBR反應(yīng)器在50 d才達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，不利于工業(yè)化應(yīng)用。油脂，尤其是具有飽和碳鏈的長鏈脂肪酸，作為碳源時(shí)的微生物攝取率不如其他底物，而且PHA產(chǎn)率較低。在今后的研究中可以向油脂中添加活性劑或者通過厭氧消化、酯交換法等預(yù)處理技術(shù)提高油脂的微生物利用率，進(jìn)而提高PHA的產(chǎn)率。

2.3 柴油煉制廢物(甘油)作為碳源

在全球范圍內(nèi)，大量粗甘油作為柴油產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)品被生產(chǎn)出來，粗甘油中含有62%～90%的甘油[26]。由于碳結(jié)構(gòu)較少，甘油被認(rèn)為是PHA合成的有效碳源。而且，甘油作為碳源合成PHA也可以彌補(bǔ)柴油生產(chǎn)過程的成本問題。有研究表明[27]，副球菌LL1菌株在添加2%甘油的礦物培養(yǎng)基中，96 h合成了3.77 g/L PHA，同時(shí)產(chǎn)生3.6 mg/L類胡蘿卜素。而且，通過副球菌LL1的細(xì)胞保留培養(yǎng)，總細(xì)胞干重增加了2.2倍，最大細(xì)胞干重(24.2 g/L)下PHA含量達(dá)到39.3%(w/w)，并提高了總類胡蘿卜素的產(chǎn)量。然而，在粗甘油中有許多其他的化學(xué)成分，包括生物柴油殘?jiān)?、皂類、甲醇等[12]，這給直接生物合成PHA造成困難。而貪銅菌(Cupriavidusnecator)DSM545菌株可直接利用生物柴油中的粗甘油生產(chǎn)短鏈PHA的共聚物聚(3-羥基丁酸酯-4-羥基丁酸酯)[P(3HB-co-4HB)]。通過控制溶解氧和培養(yǎng)時(shí)間，可獲得4HB摩爾分?jǐn)?shù)在11.4%～21.5%之間的共聚物[28]。Gosh等[24]則利用從煉油廠分離出來微球菌(Micrococcusaloeverae)SG002菌株，用以柴油為基礎(chǔ)的含油廢水，在好氧顆粒反應(yīng)器(AGR)中進(jìn)行PHA的合成。經(jīng)過21 d的培養(yǎng)，菌株達(dá)到 (81.40±0.2)% 的碳?xì)浠衔锶コ?，PHA積累最大達(dá)到(0.47±0.01)mg PHA/mg CDW。對(duì)于粗甘油的利用，其最大阻力在于甲醇，它是細(xì)菌活動(dòng)的抑制劑，可通過蒸發(fā)或相分離方法去除，但會(huì)增加成本；此外可考慮粗甘油與其他碳源共基質(zhì)，以提高PHA產(chǎn)率。

2.4 木質(zhì)纖維素及其衍生物作為碳源

木質(zhì)纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，許多種類的假單胞菌(Pseudomonas)都能攝取木質(zhì)素[7]。假單胞菌可以分泌木質(zhì)素降解酶(如漆酶和過氧化物酶)用于木質(zhì)素解聚[29]。Unrean等[30]以堿性預(yù)處理甘蔗渣發(fā)酵液為碳源，對(duì)蒙氏假單胞菌(Pseudomonasmonteilii)生產(chǎn)PHA的工藝進(jìn)行了優(yōu)化。在最優(yōu)投料條件下(碳氮比為0.18 g木質(zhì)素∶1 mg NH4Cl)，實(shí)驗(yàn)獲得238 mg/L的PHA聚合物，相當(dāng)于細(xì)胞干重(DCW)13%。Wang等[31]在基因水平上對(duì)惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida) A514菌株進(jìn)行改造。該菌株以木質(zhì)素衍生物香草醛酸為碳源，PHA產(chǎn)量達(dá)到246 mg/L，為細(xì)胞干重34.5%(w/w)。同時(shí)，木質(zhì)素衍生物還可以與其他碳源聯(lián)用作為細(xì)菌底物，以達(dá)到優(yōu)化PHA結(jié)構(gòu)及產(chǎn)量的效果。Xu等[32]將木質(zhì)素衍生物(苯甲酸鹽、香草醛和香草醛酸)和甘油共進(jìn)料，作為惡臭假單胞菌KT2440菌株的碳源。與單獨(dú)投喂甘油相比，共基質(zhì)下菌株細(xì)胞干重最大增加16.1%，PHA含量最大增加63.2%。而且，在甘油中添加木質(zhì)素衍生物可使長鏈單體(C10和C12)的分布減少0.4%～4.4%，短鏈單體(C6和C8)的分布增加0.8%～3.5%。木質(zhì)纖維素材料的緊密結(jié)構(gòu)阻礙了碳水化合物的酶水解，因此，直接利用木質(zhì)素前需要經(jīng)過一系列預(yù)處理。木質(zhì)纖維素常見的預(yù)處理方法包括蒸汽爆破處理、熱處理、酸處理、堿處理、有機(jī)溶劑處理等[33]。Sawant等[34]利用里氏木霉和黑曲霉共培養(yǎng)制備的纖維素酶將玉米秸稈水解為粗糖。然后副球菌LL1菌株利用40 g/L的玉米秸稈發(fā)解液為碳源，PHA產(chǎn)量達(dá)到9.71 g/L。當(dāng)前關(guān)于木質(zhì)纖維素合成PHA的大部分研究都是利用其發(fā)酵液為碳源，而在此基礎(chǔ)上開發(fā)能夠降解木質(zhì)素并產(chǎn)生PHA的微生物菌株，將是有效提高木質(zhì)素轉(zhuǎn)化率的可行性選擇。

2.5 制糖業(yè)廢料(糖蜜)作為碳源

糖蜜是制糖產(chǎn)業(yè)的主要副產(chǎn)物，是一種粘稠、黑褐色、呈半流動(dòng)狀態(tài)的物質(zhì)。糖蜜作為生產(chǎn)PHA的碳源也得到了廣泛的研究。Akaraonye等[35]用甘蔗糖蜜作為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus) SPV菌株的碳源生產(chǎn)PHB。在1 L搖瓶試驗(yàn)中獲得的PHB達(dá)到細(xì)胞干重61.07%，在2 L發(fā)酵罐研究中獲得的PHB 達(dá)到細(xì)胞干重的51.37%。而Cui等[36]通過使用合成糖蜜廢水培養(yǎng)地中海富鹽菌(Haloferaxmediterranei)，研究報(bào)告了溫度對(duì)細(xì)菌合成PHA過程的影響。確定高溫有利于提高地中海富鹽菌的PHA產(chǎn)量。最近，研究者將糖蜜和其他碳源聯(lián)用，達(dá)到合成PHA共聚物的效果。從棗樹中獲得的可再生資源——棗子籽油和棗子糖蜜可以用作貪銅菌的碳源，以生產(chǎn)P(3HB-co-3HHx) 共聚物。同時(shí)，通過改變供給細(xì)菌共基質(zhì)的數(shù)量比例可以選擇性地調(diào)節(jié)共聚物中3HHx和3HB單體的摩爾分?jǐn)?shù)[37]。盡管糖蜜作為純菌碳源時(shí)產(chǎn)量較高，但從黏稠底物中提取PHA仍然存在困難，針對(duì)不同的產(chǎn)PHA菌種，提出不同的提取方案仍是比較關(guān)鍵的。

糖蜜同樣被應(yīng)用于混菌合成PHA，研究內(nèi)容集中在微生物群落的結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)力。有研究表明[38]，以糖蜜發(fā)酵液作為碳源，在PHA的合成階段控制pH為8比不控制pH的生物量提高1倍，從而使PHA產(chǎn)率提高了1倍。Carvalho等[39]以糖蜜發(fā)酵液為底物，探究了微生物組成與PHA生產(chǎn)性能的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，攝取發(fā)酵糖蜜的產(chǎn)PHA菌群主要由固氮弓菌(Azoarcus)、陶厄氏菌(Thauera)和副球菌組成，前兩種菌群的豐度最高。以固氮弓菌富集為主要組分，陶厄氏菌為次要組分的混合微生物可產(chǎn)生高HV含量的聚合物，這可能會(huì)改善PHA的機(jī)械性能。糖蜜發(fā)酵液濃度對(duì)混合菌群合成PHA也存在影響，研究表明[40]，在進(jìn)水糖蜜發(fā)酵液濃度為 45 Cmmol VFA/L時(shí)，微生物顯示出最佳PHA儲(chǔ)存能力。在這種培養(yǎng)條件下產(chǎn)PHA菌生長旺盛，PHA含量最高可達(dá)細(xì)胞干重74.6%。為了更加有效地利用糖蜜，需要消除糖蜜中抑制微生物生長的污染物，如酚類和無機(jī)鹽。糖蜜在發(fā)酵前使用各種膜濾技術(shù)有可能去除部分污染物，而這有待于更加深入的研究。

表1 各種有機(jī)廢料作為碳源生產(chǎn)PHA實(shí)例Table 1 Examples of PHA production from organic wastes as a carbon source

3 PHA的提取工藝

在PHA積累階段完成后，一般通過離心、過濾或沉淀將生物量從基質(zhì)中分離出來，下一階段需要從生物量中提取PHA。生物量中影響PHA純度的雜質(zhì)統(tǒng)稱為非PHA細(xì)胞物，包括多肽、磷脂、DNA、RNA和肽聚糖等[1]。混菌比純菌培養(yǎng)的細(xì)胞更耐水解，故從混菌細(xì)胞中提取PHA通常需要預(yù)處理，而在純菌培養(yǎng)條件下無需任何預(yù)處理可以直接提取[41]。

PHA的提取有兩種方式：第一種方式依賴溶劑打破細(xì)胞膜并溶解PHA顆粒，這一般是通過加入二氯甲烷或氯仿等物質(zhì)實(shí)現(xiàn)[42]；第二種方式旨在消化和溶解細(xì)胞內(nèi)的非PHA物質(zhì)，使PHA成為不溶性固體。這種消化過程可以是生物的(例如酶)或化學(xué)的[43]。第二種方式的優(yōu)點(diǎn)在于減少試劑投入量從而降低試劑成本。近些年，還有研究者用動(dòng)物提取PHA，這種提取方式獲取的PHA更接近自然形態(tài)。

3.1 從生物質(zhì)中直接提取PHA

使用溶劑直接從生物質(zhì)中萃取PHA在提取工藝中應(yīng)用最為廣泛，可回收高純度PHA[44]。溶劑的作用是改變細(xì)胞膜的通透性，并使PHA溶解[1]。在大多數(shù)情況下，無論選取哪種萃取劑，在從富含PHA的生物質(zhì)中提取PHA之前都需要對(duì)生物質(zhì)進(jìn)行冷凍干燥處理，因?yàn)樯镔|(zhì)中水分的殘留會(huì)降低提取效率。相比加熱干燥，凍干不會(huì)導(dǎo)致聚酯鏈的斷裂[45]，但冷凍干燥設(shè)備工藝復(fù)雜，在工業(yè)應(yīng)用中會(huì)花費(fèi)巨大的成本。

大量鹵化溶劑，如氯仿和二氯甲烷，被廣泛用于PHA的萃取過程。通過鹵化溶劑萃取，可以高效地獲得高純度的多聚物，并且可忽略少量多聚物的降解。然而，這種萃取方式并不環(huán)保，尤其是氯化溶劑，對(duì)環(huán)境和工作人員會(huì)造成危害。此外，該過程需要大量的溶劑，溶劑加入量高達(dá)生物量的20倍[46]。針對(duì)鹵化試劑的缺點(diǎn)，研究者將目光轉(zhuǎn)向非鹵化溶劑。研究表明[19]，碳酸二甲酯(DMC)可用作PHA提取的溶劑，1-丁醇用于PHA的沉淀純化。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)每100 g生物量的PHA提取量為(30.7±1.6)g，PHA總純度達(dá)到(98.0±0.1)%。通常，非鹵化溶劑能夠很好地溶解中等鏈長PHA。Bartels等[44]用丙酮對(duì)生物質(zhì)中的P(HB-co-HHx)進(jìn)行兩階段的萃取，并用2-丙醇進(jìn)行純化沉淀，最終從細(xì)胞中提取高達(dá)98%～99%的多聚物。非鹵化溶劑的使用有助于降低PHA的生產(chǎn)成本，并形成一個(gè)更加生態(tài)化的過程，這都有助于PHA的商業(yè)化進(jìn)程。

3.2 破壞細(xì)胞內(nèi)非PHA物質(zhì)間接提取PHA

PHA通常被細(xì)胞中非PHA物質(zhì)包被，次氯酸鈉、表面活性劑、酸堿化合物可用于溶解這些非PHA物質(zhì)。另外，這些試劑均可以在水中使用，與溶劑萃取相比，不需要干燥生物質(zhì)，可極大地降低成本[1]。Colombo等[47]使用非離子表面活性劑吐溫-20(Tween-20)對(duì)生物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，然后使用碳酸二甲酯提取PHA，PHA提取效率可達(dá)50%，與使用氯仿獲得的提取效率(63%)非常接近。此外，將兩種預(yù)處理試劑聯(lián)用也可以達(dá)到不錯(cuò)的效果。Mannina等[41]先用次氯酸鈉處理生物質(zhì)，然后用月桂酸銨消化細(xì)胞內(nèi)非PHA物質(zhì)(月桂酸銨與生物量質(zhì)量比為2∶1)，接觸反應(yīng)3 h，獲得PHA回收率和純度分別為(74±8)%和(100±5)%。一般來說，化學(xué)消化最大的缺點(diǎn)在于PHA降解，且化學(xué)消化過程會(huì)產(chǎn)生大量廢水。因此，有研究[42]提出用稀氨水消化細(xì)胞內(nèi)非PHA物質(zhì)，結(jié)果證明稀氨水在75～115 ℃ 的溫度下對(duì)生物質(zhì)進(jìn)行處理，可獲得近90%的PHA回收率和90%以上的純度。該研究為提取工藝優(yōu)化提供了一個(gè)有價(jià)值的方向。

蛋白酶、磷脂酶、溶菌酶和核酸酶等酶可水解細(xì)胞內(nèi)非PHA細(xì)胞物[1]，且由于酶對(duì)催化反應(yīng)的高度特異性，不會(huì)導(dǎo)致PHA大量降解。Lakshman等[48]使用來自小雙孢菌屬(Microbispor)的裂解酶對(duì)含有50% PHA的草木犀中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)進(jìn)行酶消化，實(shí)現(xiàn)了94%的PHA回收率和92%的PHA純度。雖然酶消化是一種環(huán)境友好的方法，但是因?yàn)槠涔に嚨膹?fù)雜性，在工業(yè)還難以應(yīng)用。

此外，有研究者發(fā)現(xiàn)可利用生物體回收PHA。有些動(dòng)物的消化系統(tǒng)能夠攝取細(xì)菌細(xì)胞，但不能同化PHA顆粒，最后將其以糞便的形式排出，從而導(dǎo)致PHA回收和純化。通過這種生物回收方法回收的PHA接近其在細(xì)胞中的固有形態(tài)，即以顆粒形式存在。Murugan等[49]發(fā)現(xiàn)粉虱可以吃掉冷凍干燥的貪銅菌細(xì)胞，然后以白色糞便的形式排出PHA顆粒。經(jīng)過洗滌、加熱進(jìn)一步純化后，PHA顆粒純度幾乎達(dá)到100%?？赡芷渌ハx在PHA顆?；厥辗矫娓佑行?，而這需要進(jìn)一步的探索，使用生物的方法回收PHA可以最大限度減少化學(xué)試劑的使用。

表2 各種方法提取PHA實(shí)例Table 2 Examples of PHA extraction methods

4 結(jié)束語

PHA以優(yōu)異的生物降解性能，有望成為傳統(tǒng)石油基塑料的替代品，卻因?yàn)楦哳~的成本無法得到大規(guī)模的推廣。近些年，大部分研究對(duì)PHA生產(chǎn)的碳源選擇和提取方式進(jìn)行了優(yōu)化，試圖找到生產(chǎn)成本最低且產(chǎn)品性能最優(yōu)的工藝。

(1) 開發(fā)用于PHA生產(chǎn)的有機(jī)廢料具有雙重好處，該過程不但能解決環(huán)境中廢物處理問題，且更具可持續(xù)性和成本效益。不過，微生物對(duì)廢料的利用率仍然較低，而這可以在往后的研究中通過對(duì)原料適當(dāng)預(yù)處理、優(yōu)化操作參數(shù)以及利用基因工程來克服。

(2) 不同的PHA提純方式在成本要求、分離產(chǎn)率、產(chǎn)品純度方面以及生物對(duì)PHA產(chǎn)品的適用性方面存在很大差異。在這種情況下，必須確定該提純是否符合所設(shè)想的生物聚合物最終應(yīng)用的要求。

(3) 當(dāng)前的研究大多還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，缺少中試規(guī)模，更缺乏產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前的可行性研究。目前商業(yè)方面的PHA生產(chǎn)多為純菌生產(chǎn)，而成本相對(duì)較低的混菌生產(chǎn)方式有待進(jìn)一步推廣。未來可著眼于混菌生產(chǎn)PHA的研究，并應(yīng)用環(huán)保且成本較低的PHA提純方式，致力于碳中和的社會(huì)目標(biāo)。